MALDITOFTOFMS在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用課件

MALDITOF/TOFMS在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用

張養(yǎng)軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院反射與輻射醫(yī)學(xué)研究所北京蛋白質(zhì)組研究中心2009年4月.MALDITOF/TOFMS.1報(bào)告內(nèi)容：一、蛋白質(zhì)組學(xué)簡介二、生物質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組鑒定的基本原理三、MALDITOF/TOFMS儀器組成和基本原理四、MALDITOF/TOFMS在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用1、在表達(dá)譜構(gòu)建中的應(yīng)用2、在翻譯后修飾研究中的應(yīng)用3、在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用4、在蛋白質(zhì)相對和絕對定量研究中的應(yīng)用.報(bào)告內(nèi)容：.2一、蛋白質(zhì)組學(xué)簡介蛋白質(zhì)組（proteome）：一種細(xì)胞、組織或生物體完整基因組所對應(yīng)的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics)：研究細(xì)胞、組織或生物體中蛋白質(zhì)組成、定位、變化及其相互作用規(guī)律的科學(xué)。簡要?dú)v史回顧：1994年，澳大利亞的科學(xué)家首次提出蛋白質(zhì)組概念；1995年，蛋白質(zhì)組一詞首次見諸報(bào)端；2001年4月，在美國成立了國際人類蛋白質(zhì)組研究組織(HumanProteomeOrganization,HUPO)，隨后歐洲、亞太地區(qū)都成立了區(qū)域性蛋白質(zhì)組研究組織，期望共同努力，完成人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃(HumanProteomeProject)；另外，創(chuàng)刊了蛋白質(zhì)組學(xué)專門雜志，如《Proteomics》、《Molecular&cellularproteomics》和《Journalofproteomeresearch》；2002年～現(xiàn)在，已舉行了六屆HUPO國際會議和五屆中國蛋白質(zhì)組學(xué)術(shù)大會。.一、蛋白質(zhì)組學(xué)簡介.3蛋白質(zhì)組研究的意義1、一些物種如小鼠、大鼠等基因組測序工作的完成，特別是人類基因組計(jì)劃草圖完成（2001年）后，人們面臨的迫切任務(wù)之一便是對基因組的功能注釋，而在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上常常無法回答許多生物學(xué)問題，如基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始位點(diǎn)、翻譯后修飾種類和位點(diǎn)、定位信息以及相互作用等問題，因此，蛋白質(zhì)組的研究是基因組研究的深入和延續(xù)；2、作為生命功能的執(zhí)行體——蛋白質(zhì)組的研究是為了從更高層次上深入解讀生命的本質(zhì)和生命活動的規(guī)律。3、通過人類疾病蛋白質(zhì)組的研究，為病理研究、早期診斷、治療以及藥物開發(fā)提供依據(jù)。.蛋白質(zhì)組研究的意義.4蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容1、蛋白質(zhì)組表達(dá)譜(proteomeexpressionprofiling)針對已有基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的生物體、組織或細(xì)胞，建立相應(yīng)蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。2、蛋白質(zhì)組修飾譜(proteomemodificationprofiling)構(gòu)建蛋白質(zhì)翻譯后修飾的種類、修飾位點(diǎn)以及修飾官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)等數(shù)據(jù)庫。3、基本生物學(xué)問題研究與生命活動過程中密切相關(guān)的問題。比如：蛋白質(zhì)組成和空間結(jié)構(gòu)、定位和相互作用網(wǎng)絡(luò)等；.蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容.54、臨床應(yīng)用問題以重要的生理過程或人類一些重大疾病為對象，進(jìn)行重要的生理和病理體系或過程的研究，即進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，包括疾病發(fā)生和發(fā)展機(jī)制、疾病診斷標(biāo)志物以及藥物靶標(biāo)等；

5、蛋白質(zhì)組學(xué)中的新技術(shù)和新方法建立蛋白質(zhì)組學(xué)研究的支撐技術(shù)平臺以及生物信息學(xué)研究工具，包括各種定性、定量、結(jié)構(gòu)分析和生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫。.4、臨床應(yīng)用問題.6

蛋白質(zhì)組研究中的復(fù)雜性一種細(xì)胞、組織或生物體有多少蛋白質(zhì)?人類基因組含有3～4萬個基因，與小鼠的基因數(shù)相差不多，僅是果蠅或線蟲的兩倍左右，但他們的表型相差卻如此巨大，其根本問題便是蛋白質(zhì)組的差異所致。30000-40000個基因30000個基因共享99%基因.蛋白質(zhì)組研究中的復(fù)雜性30000-40000個基因37PosttranslatedmodificationInteractionConformationtransformationPosttranslatedsplicingDisplacementcytoplastnuclei蛋白質(zhì)多樣性一個基因表達(dá)多少種蛋白質(zhì)？.PosttranslatedInteractionCon8

對于人體：

1個受精卵發(fā)育成1012細(xì)胞，103細(xì)胞類型。其“蛋白質(zhì)組”隨“時”、“空”處于變化之中，而“基因組”則相對處于不變之中。因此，我們可以得出：生命體的統(tǒng)一性源于基因組，生命體的復(fù)雜性源于蛋白質(zhì)組。.對于人體：.9主要研究策略1、研究基礎(chǔ)（1）生物學(xué)的發(fā)展，特別是越來越多生物基因組測序的完成，為我們提供了蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫；（2）生物質(zhì)譜和分離科學(xué)的進(jìn)步為我們提供了分離和鑒定的技術(shù)平臺和必須的手段；（3）計(jì)算機(jī)技術(shù)的提高，特別是生物信息學(xué)的發(fā)展為我們處理海量數(shù)據(jù)提供了有力的支持和保障。.主要研究策略.102、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法分類（1）蛋白質(zhì)組定性分析

依據(jù)分析對象是整體蛋白質(zhì)混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白質(zhì)組的定性分析方法分為自下向上法（bottomup）和自上向下法(topdown)；依據(jù)蛋白質(zhì)的序列特征，蛋白質(zhì)組定性分析方法可分為：肽質(zhì)量指紋譜法（PMF)和肽序列標(biāo)簽法（PST,也叫denovo法）

.2、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法分類.11（2）蛋白質(zhì)組定量分析方法①直接進(jìn)行比較，包括SDS、2DE、HPLC；②標(biāo)記方法，包括同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽（ICAT，iTRQA）、元素標(biāo)記親和標(biāo)簽（ECAT）、酶促18O標(biāo)記、DYGE技術(shù)和同位素氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)記(SILAC)。.（2）蛋白質(zhì)組定量分析方法.123蛋白質(zhì)組研究方法進(jìn)展(1)復(fù)雜蛋白質(zhì)組體系

目前對于組織、細(xì)胞和血漿等復(fù)雜蛋白質(zhì)組的分析，均采用多維分離技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用的方法。其技術(shù)路線如圖1和圖2所示。.3蛋白質(zhì)組研究方法進(jìn)展.13細(xì)胞、組織或體液蛋白質(zhì)提取液整體蛋白質(zhì)混合物預(yù)分離包括：2DE，2DLC，或LC-SDS等不同餾分或蛋白質(zhì)電泳帶多肽混合物溶液酶切或膠上原位酶切PMF，PSTORDENOVO數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)組MALDIMSorMSMSorcLC-ESI-MSMS

生物信息學(xué)工具圖1整體蛋白質(zhì)組預(yù)分離分析技術(shù)路線超聲、離心處理或亞細(xì)胞器分級.細(xì)胞、組織或體液蛋白質(zhì)提取液整體蛋白質(zhì)混合物預(yù)分離包括：不同14細(xì)胞、組織或體液蛋白質(zhì)提取液多肽混合物PSTORDENOVO數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)組MALDIMSMSorc2DLC-ESI-MSMS

生物信息學(xué)工具

圖2多維蛋白質(zhì)組分析技術(shù)（鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)方法）

超聲、離心處理或亞細(xì)胞器分級溶液酶切.細(xì)胞、組織或體液蛋白質(zhì)提取液多肽混合物PSTORDEN15BenjaminF.Cravatt,GabrielM.Simon&JohnR.YatesIII,Thebiologicalimpactofmass-spectrometry-basedproteomics.NATURE,Vol450:991-1000(2007)A.J.Link,J.EngD.M.Schieltz,E.Carmack,G.Mize,D.R.Morris,B.M.Garvik,J.R.Yates,III,Directanalysisofproteincomplexesusingmassspectrometry,NatureBiotechnology17,676-682(1999)

（JohnR.YatesIII，TheScrippsResearchInstitute

）鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)方法可形象圖示為:.BenjaminF.Cravatt,GabrielM16(2)簡單的蛋白質(zhì)組體系對于特定的、簡單的蛋白質(zhì)組分析，既可采用多維分離技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用的方法，也可以采用較少步驟的分離和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。其技術(shù)路線如圖3所示。.(2)簡單的蛋白質(zhì)組體系.17細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)提取液整體蛋白質(zhì)混合物分離SDS，IEF，HPLC不同餾分或蛋白質(zhì)電泳帶多肽混合物溶液酶切膠上原位酶切PMF，PSTORDENOVO數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)組MALDIMSMS,cLC-ESI-MSMS

生物信息學(xué)工具圖3特定或目標(biāo)蛋白質(zhì)組分離分析技術(shù)超聲、離心處理或亞細(xì)胞器分級.細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)提取液整體蛋白質(zhì)混合物分離不同餾分或蛋白質(zhì)電18(3)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)為確保蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的可靠性，以《Molecular&CellularProteomics》為代表的蛋白質(zhì)組學(xué)專業(yè)雜志對蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)產(chǎn)出、處理、質(zhì)量控制和發(fā)表提出了嚴(yán)格的要求，具體包括：實(shí)驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)處理程序名稱和版本、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和版本、數(shù)據(jù)判斷的閾值和統(tǒng)計(jì)方法、蛋白質(zhì)的名稱、序號和覆蓋率、肽段的序列和分值等。另外，數(shù)據(jù)可靠性評價標(biāo)準(zhǔn)：如概率法、反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫法等評價方法已獲得廣泛應(yīng)用。.(3)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn).19(4)、蛋白質(zhì)組技術(shù)方法發(fā)展趨勢蛋白質(zhì)組研究中目前面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)主要是：標(biāo)準(zhǔn)化方法的驗(yàn)證以及數(shù)據(jù)的精確性和重現(xiàn)性、簡便有效的驗(yàn)證技術(shù)和定量技術(shù)。就技術(shù)本身而言仍然是分析化學(xué)的基本問題即選擇性、準(zhǔn)確性、靈敏性、重現(xiàn)性、可行性和動態(tài)范圍。具體包括：1、標(biāo)準(zhǔn)化、高靈敏度和高重現(xiàn)性的微量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的建立及驗(yàn)證和評價體系；2、“鳥槍”蛋白質(zhì)組學(xué)方法向“導(dǎo)彈”蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展，即基于中心法則和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，直接鑒定相關(guān)蛋白質(zhì)組，而不是隨機(jī)鑒定蛋白質(zhì)組；.(4)、蛋白質(zhì)組技術(shù)方法發(fā)展趨勢.20

“鳥槍”蛋白質(zhì)組學(xué)方法基于肽段水平上“隨機(jī)”捕獲肽段，籍此對其相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，其結(jié)果具有不確定性、不具有目標(biāo)性以及低的重現(xiàn)性；而“導(dǎo)彈”蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展，即基于中心法則和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，直接鑒定相關(guān)蛋白質(zhì)組，其結(jié)果是具有明確的目標(biāo)性、高的重現(xiàn)性和鑒定效率。

“鳥槍”蛋白質(zhì)組學(xué)方法就像在大海中撈魚，如圖A，而“導(dǎo)彈”蛋白質(zhì)組學(xué)方法就像導(dǎo)彈打衛(wèi)星，如圖B所示。.“鳥槍”蛋白質(zhì)組學(xué)方法基于肽段水平上“隨機(jī)”捕獲肽段21圖B“導(dǎo)彈”蛋白質(zhì)組學(xué)方法示意圖圖A“鳥槍”蛋白質(zhì)組學(xué)方法示意圖.圖B“導(dǎo)彈”蛋白質(zhì)組學(xué)方法示意圖圖A“鳥槍”蛋白質(zhì)組學(xué)方22肝組織蛋白質(zhì)混合物酶切

多肽混合物SCXRPLC二維色譜分離MS/MSCollisionCellMS1P1P2P3…PnMS1P2P9P5…PmSHOTGUNMISSILESHOTGUN:不確定性、不具有目標(biāo)性以及低重現(xiàn)性MISSILE:明確的目標(biāo)性、高重現(xiàn)性和高鑒定效率.肝組織蛋白質(zhì)酶切多肽SCXRPLC二維色譜分離MS/MSC233、規(guī)模化高靈敏度、高重現(xiàn)性和寬動態(tài)范圍的蛋白質(zhì)組定量方法的建立與科學(xué)合理的新算法；4、蛋白質(zhì)組功能模塊定量、動態(tài)、實(shí)時檢測、成像和標(biāo)識技術(shù)的建立和應(yīng)用；5、集成物理、化學(xué)和信息技術(shù)中的標(biāo)記技術(shù)、示蹤技術(shù)、傳感技術(shù)和成像技術(shù)，建立動態(tài)目標(biāo)蛋白質(zhì)組的表達(dá)、修飾、定位和相互作用可視技術(shù)；6、建立生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、MRM驗(yàn)證定量和臨床標(biāo)志物檢測的標(biāo)準(zhǔn)化方法。.3、規(guī)模化高靈敏度、高重現(xiàn)性和寬動態(tài)范圍的蛋白質(zhì)組定量方法的24二、生物質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組鑒定的基本原理

自從1912年，Thomson首次使用拋物線質(zhì)譜儀測定了Ne的兩種同位素22Ne和24Ne以來，經(jīng)過近100年的發(fā)展，質(zhì)譜在其各個方面都得到巨大的發(fā)展（如下圖所示），各種組合的質(zhì)譜儀不斷出現(xiàn)，應(yīng)用更加深入廣泛！真空系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器

供電系統(tǒng)

數(shù)據(jù)處理與控制系統(tǒng).二、生物質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組鑒定的基本原理真空系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)離子源25離子源

離子源的作用：將樣品中的原子、分子電離成為離子，并使這些離子在離子源系統(tǒng)中形成具有一定幾何形狀和一定能量的離子束，然后進(jìn)入質(zhì)量分析器被分離。有機(jī)質(zhì)譜常用的離子源有：電子轟擊離子源（EI）；對熱不穩(wěn)定或高分子量化合物有化學(xué)電離源（CI）；解吸化學(xué)電離源（DCI）；場電離源（FI）；場解吸電離源；快原子轟擊電離源（FAB）；離子轟擊電離源（IB）；激光解吸電離源（LI）；熱噴霧和電噴霧電離源（ESI）等。生物質(zhì)譜常用后兩種離子源。.離子源.26質(zhì)量分析器

質(zhì)量分析器的作用：使離子按照質(zhì)荷比的大小分離開來，以便得到按質(zhì)荷比大小順序排列成的質(zhì)譜圖。有機(jī)質(zhì)譜和生物質(zhì)譜常用的質(zhì)量分析器有：a磁場(或電場)質(zhì)量分析器；b四極桿質(zhì)量分析器；c飛行時間質(zhì)量分析器；d離子阱質(zhì)量分析器；e離子回旋共振質(zhì)量分析器；fORBITRAP（軌道離子阱）。.質(zhì)量分析器.27質(zhì)量分析器、縮寫符號和原理.質(zhì)量分析器、縮寫符號和原理.28生物質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)鑒定的基本假設(shè)：（1）蛋白質(zhì)的組成是唯一的，即蛋白質(zhì)具有一個、數(shù)個肽段或一組肽段作為其標(biāo)簽；（2）存在選擇性地對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切的一種或多種蛋白酶；（3）通過生物質(zhì)譜獲得的肽段的質(zhì)荷比信息可以推測出肽段、蛋白質(zhì)的序列或直接通過與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)參數(shù)及相關(guān)肽段信息的比對和相關(guān)分析鑒定蛋白質(zhì)。.生物質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)鑒定的基本假設(shè)：.291、肽質(zhì)量指紋譜（PeptideMassFingerprinting，PMF）指蛋白質(zhì)被酶切位點(diǎn)專一的蛋白酶水解后得到的肽段混合物經(jīng)過質(zhì)譜分析所得到的質(zhì)譜圖。由于組成每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列(一級結(jié)構(gòu))不同，蛋白質(zhì)被酶水解后，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具特征性，所以稱為肽質(zhì)量指紋譜，籍此可以實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的鑒定。蛋白質(zhì)被酶切位點(diǎn)專一的蛋白酶水解后的肽質(zhì)譜圖.1、肽質(zhì)量指紋譜（PeptideMassFingerpr30各種蛋白酶的切點(diǎn)及pH條件

蛋白酶切點(diǎn)pH條件TrypsinLys(K)、Arg(R)羧基端pH7.5-9.0Glu-CAsp(D)、Glu(E)羧基端pH4.0Glu(E)羧基端pH7.8Asp-NAsp(D)氨基端pH7.0-8.0Arg-CArg(R)羧基端pH7.2-8.0Lys-CLys(K)羧基端pH8.5-8.8.各種蛋白酶的切點(diǎn)及pH條件蛋白酶切點(diǎn)pH條件Trypsi312、肽序列標(biāo)簽(peptidesequencetag,PST)選擇蛋白質(zhì)的一種或數(shù)種肽序列標(biāo)簽肽段，在質(zhì)譜裂解池中碎裂而獲得相應(yīng)碎片肽段的質(zhì)譜圖，籍此推斷或比對出該肽段的序列，進(jìn)而鑒定出產(chǎn)生該肽段的蛋白質(zhì)（該方法也叫denovosequencing

）。多肽串聯(lián)質(zhì)譜碎裂方式示意圖

.2、肽序列標(biāo)簽(peptidesequencetag,32多肽串聯(lián)質(zhì)譜碎片離子結(jié)構(gòu)示意圖.多肽串聯(lián)質(zhì)譜碎片離子結(jié)構(gòu)示意圖.33雞卵白蛋白磷酸肽（EVVGSAEAGVDAASVSEEFR）m/z2088.9的ESI-Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜圖.雞卵白蛋白磷酸肽（EVVGSAEAGVDAASVSEEFR）34雞卵白蛋白磷酸肽m/z2088.9串聯(lián)質(zhì)譜理論值及檢索匹配值“*”m/zmatchedwithMascotsearchresult,“_”m/zmatchedwithcalculatedvalues.雞卵白蛋白磷酸肽m/z2088.9串聯(lián)質(zhì)譜理論值及檢索匹353、肽階梯測序法（PeptideLadderSequencing）（1）多肽經(jīng)化學(xué)或酶法處理，從肽鏈末端氨基酸起逐一降解產(chǎn)生一系列長度遞減的肽；（2）每一步反應(yīng)只水解最末端的氨基酸，產(chǎn)生的一系列肽相鄰質(zhì)量之間相差一個氨基酸殘基的質(zhì)量；（3）用質(zhì)譜檢測反應(yīng)不同時間點(diǎn)的降解產(chǎn)物，得到肽的階梯圖，根據(jù)相鄰肽之間質(zhì)量數(shù)之差值推出肽段的部分序列；（4）羧肽酶和氨肽酶，分別從肽鏈的C末端和N末端水解氨基酸或?qū)﹄亩蔚囊欢芜M(jìn)行標(biāo)記使質(zhì)譜僅產(chǎn)生一種y或b離子序列；（5）既可以采用手工也可以借用計(jì)算機(jī)軟件推斷肽序列；.3、肽階梯測序法（PeptideLadderSequen36（6）對蛋白質(zhì)全序列，一般需要多種酶產(chǎn)生多種不同的肽段混合物，分別測定每種混合物中肽的序列；（7）人工拼接或借助于計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行拼接，完成蛋白質(zhì)全序列全序列測定。如右圖所示：通過相鄰質(zhì)譜峰的差值可推斷出氨基酸殘基，但對同分異構(gòu)的氨基酸需進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析，如亮氨酸和異亮氨酸.（6）對蛋白質(zhì)全序列，一般需要多種酶產(chǎn)生多種不同的肽段混合物37三、MALDITOF/TOFMS儀器組成和基本原理.三、MALDITOF/TOFMS儀器組成和基本原理.384700/4800ProteomicsAnalyzer

(美國ABI公司）1、MALDITOF/TOFMS儀器組成.4700/4800Proteomics1、MALD39LaserSampleLoadingChamberCameraLamp4800MALDITOF/TOF?AnalyzerSchematicSamplePlateandStageMirrorsLinearDetectorReflectorDetector2-StageMirrorMirrorDeflectorsDecelDeflectorsX2,Y2DeflectorsX1,Y1DeflectorsTISCollisionCellMetastableSuppressorSource2DecelStackSource1Source1LensLens1CIDLens(Lens2)Lens3Attenuator.LaserSampleLoadingChamberCam40V2V1Laser

Source1Source2x1,y1DeflectorsReflectorDetector2StageReflectorCIDCellMetastableIonSuppressorLens1AttenuatorTISTOF2

x2,y2DeflectorsSamplePlateTOF1

LinearDetector(optional)DecelerationStackx3,y3DeflectorsLens2IonSink4700MALDITOF/TOF?AnalyzerSchematic.V2V1LaserSourc412、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜原理

（Matrix

Assisted

Laser

Desorption

Ionization

Time

ofFlightMassSpectrometry,MALDI-TOF-MS)HighvacuumMALDI-TOF-MS儀器結(jié)構(gòu)示意圖.2、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜原理Highvacuu42飛行時間(TimeOfFlight,TOF)質(zhì)量分析器基本原理：離子源產(chǎn)生的離子在加速電場獲得動能，進(jìn)入高真空無電場飛行管道并在此無場飛行管道內(nèi)飛行；質(zhì)量較輕的離子飛行速度快，較早到達(dá)檢測器；質(zhì)量較重的離子飛行速度慢，較晚到達(dá)檢測器。依據(jù)離子的飛行時間與其質(zhì)荷比平方根(m/z)成正比的關(guān)系，通過測定飛行時間，計(jì)算出相應(yīng)離子的原子量或分子量。

.飛行時間(TimeOfFlight,TOF)質(zhì)量分析43線性飛行時間質(zhì)譜(Liner-TOF)

由

E=VS·ze=1/2mv2和

t=L/v推出

t=const·m/z

E：離子在加速電場獲得的動能;VS

：加速電場電壓

z：離子所帶電荷;m：離子質(zhì)量，

v：離子飛行速度;L：飛行管道長度，

t：離子飛行時間;const：常數(shù)。

.線性飛行時間質(zhì)譜(Liner-TOF)

.44MALDITOFMS的特點(diǎn)：1、高靈敏度（高的離子傳輸效率）2、寬質(zhì)量范圍(400Da-400kDa,理論上沒有上限)3、分析速度快4、容易校正5、PSD或MS/MS(HIGH/LOWENERGYCOLLISION).MALDITOFMS的特點(diǎn)：.45影響TOF分辨率的因素：分辨率公式：其中：m和t分別為離子的質(zhì)量和飛行時間；△m和△t分別是質(zhì)量和時間坐標(biāo)時半峰寬質(zhì)量和時間；△x為到達(dá)檢測器的離子簇的厚度。.影響TOF分辨率的因素：分辨率公式：其中：m和t分別為離子46從以上公式可以看出：提高TOF質(zhì)量分析器的措施包括延長飛行管和增加飛行時間。延長飛行時間會造成因與其他氣體離子碰撞引起散射或離子束角擴(kuò)散，降低TOF質(zhì)量分析器性能；增加飛行時間意味著降低加速電壓，如此會降低靈敏度。所以，一般選擇飛行管1～2m，加速電壓20kV。另外，影響TOF分辨率的還有形成離子時的時間分散；離子占有空間體積的空間分散和動能不均的動能分散。為了有效解決這些問題，出現(xiàn)了兩種關(guān)鍵技術(shù)：延遲脈沖提取技術(shù)和反射技術(shù)。.從以上公式可以看出：提高TOF質(zhì)量分析器的措施包括延47延遲提取技術(shù)：

為了減少離開離子源、具離有相同m/z離子的動能分散，我們在離子形成和提取之間引入一段時間延遲。如下圖所示，初始形成的離子首先進(jìn)入源中的無場區(qū)，數(shù)百納秒到微秒后施加脈沖電壓，這種操作方式叫做延遲脈沖提取技術(shù)。這種能量聚焦的關(guān)鍵就是在離子形成和提取之間能夠適當(dāng)調(diào)節(jié)脈沖電壓的大小和延遲時間的多少。一般對于較低的m/z離子，可選擇較低的電壓或較短的延遲時間。需要注意的是延遲提取技術(shù)僅能改善一定質(zhì)量范圍離子的分辨率，且對高質(zhì)量的離子不是非常有效。.延遲提取技術(shù)：.48連續(xù)提取和延遲脈沖提取技術(shù)示意圖連續(xù)提取延遲提取延遲提取技術(shù)使質(zhì)譜峰明顯變窄，因此分辨率顯著提高.連續(xù)提取和延遲脈沖提取技術(shù)示意圖連續(xù)提取延遲提取延遲提取技術(shù)49反射技術(shù)安裝反射鏡TOF質(zhì)譜儀示意圖圖中：實(shí)心點(diǎn)表示相同m/z帶有較大的動能空心點(diǎn)表示相同m/z帶有較小的動能.反射技術(shù)安裝反射鏡TOF質(zhì)譜儀示意圖.50（1）（2）（3）（4）在反射場中飛行總時間在飛行管中飛行的總時間：總飛行時間與線性TOF原理的數(shù)學(xué)表達(dá)式相同.（1）（2）（3）（4）在反射場中飛行總時間在飛行管中飛行的51采用反射鏡技術(shù)后如何達(dá)到能量聚焦

假設(shè)具有相同質(zhì)荷比但帶有不同動能的兩種離子，其中一個動能為Ek，另一個的動能為E’k，且兩個離子的動能比為a2，即：（1）我們推導(dǎo)出兩個離子的總飛行時間分別為：（2）.采用反射鏡技術(shù)后如何達(dá)到能量聚焦（1）我們推導(dǎo)出兩個離子的總52由公式（2）看出：如果a＞1，那么帶有較多動能的離子在無場飛行管中的飛行時間較短，而在反射鏡中的飛行時間較長；對于a＜1的情況，結(jié)果正好相反。這種飛行時間在兩個飛行部分相互補(bǔ)償，最終使具有相同質(zhì)荷比但不同動能的離子具有相同的總的飛行時間而同時到達(dá)監(jiān)測器。需要注意的是增加反射鏡雖然沒有增加質(zhì)譜儀的尺寸，但其提高分辨率是以犧牲質(zhì)譜的靈敏度和降低檢測質(zhì)量范圍為代價的。.由公式（2）看出：如果a＞1，那么帶有較多動能的離子53TOF/TOF質(zhì)譜（TandemSpectrometerwithCID）IonSource#2IonSource#1PrecursorIonSelector(TIS)CollisionCellMassAnalyzer#2DetectorMassAnalyzer

#1GeneratesandAcceleratesIonsTOF1SeparatesIonsInducesCIDFragmentationofPrecursorRe-AcceleratesFragmentsTOF2withMirrorSeparatesFragmentsSelectsIons.TOF/TOF質(zhì)譜（TandemSpectrometer54如何實(shí)現(xiàn)MS/MS分析？憑借時間離子選擇裝置（Timed-Ion-Selector，TIS)選擇母離子，在CID中與一定壓力的惰性氣體分子發(fā)生碰撞得到碎片離子，然后進(jìn)行TOF分離和檢測。

TIS具有兩種功能：一是可以抑制來自基質(zhì)和樣品中不感興趣的低質(zhì)量的離子；二是為MS/MS分析選擇母離子。操作步驟：依據(jù)選擇離子達(dá)到的時間適時的施加電壓（關(guān)門）偏轉(zhuǎn)離子的飛行軌道或接地（開門）使離子通過。.如何實(shí)現(xiàn)MS/MS分析？.55Timed-Ion-SelectorVoltageDetectorDetectorOutputTimeIntensity+++Mass50Mass100Mass500Mass50AccelDrift+++Time=0-+.Timed-Ion-SelectorVoltageDetec56TimedIonSelectorVoltageDetectorMass50Mass100Mass500DetectorOutputMass50TimeIntensityAccelDriftTime=A-++++Mass50Mass100Mass500Mass50.TimedIonSelectorVoltageDetec57TimedIonSelectorTime=BVoltageDetectorDetectorOutputTimeIntensityAccelDrift+++Mass50Mass100Mass500Mass50.TimedIonSelectorTime=BVolt58TimedIonSelectorVoltageDetectorDetectorOutputTimeIntensityAccelDriftTime=C-+C+++Mass50Mass100Mass500Mass50.TimedIonSelectorVoltageDetec59TimedIonSelectorVoltageDetectorDetectorOutputTimeIntensityAccelDriftTime=D+-C+++Mass50Mass100Mass500Mass50.TimedIonSelectorVoltageDetec60Pulsedlaser3.Ionsareacceleratedbyanelectricfieldtothesamekineticenergy;theyseparateaccordingtomassastheydriftthruthefield-freeregionoftheflighttubeFlighttube1.

Sample+matrixdriedontargetplateHighvacuumTimeHighvoltage2.Sampleisirradiatedwithlaser,clockstartstomeasuretime-of-flight

20-25kV5.Adatasystemcontrolsinstrumentparameters,acquiressignalvs.time,andprocessesthedata4.Ionsstrikethedetectoratdifferenttimesdependingonthemass/chargeratio一般MALDI質(zhì)譜的分析步驟.Pulsedlaser3.Ionsareaccel61離子源基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)基本原理：將分析物分散在基質(zhì)(Matrix)分子中并形成共結(jié)晶,當(dāng)用激光(337nm的氮激光或355nm的固體激光器)照射晶體時,樣品分子獲得激光能量解吸附，基質(zhì)－樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離。離子源特點(diǎn)1、使用脈沖式激光；2、產(chǎn)生單電荷離子和部分雙單電荷離子，質(zhì)譜圖中的譜峰與樣品各組分的質(zhì)量數(shù)有一一對應(yīng)關(guān)系；3、離子化效率高，是現(xiàn)今靈敏度最高的質(zhì)譜儀(fmol～amol)。.離子源基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)基本原理：將分析物分62

基質(zhì)1、吸收了激光的大部分能量并氣化，同時將樣品分子帶入氣相。樣品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化學(xué)鍵的斷裂。2、基質(zhì)在樣品離子形成過程中起到了質(zhì)子化或去質(zhì)子化的作用，使樣品分子帶上正電荷或負(fù)電荷，成為帶電荷的離子。.基質(zhì).63基質(zhì)簡稱中文名稱英文名稱激發(fā)波長SA芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸)Sinapinicacid(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid)

337nm或355nmDHB龍膽酸(2,5-二羥基苯甲酸)Gentisicacid(2,5-dihydroxybenzoicacid)CHCAα-氰基-4-羥基肉桂酸α-cyano-4-hydroxycinnamicacidPA吡啶甲酸Picolinicacid3HPA3-羥基吡啶甲酸3-hydroxypicolinicacid常用基質(zhì).基質(zhì)簡稱中文名稱英文名稱激發(fā)波長SA芥子酸Sinapinic64MALDI-TOF-MS譜中的亞穩(wěn)離子峰亞穩(wěn)離子(metastableion)是指MALDI離子源產(chǎn)生的離子在無場飛行管道飛行時發(fā)生結(jié)構(gòu)斷裂，丟失中性分子后所產(chǎn)生的離子(子離子)。亞穩(wěn)離子的特點(diǎn)是分辨率差，一般不能達(dá)到同位素分辨，而且只能在反射式的MALDI-TOF-MS譜中與其他離子區(qū)別出來。.MALDI-TOF-MS譜中的亞穩(wěn)離子峰.65磷酸肽的亞穩(wěn)離子峰β酪蛋白的胰蛋白酶酶解磷酸肽T48～63，質(zhì)荷比為2061.8，發(fā)生β消除反應(yīng)后脫去一個磷酸分子[M+H-H3PO4]+，質(zhì)量數(shù)減少98，實(shí)際子離子質(zhì)荷比應(yīng)為1963.8，而其亞穩(wěn)離子的表觀質(zhì)荷比為1969，比實(shí)際值大了5.2。.

66Harvey等推導(dǎo)了復(fù)雜的公式用于分析亞穩(wěn)離子質(zhì)荷比與其母離子、子離子質(zhì)荷比之間的關(guān)系，公式如下：

HarveyDJ,HunterAP,BatemanRH,etal,InternationalJournalofMassSpectrometry,1999,188(1-2):131Ma：母離子質(zhì)荷比Mb：子離子質(zhì)荷比Mc：亞穩(wěn)離子表觀質(zhì)荷比.Harvey等推導(dǎo)了復(fù)雜的公式用于分析亞穩(wěn)離子質(zhì)荷比與其母離67數(shù)據(jù)檢索

借助專用生物信息學(xué)工具（例如SEQUEST和MASCOT等）和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(例如IPI、NCBInr、SWISS-PROT等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)，在一定的限制條件下，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)信息進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)分析，給出肽段和相應(yīng)的蛋白質(zhì)列表，然后再根據(jù)一定置信水平的打分值實(shí)現(xiàn)對肽段和蛋白質(zhì)的定性。.數(shù)據(jù)檢索.68Combined(MS+MS/MS)Analysis–SampleSetupSpecifyAnalysisSettings–MSPeakFilteringOptimizedsettingscanbesavedasanewTemplatetomakefutureanalysesquickerandeasier

Trypsinautolyticpeaks,Keratinpeaks,internalstandards,etc.GPSExplorer?Software.Combined(MS+MS/MS)Analysis–69Combined(MS+MS/MS)Analysis–SampleSetupSpecifyAnalysisSettings–MS/MSPeakFilteringGPSExplorer?Software.Combined(MS+MS/MS)Analysis–70Combined(MS+MS/MS)Analysis–SampleSetupSavetheAnalysisSettings.Combined(MS+MS/MS)Analysis–71Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult.Combined(MS+MS/MS)Analysis–72Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult–ProteinSummaryReportProbabilitybasedMowsescoreandsignificanceoftophit.Combined(MS+MS/MS)Analysis–73Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult–ProteinSummaryReportDetailedresultsofmatchingpeptidesPeptidesshowinganIonScorewereselectedforMS/MS

Listofpeptidesnotmatchingthisprotein.Combined(MS+MS/MS)Analysis–74Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult–ProteinView

Sequenceandcoverage.Combined(MS+MS/MS)Analysis–75Combined(MS+MS/MS)Analysis–ResultsBrowserViewDatabaseResult–ProteinView

Peptidemasserrorinformation.Combined(MS+MS/MS)Analysis–76四、MALDITOF/TOFMS在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用1、在表達(dá)譜構(gòu)建中的應(yīng)用2DE-MALDI-TOF/TOFMS技術(shù)路線具有分離效率高、直觀和相對定量的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。目前該技術(shù)在我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功地應(yīng)用于胎肝蛋白質(zhì)組、血漿蛋白質(zhì)組和成人肝臟蛋白質(zhì)組等組織和細(xì)胞系蛋白質(zhì)組的研究。.四、MALDITOF/TOFMS在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用77

2DE-MALDI-TOF/TOFMS技術(shù)平臺技術(shù)路線特點(diǎn)：成功率(考染):大于90%

.2DE-MALDI-TOF/TOF78蛋白質(zhì)組雙向電泳zoom膠技術(shù)與MALDI-TOF/TOFMS聯(lián)用為了獲得更高的分離度，展示更多的蛋白質(zhì)點(diǎn)，采用ZOOM膠技術(shù)是一個重要的選擇，并通過MALDI-TOF/TOFMS的聯(lián)用，可鑒定更多的蛋白質(zhì)點(diǎn)。.蛋白質(zhì)組雙向電泳zoom膠技術(shù)與MALDI-TOF/TOF794.56.86.28.5

胎肝全蛋白2-DE表達(dá)譜共鑒定：601蛋白質(zhì)，唯一蛋白質(zhì):330蛋白質(zhì).4.56.86.28.5胎肝全80將Fe3O4/ZrP納米材料與樣品溶液混合，在磁場作用將富集的磷酸肽分離出來，經(jīng)溶劑洗脫之后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

Fe3O4/ZrP磁性納米材料富集磷酸肽的實(shí)驗(yàn)流程圖2、在翻譯后修飾研究中的應(yīng)用（1）磷酸肽的Fe3O4/ZrP磁性納米材料富集及MALDITOF/TOFMS分析.將Fe3O4/ZrP納米材料與樣品溶液混合，在磁場作用將富集81ab

1

2

Fe3O4/ZrP納米材料與不含ZrP基團(tuán)的納米材料的富集情況對比結(jié)果a應(yīng)用Fe3O4/ZrP納米材料的富集結(jié)果圖；

b應(yīng)用不含ZrP基團(tuán)的納米材料的富集結(jié)果圖；c1pmol

-Casein對照c

1

2.12Fe3O4/ZrP納米材料與不含ZrP基團(tuán)的納米材82c(2)

1

2

1

2abc

0.5pmol

-Casein與不同量BSA混合物經(jīng)富集前后的質(zhì)譜圖a

-Casein:BSA1:10對照b

-Casein:BSA1:10富集后c

-Casein:BSA1:20富集后.c(2)12120.5pmol-Ca83

1pmol

-Casein富集結(jié)果質(zhì)譜圖a：富集；b：不富集

1

2

34

5

67

8

9

10

11a

1

3

6

7

10

11b.1pmol-Casein富集結(jié)果質(zhì)譜圖12384Fe3O4/ZrP磁性納米材料富集磷酸肽的性能標(biāo)準(zhǔn)磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)磷酸肽114Label117Label富集不富集等體積混合串聯(lián)質(zhì)譜分析定量比較靈敏度50fmol的

酪蛋白樣品（1x10-9mol/L，50

L）富集標(biāo)準(zhǔn)磷酸肽(FLpTEYVATR)樣品時負(fù)載量為141.2pmol磷酸肽/mg納米材料回收率約為53%.Fe3O4/ZrP磁性納米材料富集磷酸肽的性能標(biāo)準(zhǔn)磷酸肽標(biāo)85重復(fù)性表11pmol

-Casein樣品２０次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

.重復(fù)性表11pmol-Casein樣品２０次重復(fù)實(shí)861pmolovalbumin經(jīng)富集前后的質(zhì)譜圖上富集前；下富集后富集方法偏性考察TheoreticalpI3.91(m/z2088.91)5.32(m/z2511.13)5.38(m/z2901.32).1pmolovalbumin經(jīng)富集前后的質(zhì)譜圖富集87bc

1

2

1

2

2

2a

1

1

2在不同的Loadingbuffer中進(jìn)行富集得到的質(zhì)譜圖a1pmol

-Casein對照;bLoadingbuffer為50﹪ACN、0.1﹪TFA

cLoadingbuffer為50﹪ACN、0.1﹪TFA、100mMNaCl

.121222112在不同的Loadin88（2）

rhEPO中糖基化位點(diǎn)的鑒定

人促紅細(xì)胞生成素（EPO）是一種糖蛋白，具有3個N-連接糖基化位點(diǎn)和1個O-連接糖基化位點(diǎn)，其最主要的功能是提高機(jī)體血紅蛋白的濃度。

rhEPO的糖基化性質(zhì)與其生物學(xué)功能及體內(nèi)活性有非常密切的聯(lián)系，因此進(jìn)行各種糖基化性質(zhì)的定性研究具有重要的意義。rhEPO有三個N-糖基化位點(diǎn)，分別是Asn-24，38和83，用PNGaseF切除糖鏈后，Asn變?yōu)锳sp，質(zhì)量數(shù)增加0.984，這樣一種質(zhì)量標(biāo)簽可以用于N-糖基化位點(diǎn)的鑒定；O-連接糖型分析則是基于酶切前后以及與理論值比較確定。.（2）rhEPO中糖基化位點(diǎn)的鑒定.89鑒定全部三個N-連接糖基化位點(diǎn)糖基化位點(diǎn)的質(zhì)譜分析方法

N-連接糖型及0-連接糖型框架的比較分析.鑒定全部三個N-連接糖基化位點(diǎn)糖基化位點(diǎn)的質(zhì)譜分析方法9038位N-連接糖基化位點(diǎn)鑒定.38位N-連接糖基化位點(diǎn)鑒定.91

O-連接糖型分析：PNGaseF和唾液酸酶兩種酶聯(lián)合使用與單用PNGaseF比較，前者切除N-連接糖鏈及O-連接糖鏈末端的唾液酸，后者只切除N-連接糖鏈，比較兩種方法所得的圖譜，并與理論值比對后，可以將測得的譜峰與糖型對應(yīng)起來，從而可以進(jìn)一步對不同產(chǎn)品的O-連接糖型的進(jìn)行比較。PNGaseFPNGaseF+Sialidase.O-連接糖型分析：PNGaseF和唾液酸酶兩種酶聯(lián)923、在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用

茶多酚EGCG與多肽親核氨基酸殘基相互作用研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EpigallocatechinGallate，EGCG)是茶葉中含量最多的活性成分之一，且多項(xiàng)研究表明EGCG是具有多種生物活性。實(shí)驗(yàn)研究表明，EGCG很可能是通過在體內(nèi)與某些重要的功能蛋白質(zhì)和關(guān)鍵多肽因子（如：GSH、酶等）發(fā)生共價相互作用，使得這些蛋白的功能發(fā)生了變化，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的。我們主要研究了除GSH外，其他含巰基的肽段與EGCG的反應(yīng)，以及在pH7.4的生理?xiàng)l件下，EGCG與多肽精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和N－端伯氨基的共價結(jié)合反應(yīng)特性。首先考察了不同氨基酸組成對EGCG與多肽中半胱氨酸相互作用的影響.3、在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用.93實(shí)驗(yàn)步驟（1）分別合成了分別含有兩個半胱氨酸、且其他氨基酸序列不同的兩個標(biāo)準(zhǔn)模型肽段P1、P2(P1:SGGDILQSGCCG，M.W.=1095.5Da;P2：WGLGGTCVNVGCIPK,M.W.=1502.9Da)；

（2）分別制備EGCG與P1、P2反應(yīng)的樣品溶液和相應(yīng)的對照品溶液。反應(yīng)完成后，分別脫鹽，點(diǎn)靶，進(jìn)行MALDI－TOF－MS的質(zhì)譜分析。.實(shí)驗(yàn)步驟.94A：P1肽段的對照以及質(zhì)譜圖；B：P1與EGCG共孵育后的一級質(zhì)譜圖.A：P1肽段的對照以及質(zhì)譜圖；.95與對照組質(zhì)譜圖（圖A）相比較，在樣品組的質(zhì)譜圖中（圖B），發(fā)現(xiàn)了兩個新的質(zhì)譜峰：質(zhì)荷比分別為m/z1552（（P1＋EGCG＋H）＋）和m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋），而在對照組中，沒有發(fā)現(xiàn)此兩個質(zhì)譜峰。經(jīng)計(jì)算，這兩個新的質(zhì)譜峰的質(zhì)量數(shù)正好與P1肽段分別和1個EGCG醌（M.W.=456Da）和2個EGCG醌（2×456Da）發(fā)生加成反應(yīng)所得加成產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù)一致。而這兩個新的質(zhì)譜峰在P1肽對照一級質(zhì)譜圖中并沒有出現(xiàn)，此現(xiàn)象表明，將EGCG與P1肽段混合后，有新的反應(yīng)產(chǎn)物生成。另外，P1肽經(jīng)與EGCG共孵育后，P1肽的m/z值由對照中的1096變成孵育后的1094，此現(xiàn)象表明，P1肽的兩個自由巰基很可能形成了二硫鍵，從而造成質(zhì)量數(shù)減2Da的結(jié)果。為了進(jìn)一步確證上述的推測以及確證EGCG的具體反應(yīng)位點(diǎn)，我們分別選擇m/z1552和m/z2008作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描。.與對照組質(zhì)譜圖（圖A）相比較，在樣品組的質(zhì)譜圖中（圖96A：P1肽的二級質(zhì)譜圖；B：m/z1552（（P1＋EGCG＋H）＋）的二級質(zhì)譜圖.A：P1肽的二級質(zhì)譜圖；.97經(jīng)過與P1肽段的二級譜圖的比較分析，我們發(fā)現(xiàn)，兩圖中的b4+～b9+是完全一樣的，表明m/z1552（（P1＋EGCG＋H）＋）的b9+之前的氨基酸序列與P1一致，且沒有被EGCG共價結(jié)合；而圖B中的b11+離子m/z1477與圖Ab11+離子m/z1021相差456，456正好是EGCG醌式結(jié)構(gòu)的質(zhì)量數(shù)，所以可以肯定EGCG是結(jié)合在了P1肽的b9到b11之間，即結(jié)合到P1肽的其中一個半胱氨酸上。

同理，圖B中的y6+、y7+離子與圖A的y6+、y7+離子均相差456，這也能證明EGCG的存在。.經(jīng)過與P1肽段的二級譜圖的比較分析，我們發(fā)現(xiàn)，兩圖中98A：P1肽的二級質(zhì)譜圖；B：m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的二級質(zhì)譜圖

.A：P1肽的二級質(zhì)譜圖；.99對于m/z2008的母離子，圖A為P1肽段的二級質(zhì)譜圖，圖B為m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的二級質(zhì)譜圖，經(jīng)過與P1肽段的二級譜圖的比較分析，我們發(fā)現(xiàn)，兩圖中的b4+～b9+是完全一樣的，表明m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的b9+之前的氨基酸序列與P1一致，且沒有被EGCG共價結(jié)合；而圖B中的b10+離子m/z1374與圖Ab10+離子m/z918相差456，456正好是EGCG醌式結(jié)構(gòu)的質(zhì)量數(shù)，所以可以肯定，m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的b10+離子的半胱氨酸上結(jié)合了一個EGCG；而圖B中的b11+離子m/z1933與圖3b11+離子m/z1021相差912，即2個456，表明m/z2008（（P1＋2EGCG＋H）＋）的b10+、b11+離子的半胱氨酸上分別結(jié)合了一個EGCG，即一共結(jié)合了兩個EGCG分子；同樣，圖B中的y6+