培養(yǎng)可能并非最終答案

培養(yǎng)可能并非最終答案

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山東省聊城市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科吳鐵軍社區(qū)/醫(yī)院獲得性感染全球每年約4000萬(wàn)感染，50萬(wàn)死亡。中國(guó)每年約1000萬(wàn)感染(WHO2017報(bào)告）細(xì)菌耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻WHO保守估計(jì)到2050年全球因細(xì)菌耐藥問題每年死亡人數(shù)將逾越100萬(wàn)人。中國(guó)提出《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃》新發(fā)病原體層出不窮病原微生物中超過(guò)70%的病毒來(lái)源于動(dòng)物傳播，而自然界超過(guò)99%微生物尚未明確重癥肺炎20-25%病原不明膿毒血癥40-50%病原不明

腦炎腦膜炎50-60%病原不明AllegranziB,BagheriNejadSetal.Lancet.2011Jan15;377(9761):228-41重癥感染發(fā)病率逐年升高、疑難危重感染威脅巨大

重癥感染的診斷早期診斷發(fā)熱、咳嗽、咳痰呼吸急促、寒戰(zhàn)、皮疹、肌肉疼痛、尿路刺激癥狀，局部紅腫熱痛等臨床表現(xiàn)

器官功能（SOFA）

輔助檢查生物標(biāo)記物病原學(xué)檢查病原學(xué)診斷呼吸、凝血、肝臟、腎臟、循環(huán)、神經(jīng)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞百分比影像學(xué)檢查降鈣素原超敏C反應(yīng)蛋白涂片鏡檢、培養(yǎng)、抗原抗體檢測(cè)、PCR技術(shù)、質(zhì)譜分析、核酸二代測(cè)序重癥感染早期診斷和病原學(xué)診斷至關(guān)重要病原鑒定培養(yǎng)非培養(yǎng)生化鑒定蛋白檢測(cè)全自動(dòng)生化鑒定MALDI-TOFMS病毒培養(yǎng)抗原/抗體核酸檢測(cè)PCR測(cè)序ELISA真菌培養(yǎng)直接涂片病原微生物鑒定的檢測(cè)技術(shù)分類傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法局限性傳統(tǒng)培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)：平均3-5天，難以培養(yǎng)的細(xì)菌，真菌需要超過(guò)一周培養(yǎng)陽(yáng)性率低：血培養(yǎng)8-12%，腦脊液培養(yǎng)8-10%檢測(cè)種類有限，病毒和非典型病原無(wú)法培養(yǎng)未知或變異病原體的鑒定準(zhǔn)確性抗菌素選擇困難正確看待培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果多部位采集、多次送檢可以解決大多數(shù)的問題，而不是全部定植指局部培養(yǎng)出病原微生物，但是病人沒有表現(xiàn)出感染的癥狀，一般不需要抗感染治療。

感染則是局部培養(yǎng)出病原微生物同時(shí)伴有感染的癥狀，需要抗感染治療方可痊愈?？忍禈?biāo)本的采集方法

-醫(yī)師或護(hù)士直視下采集標(biāo)本，如有必要，可用吸痰器采集

-病人先用無(wú)菌生理鹽水漱口，去除表面的菌群

-教育病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液

●時(shí)間要求

-清晨的痰含菌量最多，是最佳采集時(shí)間

-在抗生素應(yīng)用前采集痰標(biāo)本

-標(biāo)本采集后1～2h內(nèi)必須立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室處理

-如果無(wú)痰可用3％～5％NaCl5ml霧吸約5min導(dǎo)痰，也可用物理療法、體位引流、鼻導(dǎo)管抽吸等法取痰

-不建議24h內(nèi)多次采集，除非痰液外觀性狀出現(xiàn)改變?cè)趺礃硬潘闶且环莺细竦奶禈?biāo)本？合格的BALF含非病原性菌很少

BALF可能會(huì)受到上呼吸道分泌物的污染

采用遠(yuǎn)端帶氣囊的保護(hù)性導(dǎo)管可避免標(biāo)本采集環(huán)節(jié)的污染

BALF能獲取肺泡表面襯液一份合格的BALF含非病原性菌很少

BAL檢查在下呼吸道感染的檢查中占有重要的地位標(biāo)本污染感染臨床上，嚴(yán)格無(wú)菌操作可很大程度上避免這種污染常見的兩種情況肺部感染：臨床主要癥狀及危害主要由某種細(xì)菌感染引起混合感染：檢出多種致病菌，有多重細(xì)菌引起的混合感染支氣管肺泡灌洗較常用于ICU病房的重癥患者、經(jīng)抗生素治療未獲改善的患者、機(jī)械通氣肺部感染的患者、疑似肺部真菌或支氣管結(jié)核患者

《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》-中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)培養(yǎng)陽(yáng)性的擴(kuò)展意義病原體培養(yǎng)陽(yáng)性并非就是感染，或一定是該病原菌感染需依據(jù)感染部位、病人臨床表現(xiàn)的特點(diǎn)以及病人不同病理、生理特點(diǎn)來(lái)綜合分析正常無(wú)菌的體腔（血液，腦脊液，胸腹水等）中分離到的病原體，考慮感染病原體非無(wú)菌部位（皮膚，黏膜或創(chuàng)面）分離的病原體，需結(jié)合臨床、影像、化驗(yàn)以及組織病理依據(jù)，區(qū)別定植或感染但如果膿液培養(yǎng)，或反復(fù)為同一結(jié)果，或保護(hù)性標(biāo)本，或菌落計(jì)數(shù)達(dá)到一定量--—傾向于感染針對(duì)微生物形態(tài)學(xué)：染色法革蘭染色抗酸染色墨汁染色熒光染色六胺銀染色培養(yǎng)：普通培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)真菌培養(yǎng)結(jié)核培養(yǎng)分子生物學(xué)

Real-timePCR檢測(cè)肺炎支原體、衣原體、結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌和軍團(tuán)菌等X-PERT診斷基因芯片新技術(shù)質(zhì)譜分析高通量基因組測(cè)序針對(duì)微生物抗原或結(jié)構(gòu)G/GM試驗(yàn)、隱球菌抗原、結(jié)核抗體檢測(cè)免疫反應(yīng)檢測(cè)T-SPORT和病毒檢測(cè)病原微生物實(shí)驗(yàn)室診斷策略培養(yǎng)并非唯一或最終答案

方便快捷，主要診斷寄生蟲、特殊染色的細(xì)菌

不適用于病毒，無(wú)法分清感染源

-不染色鏡檢-革蘭染色-抗酸染色-弱抗酸染色-六胺銀染色-KOH壓片-免疫熒光染色形態(tài)學(xué)檢查----顯微鏡檢查革蘭氏染色肺炎鏈球菌

葡萄球菌

大腸桿菌

鮑曼不動(dòng)粘液性銅綠抗酸染色結(jié)核分枝桿菌奴卡菌熒光顯微鏡真菌形態(tài)學(xué)

竹節(jié)狀菌絲

菌絲孢子隱球菌（墨汁染色）血清學(xué)與免疫學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)：是通過(guò)已知的抗體或抗原來(lái)檢測(cè)病原體的抗原或抗體，從而對(duì)病原體進(jìn)行快速鑒定的技術(shù)，簡(jiǎn)化了鑒定步驟，常用的方法包括：血清凝集技術(shù)乳膠凝集實(shí)驗(yàn)熒光抗體檢測(cè)技術(shù)協(xié)同凝集試驗(yàn)酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)免疫磁珠分離技術(shù)(IMBS)等IMBS：基本原理是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯(lián)到磁珠微球上，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)形成磁珠一目標(biāo)病原體復(fù)合物或磁珠一抗目標(biāo)病原體復(fù)合物，在外部磁場(chǎng)磁力的作用下，將目標(biāo)病原體分離出來(lái)。目前已經(jīng)開發(fā)出了針對(duì)各種病原體的免疫磁珠，如大腸埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、軍團(tuán)菌等，廣泛應(yīng)用到各級(jí)科研和實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)與免疫學(xué)檢測(cè)--G、GM試驗(yàn)

G試驗(yàn)檢測(cè)的是真菌的細(xì)胞壁成分---1,3-β-D-葡聚糖（BG），人體的吞噬細(xì)胞吞噬真菌后，能持續(xù)釋放該物質(zhì)，使血液中含量增高。定植時(shí)BG很少釋放入血，因此可有助于鑒別真菌侵襲與定植。半乳甘露聚糖（Galactomannan,GM）曲霉菌細(xì)胞壁上的一種多聚抗原，從薄弱的菌絲頂端釋放，曲霉菌感染的患者血液內(nèi)存在該物質(zhì)，而且長(zhǎng)于臨床癥狀和影像學(xué)出現(xiàn)異常之前數(shù)日出現(xiàn)。GM試驗(yàn)可用于曲霉菌感染的早期診斷的篩查指標(biāo)適用于除隱球菌和接合菌（毛霉菌）外的所有深部真菌感染的早期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種敏感性特異性引用文獻(xiàn)8794Zou,PlosOne2012;7:e528339094Guo,Chest20109298Heng,CritRevMicrobiol2015;41:124-34血清學(xué)與免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)核抗體隱球菌抗原艱難梭菌抗原檢測(cè)呼吸道病源八項(xiàng)基因檢測(cè)

隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)日新月異，對(duì)病原微生物的鑒定已深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別于其他種或?qū)?，檢測(cè)其特有的基因片段序列可用來(lái)鑒別病原微生物。核酸雜交技術(shù)基因芯片技術(shù)PCR技術(shù)二代基因測(cè)序等其他檢測(cè)技術(shù)

呼吸道13種病原體核酸檢測(cè)宏基因組學(xué)（mNGS）方法應(yīng)用宏基因組學(xué)測(cè)序法（metagenomicshotgunsequencing)可分析復(fù)雜樣本中微生物組的多樣性及豐度傳統(tǒng)微生物

流程復(fù)雜周期漫長(zhǎng)方法學(xué)復(fù)雜全基因組測(cè)序流程簡(jiǎn)單一站式解決精準(zhǔn)數(shù)據(jù)病原宏基因診斷方法學(xué)優(yōu)勢(shì)靈敏度高：DNA序列明確，信號(hào)清晰特異性高：物種特異性序列覆蓋度廣：一次檢測(cè)可測(cè)上千個(gè)病原菌檢測(cè)能力強(qiáng)：可檢測(cè)所有已知/新的病原菌新英格蘭經(jīng)典案例WilsonMRetal.NEnglJMed；2014;370(25):2408-1714歲,聯(lián)合免疫缺陷綜合征男孩4個(gè)月,多次發(fā)熱，診斷腦膜炎并發(fā)展為腦積水和癲癇狀態(tài)2013年波多黎各旅行6周內(nèi)-38項(xiàng)感染病原檢測(cè)5種抗生素經(jīng)驗(yàn)治療48小時(shí),腦脊液高通量測(cè)序鉤端螺旋體,475條序列,更換青霉素32天,痊愈出院

mNGS鑒定疑難感染病原38項(xiàng)

感染病原檢測(cè)5種

抗生素先后聯(lián)用NGS32天出院宏+全基因組學(xué)實(shí)現(xiàn)腺病毒分型JournalofInfection,ZouandCao

三例重癥肺炎病人通過(guò)傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)到人類腺病毒（HAdV）但無(wú)法分型樣本進(jìn)行宏基因組學(xué)測(cè)序（mNGS)后獲得三株HAdV的全基因組序列，成功確定型別分別為兩株B7和一株B3，并進(jìn)一步通過(guò)特異PCR確定突變位點(diǎn)。mNGS還可檢測(cè)到樣本中所有的病原體ZouX,FanYetal.JInfect.2018Aug;77(2):158-164.病原宏基因組診斷方法學(xué)優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)陽(yáng)性率報(bào)告時(shí)間優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)傳統(tǒng)病原檢測(cè)方法細(xì)菌/真菌以培養(yǎng)為主，病毒以PCR檢測(cè)與血清學(xué)檢測(cè)（有窗口期）為主，靶標(biāo)固定，有偏性。血培養(yǎng)：8-12%腦脊液：8-10%3-5天病原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，有充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)難以檢測(cè)新發(fā)\罕見病原，檢測(cè)目標(biāo)狹窄，靈敏度有限宏基因組學(xué)檢測(cè)方法不需培養(yǎng)，無(wú)偏性檢測(cè)7000種細(xì)菌，真菌，病毒和寄生蟲.血液：30-35%腦脊液：25-30%24-36小時(shí)（本地化）檢測(cè)新發(fā)病原體，并進(jìn)行溯源分類和檢測(cè)混合感染；深入提供病原鑒定，分型，耐藥基因和毒力因子分析；新技術(shù)，尚無(wú)充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)以及專家指南和共識(shí)

1.Parize,P.,Muth,E.,etal.B.(2017).Untargetednext-generationsequencing-basedfirst-linediagnosisofinfectioninimmunocompromisedadults:amulticentre,blinded,prospectivestudy.ClinicalMicrobiologyandInfection.2.Brown,J.R.,Bharucha,T.,&Breuer,J.(2018).Encephalitisdiagnosisusingmetagenomics:applicationofnextgenerationsequencingforundiagnosedcases.JournalofInfection.科研大項(xiàng)目：國(guó)家微生物組計(jì)劃臨床診斷：FDA感染病NGS診斷指南

2016年5月美國(guó)行動(dòng)計(jì)劃科研項(xiàng)目：百