ph對眼點擬微綠球藻生長的影響

ph對眼點擬微綠球藻生長的影響

n-3是重要的生物活性物質(zhì)，具有高的營養(yǎng)價值和多種保健功能。海洋微藻具有非常高的合成n-3長鏈多飽和脂肪酸的能力,日漸成為n-3長鏈多飽和脂肪酸的新來源。因此,有關(guān)利用微藻積累n-3長鏈多飽和脂肪酸的理論研究和開發(fā)應(yīng)用倍受人們關(guān)注。眼點擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟微藻,其脂肪酸組成簡單,富含EPA。目前,日本、澳大利亞等國家已實現(xiàn)了大規(guī)模養(yǎng)殖,國際市場供不應(yīng)求。研究者發(fā)現(xiàn)在富含氮、磷的培養(yǎng)基中,該藻EPA的含量可以達到總脂肪酸的35%;眼點擬微綠球藻的總脂含量在穩(wěn)定期含量最高,占干重的43.3%,在生長對數(shù)早期,EPA與總不飽和脂肪酸的比例最高,可達27.7%。而有關(guān)pH對該藻的影響規(guī)律少有報道。本文利用封閉式光合生物反應(yīng)器研究了pH對該藻的生長、總脂含量及脂肪酸組成的影響規(guī)律,為更好地進行生態(tài)調(diào)控,提高EPA的含量提供了依據(jù)。1材料和方法1.1opyta和真眼點綱藻種眼點擬微綠球藻屬于金藻門(Chrysophyta),真眼點綱(Eustigmatophyceae)。藻細胞直徑2~3μm。由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所提供。1.2nano3的磷源、終濃度實驗中所用培養(yǎng)基為Provasoli的加富培養(yǎng)基,氮源為NaNO3,磷源為NaH2PO4·2H2O,氮、磷的終濃度分別為0.924mmol/L、0.085mmol/L,N/P比為10.85(M/M)。培養(yǎng)基均用無菌海水配制。1.3在線檢測檢測參數(shù)實驗中所用密閉式BFC-2光合生物反應(yīng)器為煙臺高新區(qū)海洋生物工程研究所生產(chǎn)。反應(yīng)器罐體為柱狀,徑高比為1/3,實際體積為7L,工作體積為6L,培養(yǎng)過程中的各參數(shù)如溫度、pH、轉(zhuǎn)速、溶氧均能進行在線檢測。實驗前反應(yīng)器空罐滅菌,121℃,20min。1.4provaoli加富培養(yǎng)基實驗前離心收取藻液400~600ml,將藻泥接種至2L的玻璃三角瓶中,培養(yǎng)體積1L,培養(yǎng)基為無菌海水配制的Provasoli加富培養(yǎng)基,培養(yǎng)至對數(shù)期。所用玻璃器皿均為高壓蒸汽滅菌。1.5溫度和轉(zhuǎn)速以及光照強度a將活化至對數(shù)期后期的藻種按1∶5的接種量接種于光合生物反應(yīng)器中,起始OD680值為0.1左右。培養(yǎng)體積為6L,溫度為25±0.5℃,轉(zhuǎn)速為150r/min,光照強度為6400±200lx,光暗周期為12h∶12h。分批培養(yǎng)中每天取樣測定680nm下的OD值及營養(yǎng)鹽消耗情況。在不同的細胞時期收取藻液離心、洗滌,在離心收取藻泥后冷凍干燥,藻粉用于總脂和脂肪酸組成分析。實驗重復(fù)兩次,每次實驗至少兩個平行樣,結(jié)果為平均值。1.6分析與計算1.6.1細胞濃度根據(jù)回歸方程y(106cell/ml)=36.883×OD680-0.1076,R2=0.85;由測得的OD680值,計算細胞濃度。1.6.2培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽消耗1.6.3分光光度法測定藻體總脂占干重的百分比按Ahlgren1991年的分光光度法測定,由(1)式可得分光光度法的總脂含量,由(2)式換算成重量法結(jié)果?？傊?%干重,重量法)=6.7823×總脂(%干重,光度法)+0.19451.6.4脂肪酸分析及檢測按Lepage1984年的方法并進行了改進。在螺口試管中稱取15mg藻粉,加入1ml被KOH飽和的CH3OH溶液,迅速混勻,于75℃水浴中皂化、甲酯化10min,冷卻至室溫后加入約2ml1mol/LHCl-CH3OH溶液使pH≤2,振蕩1min,在75℃水浴酸化10min,冷卻至室溫,加入0.3ml石油醚及少許蒸餾水促進分層,充分振蕩,離心后取上層石油醚相進行色譜分析。脂肪酸分析采用美國HP5890II型氣相色譜儀,氫火焰離子化檢測器,SGEAC20毛細管珠(30m×0.25mm)。進樣后程序升溫:150℃保持1min,以15℃/min升至200℃,再以2℃/min升至250℃。高純氮為載氣,流速1.5ml/min,進樣量為1μl。以面積歸一化法得到各脂肪酸組分的相對百分含量。脂肪酸標(biāo)樣為Sigma公司產(chǎn)品。2結(jié)果2.1眼點擬微綠球藻的生長pH對眼點擬微綠球藻生長的影響見圖1。由圖1可見,在pH為6.8,8.5,9.8的條件下,眼點擬微綠球藻具有大致相同的生長速率。在對數(shù)初期,該藻在pH6.8的條件下具有較高的生長速率;在對數(shù)后期,在pH8.5,9.8的條件下,眼點擬微綠球藻生長較快且細胞密度較高。在pH6.2的條件下,眼點擬微綠球藻的生長受到抑制,而在pH5.5的條件下,生長受到嚴(yán)重抑制。由圖2,3可見,在pH5.5,6.2的條件下,眼點擬微綠球藻的營養(yǎng)鹽消耗受到抑制,因而其生長緩慢,尤其是在pH5.5的條件下,氮源濃度在整個細胞周期內(nèi)幾乎保持不變,磷源濃度在生長初期無變化,然后緩緩下降。在pH6.8,8.5,9.8條件下,眼點擬微綠球藻的氮源消耗速率基本相同,而磷源消耗速率有差別,在pH9.8的條件下,其消耗速率最快,其他條件下,消耗速率大致相同。2.2藻總脂含量的變化pH對眼點擬微綠球藻總脂含量的影響見圖4。除pH9.8以外,在所有pH條件下,在一個細胞周期內(nèi)眼點擬微綠球藻總脂含量的變化規(guī)律基本相同。即藻細胞的總脂含量在對數(shù)初期有所下降,然后逐漸上升,在穩(wěn)定期達到最大值。在pH9.2的條件下,總脂含量最高可達細胞干重的25.57%。在pH9.8的條件下,眼點擬微綠球藻的總脂含量明顯低于其他條件下的總脂含量,在穩(wěn)定期時總脂含量僅占生物量干重的10.55%。2.3材料的含量測定pH對眼點擬微綠球藻脂肪酸組成的影響見表1。由表1可見,16∶0,16∶1和20∶5是眼點擬微綠球藻脂肪酸組成的主要成分,三者占總脂肪酸的60%~70%。在不同pH條件下,在一個生長周期內(nèi)眼點擬微綠球藻脂肪酸組成的變化規(guī)律基本相同。在對數(shù)生長初期,16∶0與20∶5的含量比較穩(wěn)定,變化不大,而在對數(shù)后期16:0的含量明顯增加,最高可達脂肪酸組成的43%;20∶5的含量則明顯降低,甚至僅為脂肪酸組成的8%。18∶1n9的含量隨培養(yǎng)時間的延長而增加,至穩(wěn)定期時含量明顯增加,最高可由對數(shù)初期的3.6%增長為8.8%。14∶0,16∶1,18∶0及20∶4等的含量變化不大。在pH6.2條件下,穩(wěn)定期時16∶0的含量相對較低,占總脂肪酸組成的31%,而在堿性條件下,其含量相對較高,占總脂肪酸組成的40%左右。在對數(shù)期pH對EPA(20∶5)含量的影響見圖5。由圖5可知,在pH6.8的條件下,眼點擬微綠球藻含有較高的EPA約為9.8μg/mg(干重);而在pH9.8的條件下,EPA含量明顯降低,僅為5.1μg/mg(干重),在其他條件下,EPA含量差別不大。3ph對總脂和epa含量的影響(1)在pH6.8~9.8的范圍內(nèi),眼點擬微綠球藻有較高的生長速率。在pH5.5,6.2的酸性條件下,營養(yǎng)源的吸收受到阻礙,因而藻細胞的生長受到抑制。一般海洋藻類生存的適宜pH值與海水的pH值相近,為pH8.3左右。不同的藻類生活的適宜pH值不同,偏離此pH值,微藻生長和體內(nèi)有關(guān)代謝活動即受影響。Cohen1988年發(fā)現(xiàn)紫球藻(Porphyridiumcruentum)的理想pH為7.6左右,偏離此值時,藻細胞生長變慢。本研究表明眼點擬微綠球藻對pH有較強的適應(yīng)性,在pH9.8的強堿性條件下,仍然保持很高的生長速率,只有在偏酸性條件下,由于氮、磷的吸收受到阻礙,生長才受到抑制。(2)本實驗表明在pH9.8的條件下,眼點擬微綠球藻的總脂含量明顯低于其他pH條件下的總脂含量。在pH6.8的條件下,EPA的含量較高,而在pH9.8的條件下,EPA的含量明顯低于其他pH條件下EPA的含量。有些研究者認為培養(yǎng)基酸堿度的改變影響了細胞內(nèi)外的離子平衡、細胞膜的滲透性及有關(guān)膜的結(jié)構(gòu)組成。當(dāng)pH的范圍在5.5~8.0之間時,微藻的多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)受pH的影響較小。但Molina等1992發(fā)現(xiàn)等鞭金藻(Isochrysisgalbana)在pH6.0~8.0范圍內(nèi),總脂含量變化不大,但EPA含量,隨pH上升而下降,在pH6.0時含量最高。本研究也發(fā)現(xiàn)在pH6.8時,眼點擬微綠球藻的EPA含量最高。這表明pH值對微藻的總脂及EPA含量的影響因藻種的不同而異。在pH9.8時,眼點擬微綠球藻的總脂及EPA含量均明顯低于其他條件下的總脂及EPA含量。這表明在強堿性條件下,眼點擬微綠球藻的脂類合成受到了抑制;生物體內(nèi)長鏈脂肪酸的合成都是從16∶0開始,通過一系列脫氫酶、加氧酶和鏈延長酶類,向長鏈多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化,pH可能使此過程有關(guān)的酶的活性受到影響,因而EPA含量相對較低。(3)本實驗表明在不同pH條件下,眼點擬微綠球藻的總脂含量在一個培養(yǎng)周期內(nèi)均表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律,在對數(shù)初期總脂含量略有下降,然后逐漸上升,在穩(wěn)定期含量達到最大值;其脂肪酸組成在一個培養(yǎng)周期內(nèi)也表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律。在對數(shù)期EPA含量較高,穩(wěn)定期時含量明顯降低,而16∶0和18∶1n9的含量與EPA相反,在穩(wěn)定期其含量明顯升高。Yongmanitchai等1989年表明當(dāng)培養(yǎng)進入后期時,許多微藻傾向于以脂類的形式儲存它們的能源。這種脂類通常富含飽和和單不飽和脂肪酸。海洋微藻等鞭金藻在培養(yǎng)后期,脂類是有機物中的主要成