電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用與展望

電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用與展望

0電化學(xué)生物傳感器一般來說，納米是指至少在二維范圍內(nèi)的納米規(guī)模（1.10納米），作為基本單元組成的材料，如納米、納米棒（管）、納米薄膜、納米塊體材料等。納米材料再按成相數(shù)目可以分為納米相材料和納米復(fù)合材料。納米相材料是指單相納米顆粒組成的材料;納米復(fù)合材料是指兩相或多相構(gòu)成,其中至少有一相為納米級(jí)的材料。納米材料的尺寸處在原子、分子為代表的微觀世界和宏觀物體交界的過渡區(qū)域。這樣的系統(tǒng)既非典型的微觀系統(tǒng)也非典型的宏觀系統(tǒng),存在表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等四大突出效應(yīng),在催化、光學(xué)、磁學(xué)、電學(xué)、熱學(xué)和力學(xué)等方面表現(xiàn)出很多獨(dú)特性能,并且已經(jīng)在很多行業(yè)得到了很好的應(yīng)用。生物傳感器作為一門涉及化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)以及電子學(xué)等領(lǐng)域的交叉學(xué)科,在臨床醫(yī)藥、發(fā)酵生產(chǎn)、食品檢驗(yàn)和環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。結(jié)合電分析技術(shù)與生物傳感技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器是其中非常重要的一類。它是由生物材料作為敏感元件,電極作為轉(zhuǎn)換元件,以電勢(shì)、電流或電導(dǎo)等作為特征檢測(cè)信號(hào)的傳感器。其研制過程中的一個(gè)關(guān)鍵因素是生物分子的固定化。如何在電極表面有效地固定生物分子,無論是對(duì)于研究蛋白質(zhì)等生物分子的性質(zhì),還是對(duì)于研制新型電化學(xué)生物傳感器都至關(guān)重要。理想的生物分子的固定方法要求既能促進(jìn)有效的電子轉(zhuǎn)移,又能保持被固定生物分子的活性。近年來,納米技術(shù)逐步進(jìn)入電分析和生物傳感器領(lǐng)域,引發(fā)了突破性的進(jìn)展。通過將新型納米材料修飾到電極表面,可以有效地固定生物分子,并促進(jìn)其氧化還原中心與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移,從而研制新一代的生物傳感器及其它生物器件。在此將按照納米材料結(jié)構(gòu)的分類,就近十年來納米材料在現(xiàn)代電分析和生物傳感器方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。1納米顆粒1.1金納米顆粒修飾的其他電化學(xué)生物傳感器膠體金可以用于生物分子的標(biāo)記,從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大,一直廣泛地應(yīng)用于TEM、SEM表征,試紙條顯色。有文獻(xiàn)報(bào)道了膠體金在各種生物傳感器中的信號(hào)放大作用。González-García等利用膠體金標(biāo)記,結(jié)合電化學(xué)方法來研究生物素-親和素之間的作用。首先把生物素化的白蛋白吸附在電極表面,然后與10nm直徑膠體金標(biāo)記的親和素反應(yīng),由膠體金引起的電流響應(yīng)和親和素濃度線性相關(guān)(2.5×10-9~2.5×10-5mol/L)。許多文獻(xiàn)也報(bào)道了金屬納米顆粒在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用,一些生物催化電極通過將氧化還原酶分子和金納米顆粒共沉積到電極上,從而被應(yīng)用于生物傳感器。通過將apo-葡萄糖氧化酶與1.4nmAu55納米顆粒重組,可以實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶與電極的高效電連接。與金納米顆粒重組的葡萄糖氧化酶在沒有介體的條件下與電極表面能夠直接發(fā)生電子轉(zhuǎn)移,且對(duì)葡萄糖具有催化作用。納米顆粒也可以用來定位腫瘤,熒光素標(biāo)記的識(shí)別因子,與腫瘤受體結(jié)合,可以在體外用儀器顯影確定腫瘤的大小和位置。另一個(gè)重要的方法就是用納米磁性顆粒標(biāo)記識(shí)別因子,與腫瘤表面的靶標(biāo)識(shí)別器結(jié)合后,在體外測(cè)定磁性顆粒在體內(nèi)的分布和位置,從而給腫瘤定位[4~6]。1.2硅納米顆粒及其比表活性的檢測(cè)納米粒子具有高比表面積,與普通生物分子載體相比,可以增加固定的分子數(shù)量,從而增強(qiáng)響應(yīng)信號(hào)。Singh等用sol-gel(溶膠-凝膠)方法合成硅納米顆粒,其直徑為20nm或200nm。為了構(gòu)建有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器,該納米顆粒用于固定乙酰膽堿脂酶,具有較高的比表活性,結(jié)合離子敏場(chǎng)效應(yīng)管檢測(cè),響應(yīng)迅速(<10s),靈敏度高,對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑paraoxon的檢測(cè)下限可達(dá)1×10-6mol/L。Cai等把膠體金納米顆粒固定在胱氨酸修飾的金電極表面,增大了有效固定面積,可以結(jié)合更多的ssDNA,使得檢測(cè)下限延長(zhǎng)。2納米穿孔結(jié)構(gòu)材料2.1聚吡咯單體微管Miao等引入了聚吡咯納米微管固定法。聚吡咯微管基于模板合成方法而得到,即利用化學(xué)或電化學(xué)方法使吡咯單體在模板孔隙中生長(zhǎng),以得到與模板相應(yīng)結(jié)構(gòu)的納米管。這種微管具有直徑統(tǒng)一、上下連通、管壁多孔的特點(diǎn)。它也具有較大的比表面積,能容納大量的酶分子,并減少反應(yīng)物和產(chǎn)物的擴(kuò)散障礙,有效地提高酶電極的性能。2.2ph值和纖維素在納米材料上的應(yīng)用最近,幾種納米孔金屬氧化物材料如納米氧化鈦和氧化鋅材料等,被用于固定氧化還原蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素c和血紅蛋白,同時(shí)被制成固定這些蛋白質(zhì)的電極[10~12]。此外,也有報(bào)道將細(xì)胞色素c富集在TiO2肌醇六磷酸納米膜上并測(cè)定其活性。這些納米孔金屬氧化物一般是半導(dǎo)體,具有電活性;也具有良好的生物相容性,如氧化鈦被廣泛應(yīng)用于牙膏和白色涂料;同時(shí)其孔徑是納米尺寸,能夠充分允許蛋白質(zhì)分子固定。這些材料的表面積也很大,保證了足夠多的生物分子固定。這些特點(diǎn)表明納米孔金屬氧化物材料在生物傳感器領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。Durrant等還應(yīng)用納米孔氧化鋅膜材料吸附綠色熒光蛋白,研究了其光譜和電化學(xué)性質(zhì)。3碳納米管及其應(yīng)用碳納米管(carbonnanotubes,CNTs)是由碳六元環(huán)構(gòu)成的類石墨平面卷曲而成的納米級(jí)中空管,其中每個(gè)碳原子通過sp2雜化與周圍3個(gè)碳原子發(fā)生完全鍵合。根據(jù)碳管壁中碳原子層的數(shù)目而劃分為單壁碳納米管(single-walledcarbonnanotubes,SWNTs)和多壁碳納米管(multi-walledcarbonnanotubes,MWNTs)。MWNTs的層間距一般為0.34nm。碳納米管的內(nèi)徑可控制在10nm左右,外徑達(dá)幾十個(gè)納米,軸向長(zhǎng)度卻可達(dá)幾十微米甚至更長(zhǎng)。與MWNTs相比,SWNTs具有直徑分布范圍小、缺陷少、均勻一致性更高等特點(diǎn)。碳納米管的比表面積大,孔徑大小在一定范圍內(nèi)可控;其側(cè)壁由片狀結(jié)構(gòu)的石墨組成,碳原子的sp2雜化形成高度離域化的π電子,疏水性強(qiáng),可與含有π電子的物質(zhì)通過π-π非共價(jià)鍵結(jié)合;而酸化處理的碳納米管則具有羧基官能團(tuán),可與含有-NH2基團(tuán)的化合物共價(jià)結(jié)合。因此,碳納米管可以通過非共價(jià)吸附或共價(jià)鍵合方式組裝蛋白質(zhì)和酶分子,其優(yōu)良的導(dǎo)電性能會(huì)很好地促進(jìn)生物電活性分子的電子傳遞,是一種良好的生物傳感器的材料。Dekker等使用單根單壁碳納米管制備生物傳感器,通過鍵合分子將葡萄糖氧化酶分子固定到碳納米管管壁上,可以有效的檢測(cè)葡萄糖和監(jiān)測(cè)pH變化。Gooding等利用單壁碳納米管陣列獲得了葡萄糖氧化酶與電極之間的直接電連接。李南強(qiáng)等研究了單壁碳納米管對(duì)生物分子如多巴胺、腎上腺素和抗壞血酸等的良好的電催化作用。Davis等將不同的金屬蛋白和酶分子吸附在氧化與凈化過的單壁碳納米管上,并測(cè)定了其生物活性。JosephWang等將碳納米管與Teflon混合用于葡萄糖氧化酶和乙醇脫氫酶的固定,制備了碳納米管復(fù)合電化學(xué)傳感器,分別測(cè)定了葡萄糖和NADH。Tachikawa等利用單壁碳納米管通過靜電作用層層組裝葡萄糖氧化酶研究了其直接電化學(xué)。董紹俊等和陳洪淵等利用碳納米管-殼聚糖復(fù)合物修飾電極也探測(cè)到了葡萄糖氧化酶的直接電化學(xué)并用于生物傳感。李景虹等則將碳納米管-量子點(diǎn)復(fù)合物修飾電極用于葡萄糖氧化酶的直接電化學(xué)和葡萄糖傳感器研究。毛蘭群等利用碳納米管修飾的玻碳電極獲得了同型半胱氨酸的靈敏檢測(cè);利用多壁碳納米管修飾的碳纖維微電極對(duì)鼠腦中的抗壞血酸進(jìn)行了原位伏安法檢測(cè);另外也對(duì)碳納米管復(fù)合物,如溶膠-凝膠驅(qū)動(dòng)的陶瓷-碳納米管復(fù)合物和聚合物輔助合成的結(jié)構(gòu)均一且具有電活性的MnO2-碳納米管復(fù)合物,進(jìn)行了電化學(xué)研究和電催化應(yīng)用。陳金華等[29~30]利用硼摻雜的碳納米管修飾電極研究了葡萄糖氧化酶的直接電化學(xué)和生物傳感。4介孔結(jié)構(gòu)材料介觀結(jié)構(gòu)材料是指三維空間尺度中至少有一維的尺寸處于介觀上的固體材料,或者說其顯微結(jié)構(gòu)中的物相具有介觀尺度的材料。按照國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)(IUPAC)的定義,孔徑在2~50nm范圍的多孔材料稱為介孔(中孔)材料。介孔材料具有較大的比表面積和孔體積、均一的且在納米尺寸上連續(xù)可調(diào)的孔徑、從一維到三維的規(guī)則有序的孔道結(jié)構(gòu)、可控的形貌、表面基團(tuán)可官能化、SiO2無生理毒性等優(yōu)點(diǎn),使得它們?cè)诖蠓肿游?、分離、傳感器、生物醫(yī)學(xué)、化工催化、環(huán)境保護(hù)以及納米材料的合成等領(lǐng)域展現(xiàn)出傳統(tǒng)沸石分子篩無可比擬的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景。按照介孔是否有序,介孔材料可分為無定形(無序)介孔材料和有序介孔材料。前者如普通的SiO2氣凝膠、微晶玻璃等,孔徑范圍較大,孔道形狀不規(guī)則;后者是以表面活性劑形成的超分子結(jié)構(gòu)為模板,利用溶膠-凝膠工藝,通過有機(jī)物無機(jī)物之間的界面定向?qū)б饔媒M裝成一類孔徑約在1.5~30nm,孔徑分布窄且有規(guī)則孔道結(jié)構(gòu)的無機(jī)多孔材料,如M41S等。其中有序介孔材料是20世紀(jì)90年代初迅速興起的一類新型納米結(jié)構(gòu)材料,它利用有機(jī)分子表面活性劑作為模板劑,與無機(jī)源進(jìn)行界面反應(yīng),以某種協(xié)同或自組裝方式形成由無機(jī)離子聚集體包裹的規(guī)則有序的膠束組裝體,通過煅燒或萃取方式除去有機(jī)物質(zhì)后,保留下無機(jī)骨架,從而形成多孔的納米結(jié)構(gòu)材料,在催化、吸附、分離[35~37]及光、電、磁[38~39]等許多領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前,國(guó)內(nèi)外介孔材料和功能化介孔材料用于修飾電極研究才起步不久。近年來的研究成果主要有:鞠幌先[40~41]等研究了辣根過氧化物酶、血紅蛋白和肌紅蛋白在六方介孔硅上的直接電化學(xué),探討了介孔分子篩與這些蛋白質(zhì)間的相互作用,構(gòu)建了過氧化氫和亞硝酸根的新型生物傳感器。其中固定化的血紅蛋白表現(xiàn)出兩對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰,分別對(duì)應(yīng)于吸附在表面的和內(nèi)嵌的血紅蛋白。該研究小組還制備了導(dǎo)電的介孔碳硅復(fù)合物用于葡萄糖氧化酶的固定和生物傳感研究。Hyeon和Kim等將介孔碳泡沫(mesocellularcarbonfoam)用于葡萄糖氧化酶的固定,制備了靈敏快速的葡萄糖生物傳感器。這種介孔碳泡沫的介孔孔道用于酶分子負(fù)載,微孔孔道用于傳質(zhì),制備的傳感器與基于聚合物制得的生物傳感器相比,表現(xiàn)出更高的催化活性和檢測(cè)靈敏度。Walcarius等將二茂鐵接在有序介孔硅上,得到功能化介孔硅,研究了該材料的電化學(xué)行為,發(fā)現(xiàn)該材料通過電子躍動(dòng)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)程電子轉(zhuǎn)移,這種介孔結(jié)構(gòu)材料是固載氧化還原探針的理想載體。陳洪淵小組用殼聚糖為交聯(lián)劑通過層層組裝將介孔碳CMK-3(比表面積1060m2/g,孔體積1.1cm-3)-血紅蛋白多層膜固定在玻碳電極表面,得到的修飾電極對(duì)過氧化氫具有很好的電催化效應(yīng)。Dai等利用含Ti的MCM-41介孔氧化硅修飾電極固定葡萄糖氧化酶制備了葡萄糖生物傳感器。賈能勤等研究了多巴胺(DA)和抗壞血酸(AA)在介孔碳修飾電極上的電化學(xué)和電催化行為,與玻碳電極相比,介孔碳電極顯示出快速電子轉(zhuǎn)移速度和較大的響應(yīng)電流,在AA存在條件下對(duì)DA表現(xiàn)出高選擇性和靈敏度。郭黎平等制備了介孔碳-聚合物膜修飾電極,對(duì)亞硝酸鹽還原具有一定的電催化活性;有序介孔碳修飾電極作為半胱氨酸的傳感器,檢出限為文獻(xiàn)報(bào)道中的最低值;以離子交換聚合物Nafion為分散劑,將有序介孔碳分散其中,以該分散液涂覆在玻碳電極表面制得的修飾電極,在pH值范圍2.00~10.00內(nèi),可以選擇性檢測(cè)腎上腺素(EP)而不受AA干擾;二茂鐵與介孔碳的復(fù)合材料修飾電極具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,在檢測(cè)尿酸(UA)的生物物質(zhì)時(shí)抗干擾能力強(qiáng)[51~52];介孔碳與富勒烯的復(fù)合材料修飾電極對(duì)很多無機(jī)和有機(jī)電活性物質(zhì)(如鐵氰化鉀、NADH、UA、AA、DA、EP等)的電子傳遞都有明顯的促進(jìn)作用,尤其是極大地降低了NADH的氧化過電位(與未修飾的裸電極相比)。董紹俊等利用有序介孔碳修飾電極分別固定脫氫酶和氧化酶,制備了相應(yīng)的生物傳感器。Zhu等研究了有序介孔碳糊電極對(duì)很多氧化還原物質(zhì)(如AA、UA、NADH、DA、EP和H2O2)的電催化研究,并用于固定葡萄糖氧化酶制備葡萄糖生物傳感器。曾百肇等用介孔碳CMK-3與Pt納米粒子的復(fù)合物修飾電極固定葡萄糖氧化酶,所制備的生物傳感器對(duì)葡萄糖有良好穩(wěn)定的響應(yīng)。劉寶紅課題組設(shè)計(jì)并分別制備了二維和三維高度有序的介孔碳用于固定葡萄糖氧化酶分子以研究其準(zhǔn)可逆的電子傳遞。與二維有序的介孔碳材料相比,三維有序的介孔碳材料對(duì)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更高的負(fù)載能力,其固定化的酶分子保持了更高的生物活性,所制備的葡萄糖生物傳感器表現(xiàn)出靈敏度高、響應(yīng)迅速、線性范圍寬和檢測(cè)限低等特點(diǎn)。該小組進(jìn)一步制備了具有更高對(duì)稱性和更高有序度的雙連續(xù)螺旋介孔碳(Bicontinuousgyroidalmesoporouscarbon,BGMC),并構(gòu)建了一系列具有不同孔徑的BGMC納米復(fù)合物薄膜來固定不同尺寸的蛋白質(zhì)(肌紅蛋白(Mb)和葡萄糖氧化酶(GOx))。實(shí)驗(yàn)表明BGMC的孔徑對(duì)蛋白質(zhì)固定及其電子轉(zhuǎn)移具有較大影響。這也意味著可以通過調(diào)控介孔碳的孔徑、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等來制備適宜于不同尺度生物分子的固定基質(zhì),以促進(jìn)異相電子轉(zhuǎn)移并提高固定化蛋白質(zhì)的生物電催化性能。5納米傳感技術(shù)的應(yīng)用納米技術(shù)和生命科學(xué)是21世紀(jì)最前沿的兩大學(xué)科,納米技術(shù)的介入為生物傳感器的發(fā)展提供了無窮的想象。在生物電分析化學(xué)研究和電化學(xué)生物傳感器的研制中,生物分子的固定化是一個(gè)關(guān)鍵因素。這涉及到生物分子氧化還原中心與電極之間的電連接。因此找到一種可靠且有效的方法來保持固定化生物分子的高活性同時(shí)允許電極和氧化還原活性中心之間有效的電子傳遞至關(guān)重要。納米材料具有如電學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)、電化學(xué)等諸多特異性質(zhì),同時(shí)能夠有效固定生物組分,在生物傳感器中具有極大的應(yīng)用潛力,日益引起人們的關(guān)注。總的說來,納米顆?？梢詮V泛地應(yīng)用于敏感分子的固定(納米金