納米物質(zhì)的生物效應

納米物質(zhì)的生物效應

1納米尺度物質(zhì)的生物效應與對環(huán)境和健康的影響正如美國科技的象征一樣，21世紀科學和技術(shù)的象征是納米技術(shù)。由于納米規(guī)模（0.1.10納米，1納米相當于10億米）下物質(zhì)的特殊性質(zhì)，控制和操縱納米規(guī)模（單原子或原子集體），并制造各種功能設備。納米技術(shù)在多個領域有著廣闊的應用前景。正如羅氏所說，當納米技術(shù)成為革命技術(shù)的基礎時，那些擁有最大研究和應用納米技術(shù)的國家在工業(yè)發(fā)展中占著很大優(yōu)勢。同樣，未來技術(shù)（21世紀）是明智地接受納米技術(shù)的國家。納米材料由于其尺寸很小,結(jié)構(gòu)特殊,因此具有許多新的物理化學特性,如小尺寸效應、大的比表面、極高的反應活性、量子效應等.這些特性使納米科學已經(jīng)成為當今世界上三大支柱科學(生命科學、信息科學、納米科學)之一.納米技術(shù)的優(yōu)點在于:不僅在近期可以改造傳統(tǒng)工業(yè)技術(shù)(如減少原料消耗,減少污染排放,降低成本,提高性能等),而且在遠期有希望給21世紀的科學技術(shù)、工業(yè)和農(nóng)業(yè)等領域帶來革命性的變化.隨著納米技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化,各種形式的納米尺度的物質(zhì)已經(jīng)以各種不同的途徑進入我們的生活.比如,納米材料目前已經(jīng)應用于染料、涂料、醫(yī)藥診斷等傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)中,或在生產(chǎn)和使用過程中直接進入人體,或通過環(huán)境、食物鏈進入人體.總之,人們在工作和生活中接觸到納米材料的機會越來越多.正因為如此,2003年4月Science、2003年7月Nature,相繼發(fā)表編者文章,開始討論納米尺度物質(zhì)的生物效應、對環(huán)境和健康的影響問題.2004年1月美國化學會的EnvironmentalScience&Technologies雜志、2004年6月Science又再次載文強調(diào),必須對納米技術(shù)的安全性問題進行研究.同時,英國皇家科學院也相繼發(fā)表文章,討論納米尺度物質(zhì)對生物、環(huán)境、健康等可能帶來的潛在影響.納米技術(shù)的生物安全性問題之所以受到科學家們的如此關(guān)注,緣于一種宏觀思考,即,納米技術(shù)的發(fā)展是否也將帶來納米物質(zhì)對人體以及生態(tài)環(huán)境的污染,從而危及人類健康.同時,認識和解決這一問題,也是促進和保障納米科技健康和可持續(xù)發(fā)展的必要條件.我們知道,當物質(zhì)細分到納米尺度時,其性質(zhì)會發(fā)生很大變化,從而導致它們在生物體內(nèi)的生理行為與常規(guī)物質(zhì)可能有很大的不同.因此,對宏觀物質(zhì)的安全性評價,包括對人體健康及生態(tài)環(huán)境的影響,也許并不適用于納米尺度物質(zhì).以最近的研究結(jié)果為例,北京大學劉元方研究組將一種水溶性的納米碳管(直徑約1.4nm,長約400nm)導入小鼠體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)表觀分子量高達60萬的這種羥基化的水溶性納米碳管可以在小鼠的不同器官之間自由穿梭,通過尿液排泄.而60萬分子量的常規(guī)物質(zhì)是不可能出現(xiàn)如此奇特的現(xiàn)象的,以現(xiàn)有的生物學和生理學的知識無法解釋這種現(xiàn)象.最近,中國科學院高能物理研究所的納米材料生物效應實驗室與中國科學院武漢物理數(shù)學研究所合作,在研究磁性納米顆粒物在動物體內(nèi)的生理行為時,發(fā)現(xiàn)有的磁性納米顆粒物在小鼠的血管內(nèi)會逐漸變大,將血管堵塞,最后導致小鼠死亡.美國宇航局太空中心的一個研究小組將含0.1mg碳納米管的懸浮液,通過支氣管注入大鼠和小鼠肺部.7和90d后,組織病理學檢驗結(jié)果表明,所有的顆粒都會以一定的方式進入肺泡,這些顆粒甚至在長達90d的時間里仍停留在肺部.用于對照的碳黑顆粒只引起了小鼠肺部輕微的炎癥,而單壁碳納米管甚至在低濃度下都引起了肺部肉芽腫的形成.令人擔心的是,由碳納米管引起的肉芽腫的形成并沒有伴隨在通常情況下由石棉和無機粉塵所引起的肉芽腫所特有的炎性癥狀.紐約州羅切斯特大學的一個研究小組讓大鼠在含有20nm聚四氟乙烯顆粒的空氣中生活15min,就導致大多數(shù)大鼠在4h內(nèi)死亡.嚴格地說,這些研究結(jié)果還是很初步的.目前已有的研究數(shù)據(jù)還很有限.正因為如此,很容易使人們誤認為所有的納米材料都有很大毒性.要消除這種誤解,得到準確、客觀、負責的科學結(jié)論,可能還需要幾年或者更長時間.由于納米材料的生物環(huán)境效應、毒性、安全性的研究剛剛起步,不僅實驗數(shù)據(jù)有限,而且實驗方法學也有很大難度.如何保證所觀察現(xiàn)象,以及由此所得出的結(jié)論是來自于物質(zhì)的納米尺度特性對生物體的影響,僅靠單純的生物學、醫(yī)學和納米技術(shù)無法滿足要求.因此,有關(guān)納米尺度材料的生物效應及其毒理的研究在方法學上具有很大的挑戰(zhàn)性.為此,本文首先綜述納米材料毒理學的研究現(xiàn)狀,介紹已經(jīng)建立的實驗方法,并結(jié)合我們自己的研究結(jié)果,盡量全面地分析現(xiàn)有的文獻數(shù)據(jù).最后提出存在的重要問題,同時展望將來的研究重點.2本研究以及對納米生物效應和闡明的分析2.1納米tio2納米顆粒表面活性劑的生物效應目前對納米材料毒理學的研究尚處于起步階段,但正如化學家VickiColvin所強調(diào)的那樣:“當這一領域尚處于早期階段,并且人類受納米材料的影響比較有限時,一定要對納米材料的生物毒性給予關(guān)注.我們必須現(xiàn)在,而不是在納米技術(shù)被廣泛應用之后,才來面對這個問題”.目前為止,科學家們只對納米TiO2、SiO2、碳納米管、富勒烯和納米鐵粉等少數(shù)幾個納米物質(zhì)的生物效應進行了初步的研究.納米TiO2在涂料、抗老化、污水凈化、化妝品、抗靜電等方面存在廣泛應用,因而產(chǎn)量較高,對其毒性研究也較多.表1總結(jié)了現(xiàn)有的研究結(jié)果.在體內(nèi)和體外的實驗研究中,納米尺度的TiO2顆粒均比微米尺度的TiO2顆粒對肺部的損傷程度大,這與納米顆粒小的粒徑和大的比表面積有直接關(guān)系.實驗方法主要包括:用支氣管吸入法或支氣管注入法將TiO2顆粒導入動物體內(nèi).與注入法相比,吸入法更接近人類真實的暴露情況.因此應盡量采用吸入法來模擬人類實際的暴露情況,研究納米顆粒物的生物學行為.使用外推法評價納米顆粒物對人體的生物效應,對于納米技術(shù)相關(guān)政策、法規(guī)和防護標準的制訂等是很重要的.Afaq等用支氣管注入法研究超細TiO2(<30nm,用量2mg)對大鼠的毒性時,發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞的數(shù)量增加,同時細胞內(nèi)的谷胱甘肽過氧化酶、谷胱甘肽還原酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的活性均升高.而且,酶活性升高并沒有阻止脂質(zhì)過氧化和過氧化氫的生成,這表明受到TiO2納米顆粒作用時,盡管細胞啟動自我保護機制誘導了抗氧化酶的生成,卻未能消除TiO2納米顆粒產(chǎn)生的毒副作用.進一步的研究觀察到了納米TiO2顆粒引起的一系列生物效應.20nm的TiO2顆粒引起了肺組織間質(zhì)化,并誘發(fā)炎癥反應,使上皮組織的滲透性增加,肺泡灌洗液內(nèi)生理指標的變化與納米顆粒的比表面積(尺寸大小)有關(guān).同時納米TiO2引起了支氣管肺泡灌洗液內(nèi)蛋白質(zhì)總量、乳酸脫氫酶及β-葡萄糖苷酸酶的活性普遍升高,而且比表面積—效應曲線與實際的炎癥情況有很好的相關(guān)性,這意味著TiO2納米物質(zhì)的生物效應與尺寸效應有關(guān).因此,我們在討論納米材料生物效應時,即使是同一種材料,也需要注明具體尺寸大小(這和常規(guī)物質(zhì)有很大的不同),因為納米尺寸的改變,會引起其生物效應發(fā)生改變.肺是環(huán)境有害物質(zhì)進入機體的主要途徑之一.肺泡巨噬細胞是一多功能的間質(zhì)細胞,廣泛分布于肺泡內(nèi)及呼吸道上皮表面,具有吞噬、清除異物和保護肺的功能,是呼吸道的第一道防線.因此,研究巨噬細胞對納米顆粒的清除功能,對預測納米物質(zhì)的毒性十分重要.Oberd?rster等比較了大鼠肺泡巨噬細胞對相同質(zhì)量、不同尺寸的TiO2(20和250nm)粉末的清除機制.結(jié)果肺泡巨噬細胞對250nm的TiO2的清除半減期為177d;對20nm的TiO2的清除半減期為541d.這表明,尺寸越小,越難以被巨噬細胞清除.巨噬細胞清除外來異物的能力降低,其吞噬能力也會降低.Renwick等在研究29nm的超細TiO2和250nm的TiO2顆粒對巨噬細胞株(J774.2MF)吞噬能力的影響時表明,29nm比250nm的TiO2顆粒對巨噬細胞的吞噬能力降低更明顯.因此,可以推測,納米顆粒的粒徑(表面積)和數(shù)目是其造成肺損傷的關(guān)鍵因素之一.事實上,對于這些納米顆粒產(chǎn)生毒副作用的機制還不清楚.Zhang等認為納米顆粒可以誘導自由基的產(chǎn)生,導致體內(nèi)氧化應激,因此產(chǎn)生了生物毒性作用.納米顆粒是否對細胞凋亡過程產(chǎn)生特殊的影響,也是人們關(guān)心的重要問題之一.Rahman等在比較了20nm的超細TiO2顆粒和200nm的細TiO2顆粒對原代大鼠胚胎成纖維細胞的影響時發(fā)現(xiàn),20nm的超細顆粒處理后的細胞,其微核數(shù)目顯著升高,并引起了細胞凋亡.而200nm的細顆粒卻沒有引起細胞內(nèi)微核數(shù)目的變化.盡管對納米顆粒引起的細胞凋亡的機理還不清楚,但是,根據(jù)上面的一些結(jié)果推測,可能是由于反應活性很大的納米顆粒和細胞膜相互作用產(chǎn)生了活性氧物質(zhì),產(chǎn)生的氧化應激引起細胞膜脂質(zhì)層的破裂,細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失去平衡,導致依賴于Ca2+離子濃度的核酸內(nèi)切酶的活化,引起了細胞凋亡.2.2羥基化單壁碳納米管及其馬立克氏體的亞慢性毒性碳納米管是在1991年由Iijima發(fā)現(xiàn)的,它是一種完全人造的一維結(jié)構(gòu)材料.由于具有優(yōu)越的力學、電子學和化學等性能,在很多領域顯示出廣泛的應用前景.比如作為高靈敏度的化學傳感器,制作超強度的電纜以及掃描探測顯微鏡的探針,既可以取代銅作為導體,也可以取代硅作為半導體.現(xiàn)在單壁碳納米管的生產(chǎn)能力有限,不會對人類造成太大的危害.但是一旦設計出便宜的大批量生產(chǎn)單壁碳納米管的方法,無疑會增大其對人類健康的影響.但是,如何檢測在動物體內(nèi)的納米碳管是一個難題.最近Wang等利用射線探測技術(shù)的高靈敏度的優(yōu)點,部分地解決了這個問題.Wang等在直徑1.4nm、長400nm(約50000個碳原子組成)的水溶性(羥基化)單壁碳納米管(SWCNT)的外表面平均標記約1個125I原子,然后研究了羥基化單壁碳納米管在小鼠體內(nèi)的生物分布以及代謝過程.為了不影響單壁碳納米管本身的性質(zhì),只要能夠滿足測量的要求標記的125I原子越少越好.實驗采用了4種不同的暴露途徑:靜脈注射、腹腔注入、灌胃和皮下注射,將羥基化單壁碳納米管導入小鼠體內(nèi),計算小鼠每克濕組織的劑量百分比(%ID/g),結(jié)果如圖1所示.從圖1中看出,羥基化碳納米管主要分布在胃、腎臟和骨骼中,在其他的臟器中也有分布.4種不同給藥途徑對羥基化碳納米管的生物分布影響很小.此外,在11d后收集尿液和糞便,測其放射性計數(shù),發(fā)現(xiàn)仍有大約30%的羥基化單壁碳納米管蓄積在體內(nèi).因此,進一步對羥基化單壁碳納米管的亞慢性毒性進行研究是非常有必要的.該研究還發(fā)現(xiàn),表觀分子量約60萬的羥基化納米碳管可以在小鼠體內(nèi)的不同區(qū)室之間自由穿梭(擴散),通過尿液排泄.60萬分子量的常規(guī)物質(zhì)不可能出現(xiàn)如此奇特的行為,現(xiàn)有的生物學、生理學知識無法解釋這種現(xiàn)象.進一步的深入研究還在繼續(xù).用石英(SiO2)顆粒作為對照物,Jia等用MTT法進一步研究了單壁碳納米管對肺泡巨噬細胞的影響.從圖2中可以看出,單壁碳納米管和等量的石英相比表現(xiàn)出更顯著的細胞毒性.這與Lam等的研究結(jié)果是一致的.同時,單壁碳納米管與多壁碳納米管均可以引起細胞結(jié)構(gòu)的改變.圖3為暴露于單壁碳納米管和多壁碳納米管(MWCNT)的巨噬細胞結(jié)構(gòu)的變化.從圖3可以看出,對照組的巨噬細胞結(jié)構(gòu)完整,呈圓形,周圍有吞噬體和線粒體.而暴露于5μg/mL單壁碳納米管組,巨噬細胞出現(xiàn)皺折,5μg/mL多壁碳納米管組細胞核變性、核基質(zhì)減少.當劑量升高到20μg/mL時,單壁碳納米管組巨噬細胞腫脹,并出現(xiàn)空泡和吞噬小體;多壁碳納米管組染色質(zhì)濃縮,出現(xiàn)月牙樣邊集,細胞漿中出現(xiàn)空泡,這些都是細胞凋亡的癥狀.因此在一定劑量下單壁和多壁碳納米管誘導了明顯的細胞凋亡.而且這不同于細胞壞死,它不會產(chǎn)生炎性反應,這不僅支持了Warheit等人的研究結(jié)果,同時也對其觀察到的現(xiàn)象作出了部分解釋.Lam等采用支氣管注入的方式對單壁碳納米管的毒性進行了研究.發(fā)現(xiàn)注入0.1mg單壁碳納米管的小鼠無明顯的可診斷的毒性跡象.而劑量為0.5mg時,一部分動物死亡,另一部分出現(xiàn)明顯的肺部毒性,結(jié)果如圖4,5所示.Warheit等也采用支氣管注入(劑量為1mg/kg體重)法研究了單壁碳納米管對大鼠的肺部毒性,同Lam的發(fā)現(xiàn)一樣,Warheit也觀察到了多中心肉芽腫的生成,結(jié)果如圖6和7所示.但是Warheit等發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管并未引起持續(xù)的肺部炎癥、細胞增殖及支氣管肺泡灌洗液內(nèi)乳酸脫氫酶活性的持續(xù)升高.這與由毒性粉塵引起肺部肉芽腫的毒性機制是不一樣的.圖4的肺部組織病理切片顯示吞噬了碳黑顆粒的巨噬細胞分散在肺泡間質(zhì)中,而吞噬了不同單壁碳納米管的巨噬細胞均移向肺泡的中心部位,通過肺泡膜在肺泡上皮組織產(chǎn)生了肉芽腫.這表明單壁碳納米管的毒性不是由所含金屬引起的,而是由單壁碳納米管本身造成的.和石英相比,等量的單壁碳納米管表現(xiàn)出更大的毒性.從圖5中可以看出純化的和夾雜有催化金屬的碳納米管顆粒(未經(jīng)純化)都會進入肺泡,90d后這些顆粒仍不能被清除.灌注了碳黑顆粒的肺部組織只出現(xiàn)了輕微的炎癥,而單壁碳納米管卻引起了以肉芽腫為特征的肺部損傷.圖6和7分別為用支氣管注入的方式給大鼠灌注1mg/kg體重單壁碳納米管一周和一個月后的肺部組織病理切片.從圖6中看出肉芽腫在肺部組織中的分布是不均勻的,這可能是由于碳納米管在肺部的不均勻沉積造成的.從圖7中看出,多中心肉芽腫主要分布在碳納米管的周圍,將碳納米管隔離,這是非同尋常的反應.由單壁碳納米管引起的這種損傷可能是由于其獨特的物理化學特性使其在生物體內(nèi)和生態(tài)系統(tǒng)中長期存在而引起的.因此,低劑量的單壁碳納米管在體內(nèi)的滯留性是其長期暴露的關(guān)鍵問題,然而要想徹底了解其毒性的機制,需要進一步的研究.假設一只30g的小鼠每分鐘吸入30mL的空氣,可吸入的碳納米管顆粒假定有40%沉積在肺部,以每天8h的暴露時間來計算,在碳納米管顆粒濃度為5mg/m3(OccupationalSafetyandHealthAdministration,OSHA制定的8h允許暴露的石墨最高濃度)的空氣中暴露17d后,其肺部的濃度就可達到0.5mg,Lam證明在此劑量下碳納米管已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的肺部損傷.盡管碳納米管僅僅是石墨層卷成的圓筒,但是由于幾何結(jié)構(gòu)不同,不能簡單根據(jù)石墨的安全劑量來外推碳納米管的安全劑量,只有通過大量的研究獲得充足的毒理學研究數(shù)據(jù),才能得出納米材料對人類的安全劑量.2.3鐵粉顆粒的生物活性鐵在環(huán)境中廣泛存在,并且是大氣顆粒物中主要成分,因此在研究由大氣污染而帶來的健康損傷時,鐵扮演了重要的角色.Zhou等研究了大鼠吸入濃度為57和90μg/m3的超細鐵粉顆粒物(72nm,3d)對健康的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸入57μg/m3的鐵粉顆粒沒有引起大鼠明顯的生物學效應,而吸入90μg/m3的鐵粉顆粒引起了輕微的呼吸道反應,如鐵蛋白和肺泡灌洗液內(nèi)蛋白質(zhì)總量的明顯升高、乳酸脫氫酶(LDH)水平的輕微變化和細胞核因子(NF?B)與DNA結(jié)合能力的顯著升高.另有報道表明,呼吸道上皮細胞暴露于含鐵的大氣顆粒物后,細胞中鐵蛋白的表達量升高.鐵蛋白的升高可能是由于大鼠肺部沉積的鐵粉顆粒轉(zhuǎn)化成了生物活性的鐵.但在Zhou等的實驗中鐵粉主要是以難溶的三氧化二鐵(Fe2O3)的形式存在于體內(nèi).因此實驗中生物活性鐵的產(chǎn)生,很可能是由于沉積在肺部末端的納米鐵粉顆粒,容易遷移到細胞表面,從而通過細胞膜被細胞吸收成為生物活性的鐵.可以看出隨著暴露劑量的升高,超細鐵粉已經(jīng)表現(xiàn)出了輕微的毒副作用,然而實驗中的濃度(90μg/m3)還遠遠低于OSHA制定的可允許暴露的鐵粉最高濃度(15mg/m3),因此有必要對其生物效應做進一步的研究.上述實驗主要以短期暴露為模型,為了更接近人類實際的暴露情況,將來可以采用低劑量長期暴露的動物模型,可能更全面反映納米鐵粉顆粒給人類帶來的健康影響.3工業(yè)納米顆粒的毒性研究最近,美國國家科學基金會和美國環(huán)保署資助的一個研究小組指出,對工業(yè)納米顆?；蚣{米材料進行風險評價需要解決以下幾個關(guān)鍵問題:(1)研究工業(yè)納米顆粒物的毒理學;(2)建立工業(yè)納米顆粒物的安全暴露評價體系;(3)研究使用現(xiàn)有的顆粒和纖維暴露毒理學數(shù)據(jù)庫外推工業(yè)納米顆粒物毒性的可能性;(4)工業(yè)納米顆粒在環(huán)境和生物鏈中的遷移過程(Transportation)、持續(xù)時間(Persistence)及形態(tài)轉(zhuǎn)化(Transformation);(5)工業(yè)納米顆粒在生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中的再循環(huán)能力(Recyclability)和總的持續(xù)性(Overallsustainabil-ity).對工業(yè)納米粉體,如納米金屬粉、納米氧化物等進行毒性研究時,可以選取一些免疫細胞如巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞等進行體外研究;同時在體內(nèi)可以通過急性毒性實驗獲得半致死量(LD50)和最大耐受劑量(MTD)等基本數(shù)據(jù),對其毒性進行分級,初步了解受試物的毒性強度、性質(zhì)和可能的靶器官,獲得劑量—反應關(guān)系,為進一步的毒性實驗研究提供依據(jù).具體研究重點包括:(1)根據(jù)急性毒性實驗獲得的基本數(shù)據(jù)對納米顆粒進行吸入毒理學方面的研究,如肺組織病理變化,支氣管肺泡灌洗液(BAL)內(nèi)生化指標變化和肺勻漿液中一些酶活性的變化;(2)研究納米顆粒在體內(nèi)的吸收、分布和排泄的生物轉(zhuǎn)運過程和代謝過程;(3)采用不同暴露途徑研究不同工業(yè)納米顆粒的一般毒性和特殊毒性;(4)研究混合納米顆粒及納米顆粒與大氣污染物混合的毒性;(5)從分子水平闡釋納米顆粒和納米材料的毒性機理.綜上所述,納米尺度材料已經(jīng)顯示出一些特殊的生物效應以及對人體健康潛在的影響.目前也只是對眾多的納米材料中很少的幾種有所研究,且研究數(shù)據(jù)也很不全面.因此,對納米尺度物質(zhì)的生物效應,尤其是毒理學與安全性問題,目前尚無法得到明確的結(jié)論.更重要的是,當我們討論納米尺度物質(zhì)的生物效應或毒性這個問題時,不能泛泛而言,必須明確材料的種類、形態(tài)、尺寸(粒徑)大小、以及劑量的多少等參數(shù).比如,即使同一種類的納米材料,