飛秒激光在生命科學中的應(yīng)用

飛秒激光成像技術(shù)

在生命科學中的應(yīng)用

馬萬云原子分子納米科學教育部重點實驗室2007實驗室科研探究???…飛秒激光的特點脈沖很窄：幾個飛秒，1fs=10-15s，1／1000萬億秒，比利用電子學方法所獲得的最短脈沖要短幾千倍。瞬時功率很高：>1012W。能聚焦很細：能聚焦幾百nm,比頭發(fā)的直徑還要小的空間區(qū)域，使電磁場的強度比原子核對其周圍電子的作用力還要高數(shù)倍。應(yīng)用廣泛：外科手術(shù)、醫(yī)學成像、生物活體檢測、病變早期診斷……重點:飛秒激光雙光子成像技術(shù)對大、厚、活的生物樣品的四維實時觀測科研項目植入前胚胎發(fā)育遺傳學診斷的分子雷達-光學相干技術(shù)系統(tǒng)的研究－－國家973計劃（2002-2007）001CB510307，正在進行。活細胞中生物大分子相互作用的四維可視化觀測--國家自然科學基金項目（2005-2007）10474054，正在進行。高靈敏實時原位觀測方法相關(guān)物理、化學基礎(chǔ)問題及其在生命科學中的應(yīng)用--教育部科學研究重大項目(2006-2008)306020，正在進行。立項背景要深入地了解復(fù)雜的生物系統(tǒng)需要更量化的生物學“Bio-X”當生物學日益需要更豐富的數(shù)據(jù)時，它就愈加要求具有物理科學特點的分析方法和計算方法。由于生命現(xiàn)象的復(fù)雜性，直觀、形象的檢測技術(shù)在生命科學的研究中起著非常重要的作用。可視化檢測手段的出現(xiàn)和發(fā)展，使人們能夠在一定程度上直接地對生命過程進行觀測。物理成像技術(shù)研究是目前bio-X研究中的熱點課題。國家973課題“植入前胚胎發(fā)育遺傳學診斷的分子雷達－光學相干技術(shù)系統(tǒng)研究”。細胞大三維脆弱低損發(fā)育動態(tài)四維成像植入前胚胎發(fā)育過程數(shù)據(jù)直觀的四維量化研究內(nèi)容與特點

內(nèi)容：建立胚胎細胞四維成像手段,觀察小鼠植入前胚胎發(fā)育過程的現(xiàn)象，以獲得植入前胚胎的遺傳診斷信息。特點：以直觀的四維量化的數(shù)據(jù)表達一個生物學發(fā)育過程的信息。物理原理單光子激發(fā)，采用普通連續(xù)激光采用較高功率的超短脈沖激光（幾十fs的脈寬，1fs=10-15秒）激發(fā)熒光物質(zhì)，使之躍遷到激發(fā)態(tài)時能同時吸收兩個光子?；罴毎乃木S成像技術(shù)共聚焦成像技術(shù)雙光子成像技術(shù)共聚焦顯微鏡原理

Confocallaserscanningmicroscopy(CLSM)位于共軛焦平面的小孔（共聚焦針孔），阻擋了來自焦平面以外的信號共聚焦針孔的直徑直接控制了光學切片的厚度為什么要用超快激光？σ：two-photonabsorptioncrosssection

(一般為10-50cm4s/光子)單光子激發(fā)熒光在整個照明區(qū)均產(chǎn)生熒光雙光子激發(fā)熒光僅在焦點附近產(chǎn)生熒光單光子激發(fā)的能量特性Power-linedDependenceofOne-Photon-excitedFluorescence雙光子激發(fā)的能量特性Power-SquaredDependenceofTwo-Photon-excitedFluorescence雙光子與共聚焦的比較共同點：

分辨率高，信噪比高，光學切片，三維重構(gòu)共聚焦缺點雙光子優(yōu)點紫外光近紅外光穿透深度淺穿透深度深光毒性大光毒性小光漂白區(qū)域大光漂白小散射熒光丟失熒光收集效率高樣品活

穿透深

觀測時間長雙光子的優(yōu)勢共焦顯微技術(shù)與雙光子技術(shù)成像比較四維成像原理（三維空間，一維時間）激光共聚焦顯微鏡在同一時刻對樣品中的一點成像這一點的像在屏幕上顯示為一個像素為獲得樣品的二維圖像，激發(fā)光的聚焦點必須在樣品上移動從點到二維圖像掃描鏡驅(qū)動激發(fā)光束以線的方式移動掃描過程中得到的像素構(gòu)成最終的二維圖像

聚焦光錐樣品X/Y圖像XY通過激發(fā)光的水平移動（X/Y），得到樣品中某一特定層面的二維圖像這一層面代表了樣品中的一個光學切片無物理接觸的采集要獲得樣品的三維信息，激發(fā)光聚焦點不僅要在XY方向上移動，還要在Z方向上移動通常，在掃描一個XY平面后，通過載物臺的垂直移動使激發(fā)光聚焦點在Z方向上移動結(jié)果是一個三維數(shù)據(jù)序列，包含著若干幅代表樣品中不同光學切片的XY圖像X/Y/Z序列Z軸驅(qū)動從點到三維圖像飛秒激光雙光子激發(fā)熒光裝置FemtosecondLaserSystemScanHeadPMTFilterBSCompPMT倒置顯微鏡、掃描系統(tǒng)、探測系統(tǒng)（MRC-1024，美國伯樂公司Bio-Rad）激發(fā)光源為鎖模飛秒脈沖摻鈦藍寶石激光器（Tsunami，SpectraPhysics）。脈沖寬度70fs左右，重復(fù)頻率82MHz，波長可調(diào)范圍720~1080nm，輸出的平均功率可調(diào)，最高可達1W。

實驗對象的選擇■小鼠一直是生物學和醫(yī)學研究中重要的模型動物，也是基因組測序的重點對象之一。■2002年12月5日國際老鼠基因組測序聯(lián)盟成功破譯了小鼠基因組序列?；驕y序表明，人類與小鼠共享著80％的遺傳物質(zhì)和99％的基因?！鐾ㄟ^研究小鼠胚胎，將非常有助于了解人類自身，有助于了解人類的胚胎發(fā)育過程及基因變異與疾病的關(guān)系，為臨床上人胚胎的植入前遺傳診斷等提供重要的信息。成果介紹小鼠受精卵細胞Ca2+和DNA的四維分布圖

小鼠受精卵細胞的有絲分裂過程

8細胞階段緊密化與去緊密化過程

植入前胚胎細胞凋亡現(xiàn)象觀測GFP轉(zhuǎn)染-擬南芥生長過程觀測小鼠受精卵細胞Ca2+和DNA的四維分布圖我們用飛秒激光雙光子激發(fā)熒光技術(shù)觀測到小鼠受精卵細胞Ca2+（indo-1染色）和DNA(hoechst染色，紅色)的四維分布圖圖中左邊為雙光子為熒光圖，右邊為透射圖；每幅熒光圖之間的時間間隔為30分鐘；熒光圖中橢圓內(nèi)紅色的兩排為染色體，由圖01-05可以看出細胞以及細胞內(nèi)染色體和細胞質(zhì)的旋轉(zhuǎn)運動集細胞的拉長。圖片大小92.4×92.4μm小鼠受精卵細胞的有絲分裂過程Time-lapseimagingofthecleavageofthemousezygote

Time-lapseimagingofthecleavageofthemousezygote.Pixelsize:512×512(92.4×92.4μm),timebetweeneachtwoimagesisabout10min.Thesplittingofthechromosomesat0.455μm/minandthemorphologicalchangingofthecellareobvious,whiletheorientationofchromosomesplittingisnotconsistentwithorientationofthezygote’smorphologicalsplitting.Red,Hoechst33342stainingofchromatin;Green,indo-1stainingofcalcium(artificialcolour).我們用飛秒激光雙光子激發(fā)熒光技術(shù)觀測到小鼠受精卵細胞的有絲分裂過程

圖中紅色的逐漸分開的兩排為染色體，每兩幅圖之間的時間間隔為10分鐘，從圖上我們可以看到細胞內(nèi)染色體分開的過程以及細胞形態(tài)的變化過程。分裂速度0.455μm/min8細胞階段緊密化與去緊密化過程八細胞期胚胎緊密化與去緊密化的觀測緊密化（compaction）：八細胞期松散的細胞之間突然通過細胞擠壓連接形成致密的球體

胚胎發(fā)育過程中第一次在形態(tài)和分化潛能開始出現(xiàn)本質(zhì)的區(qū)別Fura-2，Hoechst33342stainingObjective:20×，F(xiàn)rame:343×343μm去緊密化過程每張小圖大小44X40um緊密化過程每張小圖大小66X60um3Dimagesof8-cellstage

緊密化后腔的形成Lighttransmittedimage(upperleft)Montageofopticalsectionsfromuppertobottom(right)Fura-2staining植入前胚胎細胞凋亡現(xiàn)象觀測植入前胚胎中細胞凋亡的研究apoptosis細胞收縮染色體濃縮、凝聚細胞器減少細胞膜出泡凋亡小體膜完整無炎癥

凋亡是生物體發(fā)育過程中的重要現(xiàn)象凋亡過程示意圖

細胞凋亡（programmedcelldeath,PCD）細胞自主的、有序的死亡

小鼠植入前胚胎中細胞凋亡現(xiàn)象Hoechst33342(MolecularProbes）stainingobject:40XZoom：2.00Boxsize：512×512(171.9μm×171.9μm)Pixelsize：0.336μm/pixel早期胚泡期透視圖、熒光圖和3D重構(gòu)量化模型圖Apoptosisbody我們用飛秒激光雙光子激發(fā)熒光技術(shù)觀測到小鼠植入前囊胚階段胚胎中凋亡細胞(粉紅色)的四維分布圖。凋亡小體凋亡小體空間量化模型3D旋轉(zhuǎn)圖植入前胚胎細胞凋亡現(xiàn)象觀測

Apoptosisinthemousepreimplantationembryos凋亡小體在胚胎4個球殼區(qū)域的分布比例凋亡絕大部分分布于胚胎的外圍（外面兩個球殼），最可能發(fā)生于滋養(yǎng)外胚層（近70%），與文獻理論預(yù)測一致凋亡小體的殼層分布比例等厚球殼層囊胚腔ICM（內(nèi)細胞團）TE（滋養(yǎng)外胚層）GFP轉(zhuǎn)染-擬南芥生長過程觀測實驗意義擬南芥：生物學研究的模式