藍藻水華暴發(fā)期間產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻豐度空間分布研究

藍藻水華暴發(fā)期間產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻豐度空間分布研究

富營養(yǎng)化湖泊中的藻類藍藻的頻繁發(fā)生及其造成的災害是世界上最常見的水環(huán)境問題之一。藍藻水華產(chǎn)生的微囊藻素及其衍生物直接導致水生動植物的死亡，并對人類健康和生活提出嚴重危害。微藻屬于藍藻水華中最常見的優(yōu)勢種群之一。根據(jù)許多研究，湖泊微藻水華群是由微藻和非微藻組成的“混合群落”。微藻微囊藻群落的豐度動態(tài)變化及其總微囊藻群落的比例受多種環(huán)境的影響。在不同的湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，微囊藻微囊藻的時空變化特征是空間變化的特征[3.5]。微囊藻微囊的豐度直接決定了微囊藻水華的毒性，微囊藻的最佳評價濃度在一些湖泊中是評價微囊藻素濃度變化的最佳指標。因此，對微囊藻微囊素群落的定量化研究具有重要意義。一般是利用顯微觀察法對水體中微囊藻細胞密度進行研究,產(chǎn)毒微囊藻和非產(chǎn)毒微囊藻細胞形態(tài)相似,利用顯微觀察法無法將產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒微囊藻細胞區(qū)分開來.產(chǎn)毒微囊藻細胞基因組中含有微囊藻毒素合成基因家族(Microcystinsynthetasegenecluster,mcy),對微囊藻毒素產(chǎn)生進行調(diào)控.該基因家族成員組織結構和序列特征已經(jīng)非常清楚,為利用PCR擴增檢測產(chǎn)毒微囊藻奠定了基礎[7~9].特異性擴增微囊藻毒素合成基因家族普通PCR檢測可以對藍藻水華是否產(chǎn)毒做出判斷,但是無法準確獲得產(chǎn)毒微囊藻細胞密度.熒光定量PCR利用特異性引物,能夠對樣品中的目標生物進行定量化研究,具有靈敏度高、重復性好、能夠同時處理大批量樣品等優(yōu)勢,近年來在藍藻水華的研究中已經(jīng)廣泛應用[10~12].1材料和方法1.1水質特征和采樣點根據(jù)太湖富營養(yǎng)化水平和藍藻分布情況,在太湖設置7個采樣點.分別位于梅梁灣(N2)、竺山灣(N5)、貢湖灣(N4)、湖心(S4)、西太湖(W4)、南太湖(S2)和梅梁灣口(S5).根據(jù)巢湖富營養(yǎng)化水平,在巢湖也設置7個采樣點,從西巢湖到東巢湖分別編號為1、2、3、4、5、6和7,其中1、2和3號采樣點位于西巢湖,4號采樣點位于湖心,5、6和7號采樣點位于東巢湖.采樣點的分布如圖1所示.太湖和巢湖均屬于長江水系.太湖地處北緯30°56′~31°34′和東經(jīng)119°53′~120°34′之間,面積2338.11km2,平均水深2m左右,是我國第三大淡水湖泊.巢湖位于安徽省中部,處于長江、淮河兩河流之間,湖體位于117°16′~117°51′E,30°25′~31°43′N之間,面積約為780km2,是我國第五大淡水湖泊.太湖和巢湖均是典型的淺水富營養(yǎng)湖泊,自從20世紀80年代以來,夏季藍藻(主要是微囊藻Microsystisspp.)水華頻繁發(fā)生,嚴重影響了經(jīng)濟和社會的發(fā)展.微囊藻是太湖和巢湖夏季藍藻水華的優(yōu)勢種群,其生物量占藻類生物量的90%以上[15~16].到目前為止,尚未見有關藍藻水華暴發(fā)期間太湖和巢湖產(chǎn)毒微囊藻種群豐度的報道.本研究利用熒光定量PCR技術,從大的空間尺度上分析太湖和巢湖藍藻水華暴發(fā)期間產(chǎn)毒微囊藻和非產(chǎn)毒微囊藻種群豐度的分布特征,以期為藍藻水華生態(tài)風險評估提供資料.2010年夏季(7月份)采集水樣,采樣期間太湖和巢湖都正暴發(fā)大規(guī)模的藍藻水華.用GPS定位系統(tǒng)對采樣點精確定位.用長度為2.5mPVC管采集整水柱,混合均勻,每個采樣點采集3個平行樣.所有水樣均在4h內(nèi)帶回實驗室做進一步處理.同時利用多功能水質參數(shù)儀YSI6600(YellowSpringInstruments,USA)測定采樣點水質參數(shù),主要包括水溫、溶解氧、電導率、pH和混濁度等.1.2溶解氮磷的測定GF/F玻璃纖維濾膜過濾50mL水樣,用Skalar(SkalarSanplusanalyzer荷蘭)自動漂流分析裝儀測定水體中溶解性氮磷,主要包括氨態(tài)氮、硝態(tài)氮、可溶性正磷酸鹽.水體中總氮、總磷(均未過濾)參照標準方法測定.1.3葉綠素a的提取GF/C濾膜過濾100mL水樣(根據(jù)生物量大小調(diào)整水樣體積),用90%丙酮提取濾膜葉綠素a,充分研磨后置于-4℃,黑暗條件下靜置12h,離心,取上清液,用90%的丙酮定容,用熒光分光光度計(RF-5301)測定,激發(fā)波長為350nm,發(fā)射波長670nm.1.4藻類基因組的提取GF/C濾膜過濾100mL水樣(根據(jù)微囊藻生物量大小調(diào)整水樣體積),濾膜置于-20℃保存.濾膜上藻類基因組提取按照文獻的方法進行.最后將基因組DNA溶于100μLTE溶液中,-20℃保存?zhèn)溆?1.5熒光定量pcr檢測利用室內(nèi)純培養(yǎng)產(chǎn)毒微囊藻Microcystisaeruginosa7806構建定量PCR標準曲線,該藻株由中國科學院典型培養(yǎng)物種淡水藻種庫(FACHB)提供.培養(yǎng)基為BG-11,培養(yǎng)溫度25℃,光照強度為40μmolm-2s-1,光照周期為12h/12h.將處于對數(shù)生長期的藻細胞過濾到GF/C濾膜上,按照文獻的方法提取基因DNA,最后用超純水溶DNA.BioPhotometerPlus(Effendorf)測定基因組DNA的濃度和純度(ABS260nm/ABS280nm).根據(jù)文獻方法計算基因組拷貝數(shù),將標準基因組DNA稀釋成一定梯度(共6個梯度),每個梯度3個平行.用微囊藻16SrDNA基因和產(chǎn)毒微囊藻mcyD基因的特異性引物進行定量PCR反應(表1).qPCR反應體系25μL,其中含有12.5μL2×SYBRpremixExTaqTM(TaKaRa),其中微囊藻16SrDNA引物濃度為4pmol,mcyD引物2.5pmol,1μL模板,用超純水將定量PCR體系補足25μL.熒光定量PCR反應過程如下:95℃2min,按95℃20s,55℃30s,72℃20s反應,共45個循環(huán),反應結束后進行溶解曲線(Meltingcurve)分析.整個過程在REALPLEX4熒光實時定量PCR儀(Effendorf公司)上進行.反應結束后將將定量PCR數(shù)據(jù)導入Excel表格進行分析,繪出標準曲線.2結果與分析2.1srdna和mcyd基因利用微囊藻產(chǎn)毒株MicrocystisaeruginosaPCC7806基因組DNA作為模板建立16SrDNA基因和mcyD基因定量PCR標準曲線,從圖2和圖3可以看出,循環(huán)閾值(Ct)和基因組拷貝數(shù)的對數(shù)值呈顯著線性關系.定量PCR反應中,基因組拷貝數(shù)動態(tài)范圍為1.57×101~1.57×107copies.16SrDNA序列定量PCR標準曲線方程為Y=-3.54X+43.01(R2=0.998),擴增效率e=0.92.mcyD基因定量PCR標準曲線方程為Y=-3.36X+42.81(R2=0.995),擴增效率e=0.98.溶解曲線結果顯示,16SrDNA和mcyDPCR擴增產(chǎn)物解鏈的峰值溫度分別為分別為88.92℃(變異系數(shù)CV=0.12%)和84.47℃(變異系數(shù)CV=0.11%).2.2太湖水生理化參數(shù)、a濃度和物種豐度2.2.1營養(yǎng)鹽濃度結果在采樣期間,水體平均溫度為26.6℃,水體呈偏堿性,溶解氧濃度為7.52~8.53mgL-1,混濁度為25.9~85.5.營養(yǎng)鹽濃度如表1所示,TN濃度為1.797~2.826mgL-1,平均濃度為2.529mgL-1.TP濃度為0.071~0.196mgL-1,平均濃度為0.115mgL-1.其中富營養(yǎng)化嚴重的梅梁灣(N2)和竺三灣(N5)營養(yǎng)鹽濃度相對較高,湖心(S4)和貢湖灣(N4)營養(yǎng)鹽濃度較低.2.2.2梅梁灣和全面6個月的葉綠素a濃度如圖4所示,太湖藍藻水華期間,葉綠素a濃度較高,并且不同湖區(qū)葉綠素a濃度差異顯著:富營養(yǎng)化水平較高的梅梁灣和竺三灣葉綠素a濃度較高,分別達到156.14μgL-1±10.11μgL-1和140.82μgL-1±4.85μgL-1,湖心(S4)和西太湖(W4)葉綠素a濃度相對較低,分別為23.80μgL-1±3.17μgL-1和13.91μgL-1±1.97μgL-1.2.2.3微囊藻16srdna基因型豐度和產(chǎn)毒微囊藻mcyd基因型豐度的比較熒光定量PCR結果(圖5)顯示,太湖微囊藻種群豐度及其基因型組成具有顯著的空間差異性:梅梁灣(N2)微囊藻16SrDNA基因型豐度和產(chǎn)毒微囊藻mcyD基因型豐度最高,湖心(S4)16SrDNA和mcyD基因型豐度最低.梅梁灣基因型豐度高出湖心1~2個數(shù)量級.產(chǎn)毒微囊藻mcyD基因型豐度占總微囊藻16SrDNA基因型豐度比值為為20.5%~38.1%,平均比值為28.5%.2.3巢湖水生理化參數(shù)、a濃度和物種豐度2.3.1營養(yǎng)鹽濃度采樣期間,巢湖平均水溫為29.8℃,水體呈堿性,6號采樣點pH最高.溶解氧濃度為7.45~9.31mgL-1.營養(yǎng)鹽濃度如表3所示,總氮濃度為1.612~3.955mgL-1,平均值為2.107mgL-1,總磷濃度為0.044~0.201mgL-1,平均值為0.097mgL-1,西巢湖(1、2和3號采樣點)營養(yǎng)鹽水平高于東巢湖(5、6和7號采樣點).2.3.2不同采樣點葉綠素a濃度a如圖6所示,巢湖藍藻水華期間,葉綠素a濃度較高,并且不同湖區(qū)葉綠素a濃度差異顯著:從西巢湖向東巢湖葉綠素a濃度呈下降趨勢,其中1號采樣點葉綠素a濃度最高,為206.90μgL-1±10.44μgL-1,5號采樣點葉綠素a濃度最低,為42.65μgL-1±4.38μgL-1.2.3.3品種和基因型豐度如圖7所示,巢湖不同湖區(qū)微囊藻16SrDNA基因型和產(chǎn)毒微囊藻mcyD基因型豐度分布.總的來說,巢湖西半湖區(qū)(1,2和3號采樣點)16SrDNA和mcyD基因型豐度高于巢湖東湖區(qū)(5、6和7號采樣點).產(chǎn)毒微囊藻mcyD基因型豐度占微囊藻16SrDNA基因型豐度比值波動較大,該比值在湖心的4號采樣點最低,為8.4%,而7號采樣點該比值最高,為96.6%,所有采樣點該比值的平均值為66.1%.3不同產(chǎn)毒微囊藻種群豐度的定量化研究太湖和巢湖均為我國長江中下游重要的大型淺水湖泊.隨著人類社會的快速發(fā)展,湖泊污染日益嚴重,大量的營養(yǎng)物質(氮、磷)輸入湖體,湖泊快速向富營養(yǎng)水平發(fā)展,導致夏季藍藻水華頻繁發(fā)生.根據(jù)孔繁翔等提出的長江中下游大型淺水湖泊藍藻水華形成的四階段理論,藍藻水華形成是藍藻生物量逐漸積累的過程,在適宜的溫度、光照、營養(yǎng)鹽和水文氣象條件下形成的.夏季藍藻水華爆發(fā)期間,太湖和巢湖水體中葉綠素a(Chl-a)濃度均超過10μgL-1,不同湖區(qū)分布間呈現(xiàn)出空間差異性:在太湖,污染嚴重的梅梁灣太湖梅梁灣(N2)和竺山灣(N5)葉綠素a濃度較高,分別為156.14μgL-1±5.11μgL-1和140.82μgL-1±2.66μgL-1,西太湖(W4)和湖心(S4)葉綠素a濃度較低,分別為13.97μgL-1±1.91μgL-1和23.80μgL-1±2.17μgL-1;巢湖葉綠素a濃度從西湖區(qū)到東湖區(qū)呈下降趨勢,與巢湖富營養(yǎng)化水西高東低的變化趨勢基本一致.這說明湖泊的富營養(yǎng)化水平與水華藍藻的生物量有一定的相關性,富營養(yǎng)化嚴重的湖區(qū)水華藍藻生物量高于低營養(yǎng)化水平的湖區(qū).這與Rinta-Kanto等的研究結果是一致的.Rinta-Kanto等通過對美國伊犁湖夏季水華藍藻連續(xù)3年的研究發(fā)現(xiàn),富營養(yǎng)化水平嚴重的西湖區(qū)葉綠素a濃度和藍藻16SrDNA基因型豐度高于東湖區(qū).同時,水華藍藻的空間分布會受到風場直接或間接作用的影響[22~23],但是藍藻遷移和藍藻原位生長對特定湖區(qū)藍藻的貢獻量的大小還需進一步研究.近年來,熒光定量PCR在夏季藍藻水華研究中應用廣泛.該技術能夠同時處理大批量樣品,對產(chǎn)毒微囊藻種群進行定量化研究,可以快速對藍藻水華毒性做出判斷,預測藍藻水華帶來的生態(tài)風險.本研究利用微囊藻毒素合成基因mcyD和16SrDNA構建定量PCR標準曲線,對太湖和巢湖產(chǎn)毒微囊藻種群和總微囊藻種群豐度進行定量化研究.從研究結果可以看出,太湖和巢湖不同湖區(qū)產(chǎn)毒微囊藻種群和總微囊藻種群豐度的分布具有空間差異性.對太湖而言,富營養(yǎng)化嚴重的梅梁灣和竺山灣產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度均較高,而湖心(S4)產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度較低;對巢湖而言,產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度從西湖區(qū)到東湖區(qū)呈下降趨勢.同時發(fā)現(xiàn),太湖和巢湖產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群豐度的比例在不同湖區(qū)有顯著差異:太湖湖心(S4)產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群比值最小,為20.5%,竺山灣最高,為38.1%,所有湖區(qū)的平均值為28.5%;巢湖湖心(4號采樣點)產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻總微囊藻種群的比例最低,為8.4%,7號采樣點最高,為96.6%,巢湖所有采樣點該比值的平均值為66.1%.可以看出,富營養(yǎng)化水平高的湖區(qū),產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻種群豐度也較高,說明營養(yǎng)鹽濃度升高有利于產(chǎn)毒微囊藻和非產(chǎn)毒微囊藻生長.Rinta-Kanto通過對伊犁湖研究后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒微囊藻和非產(chǎn)毒微囊藻種群豐度隨TP濃度升高而增加,并且種群豐度和總磷濃度具有顯著的正相關性.這和Vézie等人室內(nèi)的研究結果是一致的.本文的研究結果同時解釋了Shen等的研究結果,Shen等發(fā)現(xiàn)太湖藍藻水華期間富營養(yǎng)化水平高的湖區(qū)水華藍藻微囊藻毒素濃度也較高,與該湖區(qū)產(chǎn)毒微囊藻種群豐度高低有直接的關系.同時發(fā)現(xiàn),產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群的比例在太湖和巢湖有顯著的差異性:在太湖,所有湖區(qū)產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群豐度的比例低于50%,并且和采樣點的富營養(yǎng)化水平具有一致性,富營養(yǎng)化水平高的湖區(qū)產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群的比例也較高.而巢湖的產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群的比例波動較大:巢湖湖心(4號采樣點)該比值最低,其它采樣點該比值均較高,其中7號采樣點該比值為96.6%.已有的文獻報道,不同湖泊產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群豐度的比值波動范圍較大,該比值可以從0到100%.多種環(huán)境因子都能影響產(chǎn)毒微囊藻占總微囊藻種群的比例.Yoshida等研究了湖泊Mikata中產(chǎn)毒微囊藻和非產(chǎn)毒微囊藻種群動態(tài)隨時間變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮濃度與