基于雙向電泳圖譜的心絞痛血瘀證蛋白質(zhì)組學(xué)研究

基于雙向電泳圖譜的心絞痛血瘀證蛋白質(zhì)組學(xué)研究

冠狀動脈硬化是中國人民最重要的原因。據(jù)統(tǒng)計(jì),在冠心病住院患者中,60%首要表現(xiàn)是不穩(wěn)定性心絞痛(UnstableAngina,UA)。UA已經(jīng)成為心血管內(nèi)科最常見的綜合征之一,研究冠心病不穩(wěn)定性心絞痛的防治成為臨床亟需解決的一個(gè)重大課題。血瘀證是心絞痛中常見的中醫(yī)證候表現(xiàn)。目前,心絞痛的發(fā)病機(jī)制仍然不完全清楚,尚無早期診斷的特異性標(biāo)志物。近年來,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,為研究心絞痛的發(fā)病機(jī)制和探索早期診斷的生物標(biāo)記物提供了新的思路和技術(shù)平臺。由于在心絞痛發(fā)生、發(fā)展過程中,有許多炎癥細(xì)胞因子以及有關(guān)信號通路的小分子蛋白參與,這些蛋白質(zhì)在心臟中的變化必然會通過相應(yīng)的途徑釋放至血液,引起其在血液中的濃度變化,同時(shí)也會級聯(lián)其他一些相關(guān)蛋白質(zhì)發(fā)生相應(yīng)變化,從理論上為心絞痛的血漿差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了依據(jù)。本研究采用雙向凝膠電泳(2-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)和基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)技術(shù)對心絞痛血瘀證患者血瘀證程度變化前后的血漿進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,尋找心絞痛血瘀證的相關(guān)蛋白,為進(jìn)一步尋找心絞痛血瘀證的藥物靶點(diǎn)以及探索心絞痛血瘀證的病理機(jī)制創(chuàng)造條件。1臨床數(shù)據(jù)1.1患者心絞痛療效8例心絞痛住院患者均來自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,其中男4例,女4例,平均年齡67±8歲。8例患者均有發(fā)作性心前區(qū)疼痛,服用硝酸甘油或等效品緩解,心電圖示T波改變,心肌酶不高,確診為“冠心病不穩(wěn)定性心絞痛”,中醫(yī)辨證為氣虛血瘀,并有陰虛癥狀。入院兩周后主訴:心絞痛未再次出現(xiàn)或癥狀減輕,發(fā)作頻率減少,持續(xù)時(shí)間縮短。都在兩次采血期間服用了活血化瘀中藥。1.2不穩(wěn)定性心絞痛診斷和治療建議標(biāo)準(zhǔn)均符合美國心臟病學(xué)院/美國心臟學(xué)會/美國醫(yī)師學(xué)院及美國內(nèi)科學(xué)會聯(lián)合議定的《慢性穩(wěn)定型心絞痛診療指南(1999年)》以及中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會2000年制訂的“不穩(wěn)定性心絞痛診斷和治療建議”標(biāo)準(zhǔn)。血瘀證診斷符合2002年國家食品與藥品監(jiān)督管理局《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》以及《冠心病中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》。1.3中醫(yī)病因病:主要有3個(gè)月內(nèi)排除急性心肌梗死、心肌炎、心臟神經(jīng)官能癥、肋間神經(jīng)痛患者;其他疾病引起的心絞痛,如風(fēng)濕熱、梅毒、先天性冠脈畸形、肥厚型心肌病、主動脈瓣狹窄或關(guān)閉不全者;合并有腦中風(fēng)、糖尿病、肺部感染、腎炎、腎功能衰竭、泌尿系感染、風(fēng)濕病;肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病及骨關(guān)節(jié)病者;妊娠期或哺乳期患者,過敏體質(zhì)患者。2材料和方法2.1血清edta抗凝8例患者均于入院2天內(nèi)及血瘀證程度變化后,分別取清晨空腹肘靜脈血2ml,EDTA抗凝,4℃,3000轉(zhuǎn)/min,離心10min。取上清,分裝,-80°C保存。2.2試劑和試劑pH值4-7固相PH梯度干膠條(IPG)、IPGbuffer(pH4-7)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DTT)、礦物油、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍(lán)R350購自美國GE公司,過硫酸銨(AP)、瓊脂糖(Agarose)、甘氨酸(Glycine)購自美國Amresco公司,其它試劑購自北京試劑公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子水。2.3儀器、設(shè)備和測試設(shè)備EttanIPGphorⅡ等電聚焦儀、EttanDALTsix雙向垂直電泳儀、MultiTempⅢ溫控循環(huán)水浴、EPS601電源,均為美國GE公司產(chǎn)品。質(zhì)譜儀為bruker公司Ultraflextof/tof。2.4分析軟件Imagemaster2DPlatinum6.0,GEhealthcare。2.5蛋白質(zhì)上樣和上樣參照Amersham公司雙向電泳手冊和Gorg等方法進(jìn)行。采用IPG預(yù)制膠條24cmpH值4-7。用Bradford法進(jìn)行蛋白定量,再用水化液調(diào)整到合適濃度后上樣。蛋白質(zhì)上樣量1mg,梯度升壓,等電聚焦總伏小時(shí)為100kVh。平衡后膠條轉(zhuǎn)移至13%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS)上進(jìn)行第2相電泳。16℃恒溫,采用恒功率電泳,開始時(shí)2.5W/gel,1Hr;再用15W/gel至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部邊緣。每個(gè)樣本至少重復(fù)電泳3次,以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。2.6那是凝膠電泳結(jié)束后,凝膠固定過夜,R350染色液加熱至90℃染色10min,脫色至背景透明。2.7凝膠的點(diǎn)檢測及匹配凝膠通過UMAX2100XL掃描,膠圖數(shù)據(jù)存儲后,采用Imagemaster2DPlatinum6.0軟件進(jìn)行凝膠的蛋白點(diǎn)檢測及匹配,配合三維圖象及人工校對等方法,以保證點(diǎn)檢測及匹配的準(zhǔn)確性。2.8蛋白質(zhì)的測定方法切割蛋白質(zhì)點(diǎn)置于離心管中,進(jìn)行膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解后,將從蛋白質(zhì)差異點(diǎn)抽提所得的肽段通過bruker質(zhì)譜儀進(jìn)行分析,獲取蛋白樣品的肽質(zhì)量指紋圖(由北京華大蛋白質(zhì)組研發(fā)中心完成),最后應(yīng)用Mascot軟件在人類蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(NCBI、SWISS-PROT)中搜尋,獲得蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。3結(jié)果3.1差異點(diǎn)分析經(jīng)Imagemaster2DPlatinum6.0軟件分析,根據(jù)3倍差異表達(dá)做為標(biāo)準(zhǔn),共檢測出16個(gè)差異點(diǎn)。主要的5個(gè)差異區(qū)域見圖1,主要差異點(diǎn)具體見圖2和圖3。3.2血藥濃度與患者血清中pahsg-paoa-i、paras蛋白表達(dá)的變化對差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行酶解、質(zhì)譜分析,得到6張肽質(zhì)量指紋圖譜,質(zhì)譜圖的質(zhì)量較高,峰信號較強(qiáng),見圖4。用Mascot軟件搜索鑒定出6種蛋白質(zhì)。其中載脂蛋白J(Clusterin)、載脂蛋白A-I(ApoA-I)在血瘀證程度變輕后表達(dá)增加,而纖維蛋白質(zhì)原β鏈(Fibrinogenβchain)、維生素D結(jié)合蛋白(VitaminD-BindingProtein)、結(jié)合珠蛋白β鏈(Haptoglobinβchain)、白蛋白亞型(Albuminisoform)在血瘀證程度變輕后表達(dá)降低。蛋白質(zhì)譜搜庫鑒定結(jié)果見表1。4生物組織學(xué)檢測據(jù)估計(jì),人類血漿蛋白質(zhì)組由上萬種蛋白組成,它們與人體的狀態(tài)密切相關(guān),疾病發(fā)生時(shí),人體器官病理變化的產(chǎn)物可釋放入血,導(dǎo)致血漿蛋白在結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的改變。因此,研究在疾病狀態(tài)時(shí)人體血漿蛋白質(zhì)組變化有著非常重要的意義。Albumin是人體血液中含量最豐富的蛋白質(zhì),具有許多重要的生理功能,能和許多化學(xué)物質(zhì)以不同方式結(jié)合,并攜帶這些物質(zhì)通過血液在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、運(yùn)輸、分配和代謝。各種疾病通過不同的方式影響Albumin的含量和構(gòu)向,如許多急慢性疾病都可引起血漿白蛋白濃度降低;心肌缺血發(fā)作時(shí),部分Albumin的N-末端受損或被銅占據(jù),可以做為急性心肌缺血的一種生化標(biāo)志物。Haptoglobin做為一種急性期蛋白,在多種應(yīng)激狀態(tài)時(shí)血漿濃度升高。Fibrinogen是肝臟合成的一種血漿球蛋白,是體內(nèi)重要的凝血因子。近年來大量臨床及流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),血漿Fibrinogen水平升高是冠心病(CHD)發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素和炎癥活性的標(biāo)志,并且與冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Fibrinogen升高提示機(jī)體纖溶活性降低,可增加血液黏稠度,促進(jìn)血小板聚集和血栓形成,增大粥樣斑塊,甚至堵塞管腔。VitaminDBindingProtein是肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的約55kDa的蛋白質(zhì),在血清中含量豐富,具有多項(xiàng)生理功能。它不僅結(jié)合維生素D和肌動蛋白,還增強(qiáng)C5a等物質(zhì)對中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的趨化活性,并且激活巨噬細(xì)胞。ApoA-I是高密度脂蛋白的主要蛋白成分,而HDL水平與冠心病之間的負(fù)相關(guān),大量臨床和流行病學(xué)研究證實(shí)ApoA-I的降低是心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血漿中Clusterin存在于高密度脂蛋白和極高密度脂蛋白(VHDL)中,以VHDL中含量最多。Clusterin能促進(jìn)泡沫細(xì)胞內(nèi)的膽固醇外流,并能保護(hù)氧化應(yīng)激所造成的損傷,對HDL抗動脈粥樣硬化起著協(xié)同的作用。綜上所述,本研究采用2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)對心絞痛患者血瘀證程度變化前后血漿進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,建立了相應(yīng)的雙向電泳、質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析技術(shù)路線,初步發(fā)現(xiàn)了Clusterin、ApoA-I、Fibrinogenβchain、VitaminD-BindingProtein、Haptoglobinβchain、Albuminisoform在心絞痛血瘀