天然植物中黃酮類化合物的研究進展

天然植物中黃酮類化合物的研究進展

黃酮類化合物廣泛分布于植物表面。絕大多數(shù)植物都能合成黃酮類化合物。它們是色原烷或色原酮的衍生物。其結(jié)構(gòu)特點是:C6-C3-C6的基本骨架;并根據(jù)中間吡喃環(huán)的不同氧化水平和兩側(cè)A、B環(huán)上的各種取代基,分為許多不同的黃酮類型。主要包括:黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、黃烷酮類、查耳酮、異黃烷酮、雙黃酮類等。在天然植物中,絕大多數(shù)黃酮類化合物以苷的形式存在,少數(shù)以游離形式存在。黃酮類化合物的生理功能多種多樣。不同的黃酮類化合物具有不同的生物活性,主要的生理活性有:維生素P樣作用、抗菌作用、抑制癌細胞的生長或抗癌作用、解痙攣作用、降低血壓作用、女性激素樣作用、抑制膽堿酯酶作用、擴張冠狀動脈的作用等。此外,還有大量研究表明黃酮類化合物有降血脂、止血、鎮(zhèn)咳祛痰、降低血管脆性、抑制血小板聚集等多種藥理作用;正是黃酮類化合物的上述生物活性引起了人們的廣泛重視。目前分析黃酮類化合物的方法主要有:分光光度法、高效液相色譜法、高效毛細管電泳法、極譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等。1黃酮類化合物的主要分析1.1總黃酮含量的測定黃酮類化合物的測定多采用硝酸鋁比色法。其基本原理為黃酮類化合物與Al(NO3)3進行絡(luò)合顯色,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)溶液,在UV510nm處測定黃酮類化合物的含量。但硝酸鋁比色法專一性較差,測定受處理過程顏色變化的影響。羅憲堂等利用該法測定了山香圓葉中的黃酮類成分的含量。為了提高硝酸鋁比色法的準(zhǔn)確度,人們對該法進行了多項改進。尉芹等發(fā)現(xiàn)硝酸鋁比色法在測定杜仲總黃酮時的主要干擾因素是綠原酸,他們采用紙層析法將樣品中的黃酮與綠原酸分離后,再用硝酸鋁比色法測定黃酮含量,從而提高了測定的準(zhǔn)確度。孫立立等以金絲桃苷為對照品,對全國10個地區(qū)的山里紅和山楂中的總黃酮進行了測定,結(jié)果各地樣品中總黃酮含量在0.84%-3.62%,與HPLC法測定的金絲桃苷含量基本正相關(guān)。劉佳佳等用硼酸—檸檬酸比色法測定了銀杏葉不同季節(jié)黃酮的含量。彭科懷等利用黃酮類化合物的鋁鹽絡(luò)合物本身具有的黃色進行比色,檢測花粉中總黃酮含量。王宗花等發(fā)現(xiàn)在陽離子表面活性劑(CTMAB)存在下,Mo6+與黃酮類化合物形成膠束配合物體系,使測定的靈敏度有了較大的提高;他們以蘆丁為對照品,在410nm波長處測定黃酮類化合物的總含量。徐燕等以黃芩苷為對照品,采用雙波長分光光度法測定黃芩總黃酮含量;測定波長為278nm,參照波長為242nm。董懷海等利用三波長比色測定方法測定大豆胚芽中大豆異黃酮的含量,發(fā)現(xiàn)利用該法可以最大限度地消除大豆異黃酮提取液中其它雜質(zhì)對大豆異黃酮測定的干擾。1.2色譜質(zhì)譜條件選擇容易實現(xiàn)方法目的,主要有以下幾種平面色譜法是色譜的一種。包括在紙上進行的紙色譜法和在薄層板上進行的薄層色譜法。由于紙色譜法的選擇性和重現(xiàn)性較差,多用于定性分析。余戟等采用高于臨界膠束濃度(CMC)的十二烷基硫酸鈉(SDS),溴化十二烷基甲基卞銨(BzBr)水溶液作展開劑,通過紙色譜法分離和檢測桑色素、楊梅黃素等8種黃酮苷和苷元,并發(fā)現(xiàn)0.01-0.02mol/L的SDS或BzBr膠束展開體系適宜于分離黃酮苷類。薄層色譜法具有設(shè)備簡單、操作方便、分離速度快等特點,但屬于離線操作。儀器以及自動化程度較差,分離是在開放式的固定相上進行,影響分離的因素較多。因此,在分辯率及重現(xiàn)性等方面不如高效液相色譜法和氣相色譜法,在較長時間內(nèi)被作為定性和半定量的手段,但與氣相色譜和高效液相色譜法相比也有自己的優(yōu)點。如固定相是一次性使用,樣品的預(yù)處理比較簡單,對分離物質(zhì)的性質(zhì)無特別限制,應(yīng)用廣泛;可同時平行分離多個樣品,測試速度快,一次操作所需溶劑量少,選擇范圍寬,并有不同展開方式,有利于不同性質(zhì)的物質(zhì)分離;在同一色譜板上可根據(jù)組分性質(zhì)選擇不同顯色劑或檢測方法進行定性或定量;薄層色譜圖像可提供原始彩色圖像,不僅便于保存原始圖像,而且薄層技術(shù)可以提供較多信息,直觀性可比性均較好等。20世紀(jì)80年代,出現(xiàn)了儀器化薄層色譜,即在高效薄層板上進行組分分離,并且薄層色譜法的每一步驟中都有一套儀器來代替手工操作可得到高質(zhì)量的色譜圖,再配以高質(zhì)量的薄層掃描儀,大大提高了定量結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。馬柏林等以十二烷基硫酸鈉(SDS)/正丁醇/正庚烷/水微乳液作為展開劑,以AlCl3乙醇溶液為顯色劑,在波長365nm紫外燈下檢視,發(fā)現(xiàn)由SDS/正丁醇/正庚烷/水微乳液按11.7/15.6/2.7/70.0的比例組成的O/W型微乳液適于分離杜仲所含黃酮。張冬冬等用硅膠G薄板(5×20cm),展開劑為苯/吡啶/甲酸(36/9/5),對照品為1%槲皮素甲醇液1mL,顯色劑為1%二氯化鋁乙醇液,在紫外光下觀察,確定黃花菜含有黃酮醇類化合物。1.3沙棘葉片黃酮含量檢測高效液相色譜(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)法具有分離效率高、分析速度快、檢測靈敏度高的特點;并且適應(yīng)于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析。高效液相色譜法是測定黃酮類化合物的有效方法。該法可以直接分析黃酮苷的含量,也可以通過水解后分析黃酮苷元含量,再通過轉(zhuǎn)化系數(shù)求得黃酮總含量。高效液相色譜中反相液相色譜在測定黃酮含量中扮演著中心角色,它是基于溶質(zhì)在極性流動相和非極性固定相表面之間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜模式。黃酮類化合物分析中C18柱用的最為普遍,過去主要分析極性較大的苷或苷元,現(xiàn)在可用于分析低極性的苷元。應(yīng)用反相HPLC分析黃酮類化合物,一般優(yōu)先選擇甲醇/水及乙腈/水體系為流動相。為了提高分離度常常需要梯度洗脫。正相系統(tǒng)中流動相一般采用乙烷或異辛烷等體系,以極性較大的乙醇、丙醇、乙腈等有機溶劑調(diào)節(jié)。由于黃酮類化合物常帶有酚羥基,在水中會部分解離,而未解離的羥基與固定相作用較強,從而導(dǎo)致拖尾。所以黃酮類化合物的反相HPLC中需要加入酸如乙酸、甲酸、磷酸或高氯酸等調(diào)節(jié)pH,抑制解離,克服拖尾現(xiàn)象。但酸對儀器具有腐蝕性。極性較大的苷元一般用C18或C18柱的反相系統(tǒng)分離。吳素林等采用反相高效液相色譜法,島津CLC-ODS(6mm×15cml.D,5μm)為反相柱,甲醇/水/磷酸(60/40/0.4,V/V/V)為流動相,流速,1.0mL/min;檢測波長,370nm;柱溫,室溫,同時測定了沙棘果肉中異鼠李素、槲皮素及沙棘總黃酮含量。侯鏡德等以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物,使用ZORBA-XC18(4.6mm×250mm),流動相為甲醇/水/冰醋酸(40/60/2,V/V),流速1.0mL/min,柱溫32℃,檢測波長280nm,測定毛竹葉中的總黃酮含量。FerasSlmadKanaze等采用反相HPLC法分離了不同的柑桔類植物果汁和藥物原料中的橙皮苷、桔皮甘、柚皮苷3種黃酮類化合物;采用四氫呋喃/水/乙酸(21/77/2,V/V/V)為流動相,C18反相柱。鄒耀洪等采用液相色譜法從楊梅葉中分離和制備了4種黃酮醇苷和一種黃酮醇,經(jīng)波譜分析確定了化學(xué)結(jié)構(gòu),并以蒽為內(nèi)標(biāo),測定了楊梅葉中5種黃酮類化合物的含量;實驗中采用LichrosorbRP-C18柱為固定相,甲醇/水/甲酸為流動相,輔之以二極管陣列紫外檢測技術(shù)。李典鵬等測定銀杏葉提取物經(jīng)酸水解后黃酮苷元含量,采用C18柱,甲醇/水/磷酸(55/44.5/0.5)為流動相,檢測波長370nm。王俊德等研究了用高效液相色譜法分析銀杏提取物中黃酮含量時幾個主要環(huán)節(jié)的操作條件,包括水解液組成,水解溫度和時間,論證了在370nm波長下檢測時,可用槲皮素一個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方便地求出槲皮素、山萘酚和異鼠李素3種黃酮的含量。水解液是5.5%(W/V)HCl甲醇溶液,在85-90℃回流1.3h;采用Bio-SiIODS5μm柱(150mm×4.0mml.D.),甲醇/0.4%磷酸水溶液(57/43,V/V)為流動相,UV-370nm檢測等。1.4超臨界二氧化碳分離超臨界流體色譜(SupercriticalFluidChromatography,SFC)成功地用于許多化合物的分析,它綜合了HPLC和氣相色譜(GasChromatography,GC)的優(yōu)點,是一種新型的分離測定技術(shù)。SFC多采用超臨界二氧化碳為流動相,這是因為二氧化碳的臨界溫度(31.1℃)接近室溫,臨界壓力(7.38MPa)不太高,且化學(xué)惰性,無毒,無腐蝕性等。超臨界二氧化碳僅適于非極性化合物的分離,對中等極性化合物的分離則需要加入極性的攜帶劑(如甲醇、異丙醇等)以增強其溶劑力;對強極性化合物分離,僅在超臨界二氧化碳中加入極性攜帶劑是不夠的,需加入另外一種極性更強的化合物。超臨界流體色譜法由于儀器價格昂貴,在我國尚未普及使用。劉志敏等利用超臨界色譜成功地分離了黃酮類化合物,研究了流動相的組成,柱條件,壓力及溫度的影響,發(fā)現(xiàn)流動相組成是影響色譜分離的最主要的因素;其次,色譜條件也是影響分離的重要因素。發(fā)現(xiàn)硅膠基質(zhì)的鍵合苯基柱比較適于極性黃酮類化合物的分離,考察了溫度和壓力對分離的影響;并在合適的色譜條件下,從銀杏葉提取物中分離黃酮類化合物。1.5電焦質(zhì)化合物高效毛細管電泳(High-perfotmanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)是一種離子域和電離子在電場驅(qū)動下,在毛細管中按淌度和分配系數(shù)不同而進行高效快捷分離的新技術(shù)。在分析中,各個被分離組分通過在線檢測方式檢測。HPCE以其高效快速、分辨率高、檢測方便、進樣量少、分離模式多的特點在生命科學(xué)、生物技術(shù)、藥物和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。毛細管電泳以其電泳遷移技術(shù)的差異可分為:毛細管區(qū)帶電泳(CapillaryZoneElectrophoresis,CZE)、膠束電動毛細管色譜(MicellaEletrokinetic,MECC)、毛細管等速電泳(CapillaryIsotachphoresis,CITP)、毛細管凝膠電泳(CapillaryGelElectrophoresis,CGE)、毛細管等電焦聚焦(ClEF)5種類型。CZE、CGE、CITP及ClEF的分析對象是可解離的物質(zhì)或帶電的物質(zhì),而MECC除了可分離上述物質(zhì)外,還能分析中性分子,適于各類物質(zhì)的分析。在黃酮類化合物的分析中,常用的是CZE和MECC,CITP很少用。毛細管區(qū)帶電泳(CZE)對樣品組分的分離是由于各組分的淌度不同而相互分離,形成一系列的區(qū)帶。每個區(qū)帶中是淌度相同的離子,但有可能是不同的物質(zhì)。它相當(dāng)于色譜法中的洗脫色譜。淌度與Q/Ma成正比(其中Q是離子的電荷,M是它的相對分子質(zhì)量,指數(shù)a不是個定數(shù),與離子形狀有關(guān))。TaoBo等用熔融石英毛細管(58.5cm×50μmI.D.),緩沖溶液為硼酸鹽(pH=10.5),運行電壓30kV,檢測波長210nm,分離分析苷草根中的黃酮類化合物。Mare-kUrba-nek等采用毛細管等速電泳(CITP)和毛細管區(qū)帶電泳(CZE)在線聯(lián)用法分離并測定金絲桃類植物的葉或花的甲醇提取物中的蘆丁、異櫟素、櫟素等黃酮類化合物。膠束毛細管電泳色譜(MECC)是在緩沖溶液中加入表面活性劑(十二烷基硫酸鈉,SDS),當(dāng)其濃度大于臨界膠束濃度(CMC)時,形成有疏水內(nèi)核,外部帶電荷的膠束。在MECC中,被分析的物質(zhì)在水相和膠束相中進行分配,溶質(zhì)在水相中的遷移受電滲流和本身電泳遷移率的支配,而在膠束中的遷移是電滲流和膠束電遷移共同作用的結(jié)果,不同物質(zhì)根據(jù)其電遷移率及分配系數(shù)的不同而被分離。朱加虹利用膠束電動毛細管色譜法分離銀杏葉提取物中的黃酮類化合物蘆丁和槲皮素,研究有關(guān)的測定條件,結(jié)果表明,以pH為8.5的50mol/L硼酸鹽溶液為緩沖液,加入35mol/L的SDS,在電壓20kV,柱溫2℃,檢測波長260nm條件下對樣品進行電泳,其中的蘆丁和槲皮素可以完全分離。ShufangWang等用熔融石英毛細管(70.0cm×7μmI.D),0.2molH3PO4,0.2molSDS,乙腈,2-丙醇為緩沖溶液,檢測波長254nm,用MECC測定EP-imediumbrevicornumMaxim中的黃酮類物。鄧永智等利用膠束毛細管色譜法將中藥銀杏浸膏中槲皮素、山萘素、異鼠李素3種黃酮分離,以SDS作表面活性劑,25mol/L硼砂/25mol/L磷酸二氫鉀/1%(V/V)甲醇作電解液。1.6進行電解電解極譜分析是在一種特殊條件下的電解分析,它的特殊性表現(xiàn)在兩個電極上,即采用了一個面積很大的參比電極和一個面積很小的滴汞電極進行電解。孫仕萍等為了測定保健食品中的黃酮含量,探討用單掃示波極譜法測定總黃酮含量的快速方法,研究發(fā)現(xiàn)在pH=8.6的Na2HPO4-KH2PO4底液中,峰電位Ep-0.74V(vs.SCE)處黃酮化合物產(chǎn)生靈敏的極譜還原波,以蘆丁為對照品,該波的二階導(dǎo)數(shù)峰電流(ip)與蘆丁濃度在0.05~1.0mg/L范圍內(nèi)呈良好的直線關(guān)系,檢出限為0.02mg/L。1.7分析測試方法,提取黃酮醇苷,將色譜加入儀器檢測,選擇合適的色譜條件,在高效液相色譜或色譜—質(zhì)譜聯(lián)用是以色譜作為分離手段,用質(zhì)譜作為檢測手段(或質(zhì)譜進一步分離,再進行質(zhì)譜檢測)。目前與質(zhì)譜聯(lián)用的主要有GC、HPLC、CE等。Xian-guoHe等采用HPLC-Mass聯(lián)用的方法,測定紅三葉草中黃酮類成分的含量。董淮海等用高效液相色譜法—電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法,直接對大豆胚芽的乙醇提取液進行檢測;根據(jù)各色譜峰的質(zhì)譜特征,在室溫提取液中鑒定出9種異黃酮,7種A組皂苷,4種B組皂苷和2種E組皂苷。馬欣等用高效液相色譜—紫外—電噴霧—質(zhì)譜(HPLC-UV-ESI-MS)聯(lián)用的方法對銀杏液中黃酮醇苷類化合物進行分析。液相色譜條件:色譜柱,ZorbaxSBC18(250mm×4.6mm,5μm);流動相,異丙醇-四氫呋喃(25∶65)A,乙腈B與水(含甲酸,?=0.5%)C的三元梯度洗脫;檢測波長350nm,流速1mL/min,以Agilent多級離子阱質(zhì)譜儀進行檢測,鑒別出12種黃酮醇苷化合物。肖貽崧等利用高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ESI-MS)直接分析了苦竹中黃酮類化合物。LC條件,色譜柱,ZORB-AXC18(25cm×4.6cm),流動相為甲醇/水(40/60),流速0.2mL/min,柱溫32℃,檢測波長280nm,自動進樣量5μL;MS的聯(lián)用條件,電噴霧離子阱,N2為殼氣,質(zhì)量掃描范圍100-1000.00m/z,分辨率0.6m/z。SariH!?kkinen等采用高效液相色譜和電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-ESI-MS)分析漿果中黃酮醇糖苷配基和黃酮醇糖苷。在HPLC-MS和HPLC-DAD分析中,均采LiChroCART柱(125mm×3mm