野葛的超低溫保存技術(shù)

野葛的超低溫保存技術(shù)

科托納爾多圣賢是多年生落葉藤條。江西是長江中下游野葛的主要分布地區(qū),主產(chǎn)于江西上饒橫峰縣等地,藥食兼優(yōu)。葛根甘、辛、平,解饑退熱,生津止渴,透發(fā)斑疹,為治脾胃虛弱泄瀉之圣藥;食用,營養(yǎng)價(jià)值高,為滋補(bǔ)佳品。為了保存野葛的道地性,本研究參照玻璃化法保存甌柑、獼猴桃等植物,探討影響野葛莖段玻璃化法超低溫保存的一些因素。1材料和方法實(shí)驗(yàn)材料為繼代培養(yǎng)的野葛無菌苗,以帶芽莖段為材料,并用采培養(yǎng)法檢測(cè)保存后材料的成活率,從而篩選出最佳的玻璃化法超低溫保存技術(shù)體系。1.1低溫疲勞繼代生長30d的野葛的試管苗于4℃冰箱低溫鍛煉5d。1.2細(xì)胞培養(yǎng)在無菌條件下切取帶一個(gè)腋芽,長約1.5cm的莖段,轉(zhuǎn)至含5%二甲基亞砜或5%蔗糖或5%二甲基亞砜+5%蔗糖的培養(yǎng)基,置4℃冰箱預(yù)培養(yǎng)0～48h。1.3pvs2油相健全面為20%甘油+15%乙二醇+20%二甲基亞的蔗糖pvs玻璃化保護(hù)劑(PlantVitrificationSolution,PVS2)成分為30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖。預(yù)培養(yǎng)后的莖段先用0～100%的PVS2在0℃下處理30min,再用100%的PVS2在0℃下處理30min。1.4冷凍保存將玻璃化保護(hù)處理過的材料迅速放入液氮,保存1d。1.5ms培養(yǎng)液制備將材料從液氮中取出,采用4種方式化凍:4℃冰箱化凍,25℃常溫化凍,40℃水浴快速化凍,45℃水浴快速化凍90s,化凍后用含1.2mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液洗滌2次,每次10min。1.6再生苗-常綠苗生長狀況測(cè)定化凍洗滌后的野葛莖段接種到再生培養(yǎng)基,暗培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)為光培養(yǎng),記錄成活率及恢復(fù)生長的時(shí)間,并在60d時(shí)比較超低溫保存后的再生苗與常溫保存試管苗生長狀況。本實(shí)驗(yàn)均為單因子實(shí)驗(yàn),每次處理25個(gè)帶芽莖段,重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Dunnett法數(shù)據(jù)分析。使用的培養(yǎng)基均為MS+BA2mg/L+NAA1mg/L+3%蔗糖+0.5%瓊脂,培養(yǎng)溫度(25±2)℃,光照14h/d。2結(jié)果與分析2.1凍后成活率測(cè)定低溫鍛煉后的野葛莖段,用三種培養(yǎng)基,于4℃條件下預(yù)培養(yǎng)12～48h,凍后成活率(見表1)都比對(duì)照高,并且隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長,得到不同程度的提高,但低溫鍛煉超過24h時(shí),其成活率開始下降。預(yù)培養(yǎng)基,以5%二甲基亞砜+5%蔗糖的效果較好。2.2pvs2凍凍預(yù)培養(yǎng)后的莖段先用0～100%的PVS2,在0℃下處理30min,再用100%的PVS2在0℃下處理30min。液氮保存后,采用40℃水浴快速化凍。凍后的成活率見表2。可以看出應(yīng)在0℃下先用60%的PVS2過渡,然后再用100%的PVS2脫水,這樣野葛莖段的成活率最高,可達(dá)57.3%。2.3再生培養(yǎng)基成活率以PVS2為玻璃化保護(hù)劑,在液氮中保存1d后,采用不同的溫度化凍,然后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基,30d時(shí)的成活率見表3。當(dāng)化凍溫度為40℃時(shí),野葛帶芽莖段的成活率達(dá)到最大值,當(dāng)化凍溫度繼續(xù)升高至45℃時(shí),成活率又開始下降。2.4再生苗的形態(tài)測(cè)定將超低溫保存與常溫保存的野葛帶芽莖段同時(shí)接種到MS+BA2mg/L+NAA1mg/L繼代培養(yǎng)基上,前者11d開始恢復(fù)生長,13d開始長出新芽,17d長出新葉;而后者6d即可恢復(fù)生長,10d長出新芽,15d長出新葉。60d時(shí)測(cè)定再生苗的形態(tài)指標(biāo)(見表4)。二者生長狀況相似,經(jīng)Dunnett法檢驗(yàn),雖有差異,但未達(dá)顯著水平。說明用超低溫保存技術(shù)保存野葛種質(zhì)是合適的,能夠保證遺傳的穩(wěn)定性。3最佳培養(yǎng)條件的確定玻璃化超低溫(-196℃)保存是目前長期而穩(wěn)定地保存植物種質(zhì)資源的最好方法。預(yù)培養(yǎng)的目的是提高抗凍力。甌柑愈傷組織在5%DMSO的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d時(shí)存活率達(dá)到83.10%,但預(yù)培養(yǎng)超過5d后,愈傷組織有褐化現(xiàn)象發(fā)生,6d后則有部分愈傷組織開始死亡。地黃莖尖的高糖預(yù)培養(yǎng)以0.4mol/L蔗糖預(yù)培養(yǎng)3d較適宜。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,經(jīng)過5%蔗糖或5%DMSO或5%蔗糖+5%DMSO處理后,野葛莖段的存活率隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長有提高的趨勢(shì),以預(yù)培養(yǎng)24h時(shí)的存活率達(dá)到57%,但超過24h后,開始下降。這是因?yàn)镈MSO對(duì)材料生長有毒害作用,如果蔗糖濃度過高,培養(yǎng)時(shí)間過長,將導(dǎo)致細(xì)胞過度脫水,造成傷害。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明,復(fù)合預(yù)培養(yǎng)基效果較單一預(yù)培養(yǎng)基為好,與獼猴桃的研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)材料過渡和脫水對(duì)玻璃化超低溫保存,是另一重要步驟。在過渡中用低濃度的玻璃化保護(hù)劑浸潤細(xì)胞,可助提高滲透效果,防止直接投入高濃度的玻璃化保護(hù)劑時(shí)造成的滲透?jìng)?。本?shí)驗(yàn)用60%PVS2在0℃下過渡30min,再用100%PVS2在0℃下脫水30min,凍后野葛莖段,存活率最高,達(dá)57%。這與甌柑、地黃等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。玻璃化超低溫保存,還必須篩