太湖水體中藻藍蛋白的光譜分析

太湖水體中藻藍蛋白的光譜分析

藻藍蛋白提取檢測海藻蛋白（pc）是藻類用于光合作用的重要輔助蛋白之一。它由海藻膽素（pc）和脫基蛋白中的保守半胱氨酸殘基組成。主要存在于藻類、隱藻和紅藻的膽體中。在環(huán)境監(jiān)測中,特別是藍藻水華頻發(fā)的水域,藻藍蛋白濃度能較好地表征藍藻生物量,是水體富營養(yǎng)化及藍藻水華監(jiān)測重點關(guān)注的指標。紫外-可見分光光度法是藻藍蛋白濃度定量分析的常用方法,其主要依據(jù)是藻藍蛋白500~700nm的吸收光譜特性。由于藻藍蛋白為胞內(nèi)蛋白,提純工藝復雜,當前環(huán)境監(jiān)測研究中藻藍蛋白的提取多以反復凍融、超聲破碎、化學溶脹等細胞破碎方法為主,藻藍蛋白濃度的計算主要沿用Bennett、Abelson等學者基于單一藻種純化光譜建立的經(jīng)驗公式。然而,反復凍融等提取結(jié)果的純化程度不高,獲取的藻藍蛋白吸收光譜常常受到其他物質(zhì)組分的影響而與經(jīng)過硫酸銨鹽析、柱色譜層析分離的純化光譜存在差異。此外,與室內(nèi)培養(yǎng)的單一藻種不同,在自然水體,特別是類似于太湖的富營養(yǎng)化嚴重的渾濁水體中,物質(zhì)組成和藻類種群結(jié)構(gòu)具有明顯的時空變化;不同環(huán)境、不同藻種中提取的藻藍蛋白受到的干擾不同,光譜特征也不盡相同。吸收光譜是藻藍蛋白結(jié)構(gòu)分析、濃度定量計算的基礎(chǔ),對內(nèi)陸湖泊水色遙感反演研究也具有重要意義。因此,有必要進一步研究自然水體中藻藍蛋白的吸收光譜特征及其與標準品、單一藻種的差異。以中國太湖為代表,于2011年春、夏、秋三季在太湖采集75個水樣,對太湖水體中藻藍蛋白的紫外-可見吸收光譜特征進行分析,并輔以標準品和室內(nèi)培養(yǎng)的銅綠微囊藻、魚腥藻藍蛋白吸收數(shù)據(jù),比較太湖水體中藻藍蛋白的吸收光譜特征及其與標準品、單一藻種的差異,以期為太湖藻藍蛋白濃度定量計算提供參考依據(jù),為藍藻水華監(jiān)測提供基礎(chǔ)支撐。1實驗部分1.1實驗生物和材料于2011年5月19日、7月30日、8月20日、9月3日、11月12日在太湖布設(shè)采樣點位開展野外調(diào)查,共采集75個水樣用于實驗分析。銅綠微囊藻(microcysticaeruginosa)、魚腥藻(anabaena)藻種來源于中國科學院水生生物研究所,在江蘇省環(huán)境演變與生態(tài)建設(shè)重點實驗室的無菌實驗室進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的銅綠微囊藻、魚腥藻樣品進行實驗。藻藍蛋白標準品(P6161)購自美國sigma公司,提純于螺旋藻(spirulina)。1.2藻藍蛋白標準品的制備太湖水樣和銅綠微囊藻、魚腥藻的藻藍蛋白提取使用反復凍融法。首先用GF/C玻璃纖維濾膜過濾樣品,將附著藻體的濾膜放入凍存管中,同時加入0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖液于低溫冰箱冷凍,然后室溫避光解凍,如此反復凍融7次。解凍的樣品以12000r·min-1速度離心10min,取離心后的上清液作為待測液。以磷酸鹽緩沖液作為空白對照,使用島津UV-2450/UV-2550分光光度計測量吸光度。對于標準品的配置和測量,取Sigma公司生產(chǎn)的藻藍蛋白標準品0.5mg,加人25mL磷酸鹽緩沖液使其成為20mg·L-1的標準溶液貯備液,裝入棕色瓶中,于4℃保存。實驗分析時將標準液取出并配制為10mg·L-1的標準應用液。以磷酸鹽緩沖液作為空白對照測量吸光度。參照張運林方法,通過GF/F玻璃纖維濾膜過濾水樣、測量濾液吸光度,獲取有色可溶性有機物(CDOM)的吸收數(shù)據(jù),對藻藍蛋白吸收光譜特征進行輔助分析。2結(jié)果與討論2.1藻藍蛋白的吸收特性藻藍蛋白標準品的吸收光譜見圖1。由圖1可知,藻藍蛋白標準品在250~800nm紫外-可見光范圍共有三個吸收譜帶:250~300,300~450和500~700nm。主吸收峰位于620nm,由藻藍膽素中的四吡咯環(huán)引起,為藻藍蛋白的特有吸收特征。250~300nm的吸收峰出現(xiàn)在278nm處,源于蛋白中芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的吸收。300~450nm的吸收峰位于345nm,主要由蛋白中二硫鍵的吸收引起。標準品的278,345和620nm的峰值比約為2∶1∶5。2.2單一藻物種的藍色藻蛋白的吸收光譜特征圖2給出了室內(nèi)培養(yǎng)的單一銅綠微囊藻、魚腥藻的藻藍蛋白吸收光譜。2.3藻藍蛋白檢測譜帶及純度根據(jù)待測溶液500~700nm的吸收峰個數(shù),可將太湖水體中藻藍蛋白的吸收光譜劃分為無峰型、單峰型、雙峰型三類(圖3)。各吸收譜類型包括的樣點數(shù)量和日期見表1。第一類是無峰型,即500~700nm間變化平緩,620nm附近未檢測到藻藍蛋白的吸收特征。推測其原因是該光譜形態(tài)的水樣多采集于春、秋季(表1),水樣中浮游藻類生物量小、藍藻所占比例低,致使待測溶液的藻藍蛋白含量微少難以檢出。根據(jù)300~450nm的吸收差異,無峰型又可劃分為無峰Ⅰ和無峰Ⅱ兩個亞類。無峰Ⅰ僅260nm附近出現(xiàn)吸收峰,250~800nm的譜型更接近于水樣的CDOM吸收譜(圖4)。無峰Ⅱ在260和330nm處均具吸收峰,說明待測溶液中其他可溶性蛋白的含量較高。第二類為單峰型,620nm附近出現(xiàn)藻藍蛋白的特征吸收峰,光譜形態(tài)與標準品、銅綠微囊藻、魚腥藻接近。但是由于藻種差異和提取純度的影響,吸收峰的位置和峰值比與標準品、單一藻種不同。單峰型光譜的主吸收峰出現(xiàn)在260nm附近,次吸收峰位于330nm左右,260,330,620nm的平均峰值比約為11∶4∶1。單峰型光譜300~450nm的吸收譜型與銅綠微囊藻接近:300~350nm出現(xiàn)吸收峰,350~450nm的吸光度值遞減。第三類為雙峰型,即在620nm藻藍蛋白特征吸收峰的右側(cè)約670nm處出現(xiàn)了另一個吸收峰,同時在350~450nm出現(xiàn)吸收肩。按照吸光度的高低順序,雙峰型光譜的主吸收峰出現(xiàn)在260nm附近,次吸收峰位于330nm左右,三個吸收峰260,330,620nm的平均峰值比約為10∶5∶1。從圖3來看,雙峰型光譜670nm附近的吸收譜帶與藻藍蛋白、別藻藍蛋白的吸收具有重疊。太湖藻藍蛋白的主吸收峰出現(xiàn)在260nm附近,紫外波段至藍波段(約250~500nm范圍)的吸光度值呈現(xiàn)衰減(圖3),與標準品(圖1)和Bennett、Abelson研究中的純化光譜不同。究其原因是受待測溶液中其他含苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的可溶性蛋白影響。藍藻細胞由眾多可溶性蛋白構(gòu)成,藻藍蛋白、別藻藍蛋白等藻膽蛋白約占藍藻可溶性蛋白的40%~60%。研究中使用的反復凍融法是水環(huán)境監(jiān)測中常用的藻藍蛋白提取方法,能有效地破碎藻體細胞,使藻膽體內(nèi)的藻藍蛋白溶出。但其分離、純化能力有限,不足以將藻藍蛋白與其他可溶性蛋白分離完全。根據(jù)以往文獻記載和水樣的CDOM吸收數(shù)據(jù)(圖4),太湖藻藍蛋白紫外波段至藍波段的吸收還可能受到CDOM的影響。CDOM是由富里酸、腐殖酸、芳烴聚合物等一系列物質(zhì)組成的水溶性物質(zhì),由藻類、細菌、水生植物等有機體的降解產(chǎn)生,在紫外和藍光區(qū)具有強吸收。本研究中采用濾膜過濾方式分離藻體,而CDOM存在于過濾除去的水樣中。但是,反復凍融法屬于機械破碎,在藻藍蛋白提取的同時會形成大量有機碎屑。這些有機碎屑在多次的反復凍融提取中會慢慢腐爛分解,釋放出CDOM。圖3(a)中,太湖無峰Ⅰ型光譜在300~450nm未觀測到蛋白中二硫鍵的吸收峰,250~800nm的吸收譜型與標準品不同而接近于CDOM,進一步說明反復凍融法提取的藻藍蛋白溶液中存在CDOM組分;并且對于無峰Ⅰ而言,CDOM的吸收可能掩蓋了二硫鍵300~450nm的吸收信息。由圖2和圖3可知,太湖水體藻藍蛋白吸收光譜的次吸收峰位于330nm左右,單一藻種則出現(xiàn)在620nm附近。產(chǎn)生該差異的原因可能有以下兩種:一是太湖水體中藻體多以群體態(tài)形式聚集并形成包裹體,包裹體表面附有由果膠酸、粘多糖等構(gòu)成的群體膠鞘。群體膠鞘類似于藻體細胞外殼,其存在會增加藻藍蛋白提取的難度,使得太湖藻藍蛋白待測溶液的提取純度低于單一藻種。第二種可能是受到其他非藍藻門藻種的影響。太湖是多藻種共存的湖泊水體,水體中除了藍藻外,還會存在諸如斜生柵藻、梅尼小環(huán)藻等的其他非藍藻門藻種。這些非藍藻門藻種雖不含藻藍蛋白,但其細胞體本身也由眾多可溶性蛋白質(zhì)構(gòu)成;在反復凍融提取過程中,它們也會發(fā)生降解并產(chǎn)生CDOM,致使太湖藻藍蛋白紫外波段至藍波段的吸收增強。余九九、張允允、Akimoto等的研究表明,在以反復凍融、超聲波破碎、氯化鈣自溶等細胞破碎方法提取出極大螺旋藻(spirulinamaxima)、藍隱藻(chroomonasplacoidea)、鈍頂節(jié)旋藻(arthrospiraplatensis)中的藻藍蛋白時,位于類囊體膜上的葉綠素復合蛋白也會隨之脫落共存于待測液中,并對其300~450和500~700nm譜帶的吸收產(chǎn)生不同程度的干擾。圖3(d)中,雙峰型光譜在670nm附近具有吸收峰,同時在350~450nm出現(xiàn)吸收肩,譜型與上述研究類似,表明具備雙峰型光譜形態(tài)的藻藍蛋白待測溶液中存在葉綠素復合蛋白組分。藻藍蛋白的分光光度法定量主要依據(jù)藻藍蛋白在500~700nm的吸收光譜特性(以Bennett公式和Abelson公式為例)。Bennett公式中藻藍蛋白的特征波長為615nm,別藻藍蛋白為652nm;Abelson公式中分別為620和650nm。圖3(a)和(b)中,無峰Ⅰ和無峰Ⅱ光譜在500~700nm的吸收平緩,615與620nm和652與650nm的吸收無可分性。顯然,在此情況下使用上述公式對無峰型樣品進行定量具有局限性。圖3(d)中,雙峰型光譜620nm附近的藻藍蛋白吸收特征明顯,但由于待測溶液中葉綠素復合蛋白的影響,670nm附近還具有吸收峰,且該吸收峰與藻藍蛋白、別藻藍蛋白的吸收峰重疊。因此,今后還需要開展更多的對比實驗工作來分析葉綠素復合蛋白對太湖藻藍蛋白濃度測定的影響,以進一步提高水體藻藍蛋白濃度測定的準確性。3單峰型和雙峰型光譜根據(jù)500~700nm的吸收峰個數(shù),太湖水體中藻藍蛋白的吸收光譜形態(tài)可劃分為無峰型、單峰型、雙峰型三類。(1)無峰型光譜620nm附近無藻藍蛋白的特征吸收峰出現(xiàn)。根據(jù)300~450nm的吸收差異,又可分為無峰Ⅰ和無峰Ⅱ兩個亞類。(2)單峰型光譜具有明顯的藻藍蛋白吸收特征。受藻種差異和提取純度的影響,各吸收峰的出現(xiàn)位置和峰值比與標準品、單一藻種不同。(3)雙峰型光譜兼具藻藍蛋白和葉綠素復合蛋白的吸收特征。圖2中,銅綠微囊藻、魚腥藻藻藍蛋白吸收光譜在與標