(課件)-從基因組學、系統(tǒng)生物學到轉化醫(yī)學-高血壓發(fā)病機制研究趨向

從基因組學、系統(tǒng)生物學

到轉化醫(yī)學

-高血壓發(fā)病機制研究趨向

朱鼎良上海市高血壓研究所從基因組學、系統(tǒng)生物學

到轉化醫(yī)學

-高血壓發(fā)病機制研究1近代生命科學研究的發(fā)展趨勢大科學時代在傳統(tǒng)生物學基礎之上集數(shù)學、統(tǒng)計、工程學、計算機信息科學的交叉綜合、理論和實驗相結合，在研究視角、思路、組織架構上大變革跨團隊、跨學科、跨國界合作科學前沿技術基因組學、干細胞、再生醫(yī)學、分子影象、納米技術等轉化醫(yī)學3P時代（預測、預防、個體化醫(yī)療）

近代生命科學研究的發(fā)展趨勢2復雜性狀疾病近十多年研究策略疾病基因組學研究

國家973項目、國家863、科技部重大專項（1997-2004年）系統(tǒng)生物學研究

國家973項目（2005-2009年）轉化醫(yī)學研究復雜性狀疾病近十多年研究策略疾病基因組學研究3基因組學研究-一種嶄新的研究視角從單基因到全基因組人類基因組計劃（HGP)基因組單倍體圖譜計劃（HapMapproject）基因組學研究-一種嶄新的研究視角4-O'DonnellCJ,NabelEG.CircCardiovascGenet2008;1:51-O'DonnellCJ,NabelEG.C5GWASsamplesMetaanalysiswithothersphenotypesSNPsCHARGE29136BPgen(34433)Hyertension,SBP,DBP2.5millionsGlobalBPgen34433113250SBP,DBP2.5millions2successfulGWASstudiesonBP

（P<5x10-8）GWASsamplesMetaanalysiswith6CHARGECHARGE

+BPgenSBPDBPHTCHARGEBPgenCYP17A1CSK11SNPs8SNPsSH2B3ATXN2CHARGECHARGE

+BPgenSBPDBPHTCHA7高血壓基因研究現(xiàn)狀與未來

現(xiàn)狀

1.關聯(lián)研究和連鎖分析未能發(fā)現(xiàn)高血壓易感基因及其變異；2.GWAS研究發(fā)現(xiàn)的血壓相關位點,其對人群血壓的影響及其微弱(<1mmHg),只能解釋人群血壓變異的不到0.2%；3.對GWAS能否揭示高血壓遺傳基礎,存在不同見解

高血壓基因研究現(xiàn)狀與未來8高血壓基因研究現(xiàn)狀與未來

對高血壓GWAS的評介(正方)

1.在現(xiàn)有GWAS研究結果基礎上,尋找致病基因變異,開展基因功能研究；2.進行更大規(guī)模的meta分析,發(fā)現(xiàn)更多作用微弱的常見基因變異；“InternationalConsortiumforBP-GWAS”(>70000例)3.不同人種、人群的血壓GWAS研究“AGENBP-GWAS”。-DominiczakAF,etal.Hypertens2010;56:1017

高血壓基因研究現(xiàn)狀與未來9高血壓基因研究現(xiàn)狀與未來

對高血壓GWAS的評介(反方)

1.GWAS研究未能揭示高血壓的遺傳結構、未發(fā)現(xiàn)致病基因變異、未發(fā)現(xiàn)新的發(fā)病機制、未發(fā)現(xiàn)新的治療靶點、未發(fā)現(xiàn)臨床有用的遺傳標記；2.需要開發(fā)新一代研究技術和策略;3.重視少見基因變異(raregeneticvariants)對血壓的作用。

-Kurtz.Hypertens2010;56:1021

高血壓基因研究現(xiàn)狀與未來10-O'DonnellCJ,NabelEG.CircCardiovascGenet2008;1:51-O'DonnellCJ,NabelEG.C11系統(tǒng)生物學-一種嶄新的研究思維方式

從單一組分到系統(tǒng)網(wǎng)絡調控

系統(tǒng)生物學是研究一個生物系統(tǒng)中所有組成成分（基因、mRNA、蛋白質和代謝物小分子等）的構成以及在特定條件下相互作用的學科。其核心是整體性研究和系統(tǒng)性研究，“整合”是系統(tǒng)生物學的靈魂。這是有別于迄今為止所有其他生物學分支學科的思維和研究方式，是一種嶄新的思想。它既關心對一個系統(tǒng)中所有組分及組分之間相互關系的發(fā)現(xiàn)，又致力于將組分——相互作用——網(wǎng)絡調控——系統(tǒng)行為有機地整合在一起，體現(xiàn)出系統(tǒng)的新特征。系統(tǒng)生物學-一種嶄新的研究思維方式從單一12系統(tǒng)生物學研究思路

在闡明全部參與生物系統(tǒng)作用的生物分子組分的基礎上，進而搞清參與功能表現(xiàn)的模體（motif）、代謝途徑（pathways）和信號通路（signaling）,然后選擇某些與復雜性狀疾病相關的系統(tǒng)，搞清系統(tǒng)中模體參與代謝途徑（pathways）和/或信號通路（signaling）調節(jié)的網(wǎng)絡結構（模件，modules），最后由不同網(wǎng)絡結構構建完整的網(wǎng)絡組織（organization）。系統(tǒng)生物學研究思路在闡明全部參與生物系統(tǒng)作用13系統(tǒng)生物學研究方法

建立關鍵的系統(tǒng)分析和整合分析的設計和技術平臺。主要包括實驗分子生物學（濕實驗）和計算機生物學(干實驗)技術平臺。前者以發(fā)展微量、精確和大規(guī)模分離、鑒定、監(jiān)測和系統(tǒng)擾亂及其功能評價系統(tǒng)為主要目標，后者以生物模擬，提出假設及進行系統(tǒng)功能預測為主要任務。通過“干”、“濕”結合，建立具有統(tǒng)一標準和語言的系統(tǒng)形態(tài)。系統(tǒng)生物學研究方法建立關鍵的系統(tǒng)分析和整合14Guyton數(shù)學模型

人體長期血壓調控的定量分析循環(huán)系統(tǒng)調節(jié)模型(多變量、非線性的大系統(tǒng)）400多個生理變量354個功能塊18個子系統(tǒng)系統(tǒng)內輸入-輸出關系、反饋關系用框圖表示數(shù)字模擬、計算機分析：接點、常數(shù)、變量上下限，時間常數(shù)，變量間關系壓力置定點的調控：腎臟Guyton數(shù)學模型

人體長期血壓調控的定量分析循環(huán)系統(tǒng)調節(jié)15Physiologyandgenomics:towardsystemsbiology

Thelasttenyearshaveseenanunprecedentedmergeofphysiologyandgenomics.Whilethefieldofphysiologicalgenomicsisstillveryyoung,theintroductionoftheconceptofsystemsbiologypromisestopropelphysiologicalgenomicstoawholenewlevel.Inthisbriefarticle,weoutlinedsomeofthegreatopportunitiesandchallengesforphysiologistsatthisexcitingtimeofphysiologicalsciences,andusedourownexperiencefromthelasttenyearsasanexampletodiscusshowwecouldexpandandgobeyondthecombinationofphysiologyandgenomicstoachieveasystemsunderstandingofbiology.-CowleyA.ActaPhysiologicaSinica,2006,58:1-4Physiologyandgenomics:towar16生理學與基因組學-走向系統(tǒng)生物學生理學與基因組學-走向系統(tǒng)生物學17國內高血壓機制系列性研究舉例geneticstudy(associationstudy,GWAS)RAS(AngIIreceptor,ACE2)vascularremodelingCapsaicin/TRPV1Channelrenaldopaminereceptor-GRK4EETsTRP/KYNpathwayH2S國內高血壓機制系列性研究舉例geneticstudy(a18FromBenchtoBedside,

FromBedsidetoCommunity

T1,is“thetransferofnewunderstandingsofdiseasemechanismsgainedinthelaboratoryintothedevelopmentofnewmethodsfordiagnosis,therapy,andpreventionandtheirfirsttestinginhumans.”T2,is“thetranslationofresultsfromclinicalstudiesintoeverydayclinicalpracticeandhealthdecisionmaking.”SomeauthoritiesdivideT2intoT2includesguidelinedevelopment,meta-analyses,andsystematicreviews,whereasT3includesdisseminationandimplementationresearch.

LauerMS,etal.Circulation2010;121:929-933FromBenchtoBedside,

FromB19NIH資助轉化醫(yī)學的目標1.buildinganationalclinicalandtranslationalresearchcapacity,2.providingopportunitiesfortrainingandcareerdevelopment,3.enhancingconsortium-widecollaborations,4.Improvingcommunityhealththroughresearch,5.advancingT1toacceleratethetranslationofbasicsciencediscoveriestoclinicaltesting.-LauerMS,etal.Circulation2010;121:929-933NIH資助轉化醫(yī)學的目標1.buildinganat20

T1:ConnectingBasicandClinicalResearch

基礎：“Omics”產(chǎn)生的大量資料,對疾病的分子、基因和細胞基礎的認識取得巨大進步挑戰(zhàn)：對大量復雜的基因型和表型數(shù)據(jù)進行整合、分析和分享，使之發(fā)揮最大作用

T1:ConnectingBasicandClin21T2:BridgingResearchandPractice

Implementationresearchtakesinterventionsthataregenerallyacceptedasbeneficialandaddressestheirextensionoradaptationtospecificpopulationsorsettings,testingavarietyofeducationalapproaches,behavioraltechniques,andenvironmentalororganizationalstrategies.Thestudypopulationscancomefromavarietyofsettingsandothercommunitysettings-LauerMS,etal.Circulation2010;121:929-933T2:BridgingResearchandPrac22轉化研究:一種嶄新的研究理念

和實施體系打破基礎與臨床的隔閡從”小作坊式”研究走向大規(guī)模聯(lián)合研究“consortium”全面規(guī)劃、資源共享轉化研究:一種嶄新的研究理念

和實施體系打破基礎與臨床的隔23(課件)-從基因組學、系統(tǒng)生物學到轉化醫(yī)學-高血壓發(fā)病機制研究趨向24轉化醫(yī)學：我們準備好了嗎？研究資料（基因型和表型）和轉化靶標臨床和社區(qū)研究隊列Consortium和network科學規(guī)劃、共享機制轉化醫(yī)學：我們準備好了嗎？研究資料（基因型和表型）和轉化靶25高血壓新定義GilesTD,etal.JClinHypertens.2009;11:611-614.

高血壓是一個由多種復雜和相關因素導致的、逐漸進展的心血管綜合征。這一綜合征的早期標志常出現(xiàn)在血壓持續(xù)升高以前，所以不能僅依據(jù)個別血壓值進行高血壓分類。疾病進展與心血管功能和結構異常密切相關，進而引起心臟、腎臟、大腦、血管和其它靶器官損害，導致過早發(fā)生心血管事件和死亡。高血壓新定義Giles26IntermediateLesionEarlyVascularAgeing(EVA)

AtherosclerosisandarterialstiffeningFoamCellsFattyStreakAtheromaFibrousPlaqueComplicatedLesion/RuptureFromFirstDecadeFromThirdDecadeFromFourthDecadeGrowthoftheLipidCoreSmooth

MuscleandCollagenThrombosisEndothelialDysfunction-NilssonPM,LaurentS,etal.Hypertension2009;54:3-10IntermediateEarlyVascularAge27血管老化(vascularaging)生理性血管老化隨年齡增長,動脈壁彈性蛋白斷裂、膠原蛋白增加，動脈壁病變，動脈僵硬度增加,病理性血管老化在心血管危險因素的作用下，血管壁氧化應激、慢性炎癥、脂質沉積、加速血管老化-NilssonPM,LaurentS,etal.Hypertension2009;54:3-10血管老化(vascularaging)生理性血管老化28篩查EVA、CVD早期防治對有早發(fā)CVD家族史的成員應進行EVA,RF篩查ADAM(aggressivedecreaseofatherosclerosismodifiers)-NilssonPM,LaurentS,etal.Hypertension2009;54:3-10篩查EVA、CVD早期防治對有早發(fā)CVD家族史的成員應進行E29StartofinterventionwithADAMinpatientsatincreasedcardiovascularrisk-NilssonPM,LaurentS,etal.Hypertension2009;54:3-10StartofinterventionwithADA30血管老化的防治-生活方式改善和藥物治療

生活方式改善:減輕體重、低鹽攝入、限酒等

藥物：降壓藥、調脂藥、治療糖尿病藥

使動脈僵硬度降低-NilssonPM,LaurentS,etal.Hypertension2009;54:3-10血管老化的防治-生活方式改善和藥物治療生活方式改善:31血管老化的防治-研制中的藥物AGEbreaker

Alagebrium(ALT711)

端粒酶激活劑farnesyltransferaseinhibitors上調laminA生成-NilssonPM,LaurentS,etal.Hypertension2009;54:3-10

血管老化的防治-研制中的藥物AGEbreaker32謝謝謝謝33中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）第一階段——方法（小樣本，嚴格入組標準）

病例1）原發(fā)性高血壓患者：SBP≥140mmHg和/DBP≥90mmHg，

（447例）或正在服用降壓藥物；2）具有明確的高血壓家族史，家族中至少兩人患有高血壓??；3）發(fā)病年齡>30歲；4）體質量指數(shù)（BMI）<25kg/m2;5）不具有糖尿病家族史，空腹血糖<7.0mmol/L;6）排除繼發(fā)性高血壓，心力衰竭，肝腎功能衰竭，惡性腫瘤。

對照1）未被診斷過高血壓病，且血壓<120/80mmHg；

（455例）2）年齡>40歲；3）BMI<27kg/m2,空腹血糖<7.0mmol/L;4）排除糖尿病，心臟疾病，腎臟疾病，惡性腫瘤。

中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）第一階段——方法34中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）第一階段——方法

芯片：IluminaHuman610-Quad,620,901SNPs篩選位點的質量控制標準:

最小等位基因頻率MAF>1%;

基因型檢出率>=97%(MAF<5%的SNP>=99%)

對照組的Hardy-Weinberg平衡檢驗p>1e?5符合質量控制標準的SNP共有590,761個。人群結構評估：主成分分析顯示研究所用高血壓患者及對照來自同一人群。

中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）第一階段——方35中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）SNPIDChrPositionNearestGenePMAFBetas.e.SBPrs13298109983099052TLE12.60E-060.02021.264.49rs17356973983117979TLE13.33E-060.01921.654.63rs7869544983118656TLE13.33E-060.01921.654.63rs26227901839314266SYT45.78E-060.3756.061.33rs19918671681076729CDH137.01E-060.3026.391.41rs1120367983145600TLE17.58E-060.02219.554.34rs6141008209618903PAK78.65E-060.194-7.441.66rs22566631839359461SYT49.30E-060.3775.931.33DBPrs20876251063787762ZNF3651.48E-060.1435.551.14rs70926641063775327ZNF3652.50E-060.1445.421.14rs172466692105449596LOC7289663.08E-060.0627.811.66rs38648111063768882ZNF3653.12E-060.1445.381.15rs25722721839294951SYT43.59E-060.4333.760.81rs70865451063756530ZNF3653.63E-060.1445.331.14rs26227901839314266SYT44.16E-060.3753.840.83rs121210451168128695SCYL34.33E-060.02112.392.68rs176036661168122652SCYL34.33E-060.02112.392.68rs22566631839359461SYT45.38E-060.3773.800.83rs6827904425703853LOC6454816.94E-060.01514.903.29rs6839155425717843LOC6454816.94E-060.01514.903.29rs11579641839317376STY48.12E-060.3623.730.83HTrs27126724163569034FSTL52.26E-060.3340.540.11rs10617691949044506ZNF4042.78E-060.2140.620.13rs28839461949044528ZNF4042.78E-060.2140.620.13rs105140901869645111FBXO154.43E-060.131-0.730.16rs23564011949013689LYPD57.35E-060.2150.590.13第一階段——結果（與高血壓，血壓升高相關的位點）共發(fā)現(xiàn)26個與高血壓發(fā)生或血壓升高相關的P值在10-5以下的基因內SNP系統(tǒng)生物學研究方法中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）SNPIDChr36中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）第二階段（驗證）——方法The96.96DynamicArray

FLUIDIGM?EP1Software

中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）第二階段（驗證）—37中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）第二階段（驗證）——樣本7039例樣本（高血壓患者3680例，對照3259例）中國人群高血壓全基因組關聯(lián)研究（GWAS）第二階段（驗證）—382q14~23KYNU2001-2004年已經(jīng)完成的研究內容

中國人群高血壓定位區(qū)域2q14-q23內26個候選基因SNP檢測和小樣本關聯(lián)分析提示，KYNU基因2個cSNP與高血壓有關家系基因型不一致同胞對研究發(fā)現(xiàn)，Arg188Gln與血壓水平相關病例對照關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，Lys412Glu與高血壓發(fā)生相關KYNU

從基因到整體研究:TRP-KYNUPathway2q14~23KYNU2001-2004年已經(jīng)完成的研究內容39KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究漢族高血壓家系全基因組掃描，將EH易感基因定位在2q14一q23區(qū)域內對該區(qū)域內的犬尿氨酸酶基因（KYNU,2q22.2)內49個常見SNP(MAF>5%)進行篩查，未發(fā)現(xiàn)與高血壓相關的位點。KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究漢40KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究對犬尿氨酸酶基因進行全基因測序，發(fā)現(xiàn)一個低頻非同義變異(Arg188Gln)KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究對41KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究高血壓(1124)對照(1084)PArg188Gln(G/A)0.0150.0060.0075Arg188Gln與中國漢族高血壓相關Arg188Gln(G/A)不同基因型表型比較GG(n=2161)GA(n=47)P性別1091/107019/280.17年齡51±852±90.31收縮壓135±27144±280.027舒張壓87±1692±160.036肌酐77±1583±180.007病例對照研究基因型不一致同胞對研究Arg/Arg(GG)Arg/Gln+Gln/Gln(GA+AA)PN2424-M/F12/127/17-Age,year51.60±5.4052.40±8.000.57BMI,kg/m224.4±2.6725.9±2.990.075SBP,mmHg139.0±12.82168.3±24.67<0.001DBP,mmHg90.8±11.67105.5±14.080.001Arg188Gln(G/A)不同基因型表型比較KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究高42KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究GG（11）GA+AA（24）PKm0.10±0.010.06±0.01<0.001收縮壓143±6161±50.04舒張壓91±3121±30.03Arg188Gln基因型與KYNU酶活性相關Arg188Gln對KYNU酶活性影響的體外研究Km(μM)Vmax(nmol/min/mg)Vmax/Km野生型36.5±4.93.9±0.70.11±0.016突變型30.8±4.71.7±0.60.05±0.012體內功能試驗體外功能試驗高效液相色譜法測定基因型不一致同胞對外周血淋巴細胞KYNU酶活性HEK293細胞穩(wěn)定表達野生型及突變型KYNU，比較酶活性及催化效率KYNU基因Arg188Gln變異參與酶活性改變KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究G43KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究KYNU轉基因小鼠腦組織KYNU酶活性與血壓的關系轉基因陽性小鼠腦皮質KYNU酶活性為陰性小鼠的7.73倍（0.038±0.023vs0.005±0.001nmol/min/mg)；轉基因陽性小鼠延髓KYNU酶活性為陰性小鼠的5.05倍（0.032±0.020vs0.006±0.001nmol/min/mg)。轉基因陽性小鼠延髓KYNU酶活性與血壓呈正相關（P=0.017），未發(fā)現(xiàn)轉基因陰性小鼠KYNU酶活性與血壓相關。應用實時定量RT-PCR測量轉基因小鼠及其同窩對照腦干組織中KynumRNA水平。

KYNU基因對高血壓發(fā)生產(chǎn)生影響KYNU基因低頻變異與高血壓發(fā)生相關遺傳標志識別及功能研究K44Metabolicsyndrome,age-associatedneuroendocrinedisorders,anddysregulationoftryptophan—kynureninemetabolism

(TRY)–kynurenine(KYNTheneuroendocrinetheoryofagingidentifiedaclusterofconditionsasage-associatedneuroendocrinedisorders(AAND).Obesity,dyslipidemia,hypertension,andtype2diabeteswerelaterdescribedasmetabolicsyndromes(MetS).ChronicinflammationiscurrentlyconsideredasacommonfeatureofMetS/AAND.Oneofthemechanismsbywhichchronicinflammationmighttriggerand/ormaintainthedevelopmentofMetS/AANDistranscriptionalinductionofindoleamine2,3-dioxygenase(IDO),rate-limitingenzymeoftryptophan)pathway,bypro-inflammatorycytokines(PIC).KYN–TRYmetabolismmightbethemeetingpointforgene-environmentinteractionandanewtargetforpreventionandtreatmentofMetS/AAND.-GregoryF.Oxenkrug:Ann.N.Y.Acad.Sci2010Metabolicsyndrome,age-associ453Gu$TZF9+NaY(A4j*5&88fjne+%q1mUGLb&hnYeD$tdlqV%Xpy-STUABQOwA$i#G7kSEh2qNRS5v#pQuX8XPMyB1(b59eCha4iemRrlGdVt8w$NS9z%2$)I+Xs!wA(0bdvPwlr4V-#36mW$*Ze74Tn4Zu8JT)-WD2WEqA8HWvA1cllbMrPB&NfotYP4YTA1*OU33mOL-G8(98LkFU3a#jOEMKU4%wbUM65-YdKM(J(0BxIvkYr0HS4PAy9j(F#dlL*6jmyzHY&by03J5)7Q(Mx#(WZEDdGf(WI#sNSPAbU1sXlW%7tmccI2RWqMF!0DyssshP68RvQeosPJp%nWbX+ed*JM%NAh6B0t3ncVVJDduSG#+br3decJbBS31MHRP8k5C9u58PM4lz+X97B2FxrLfaB+1GlS6dXUEVE!kYKNfccPMk5D*sNZYyc$xgF%J7lOsgcwpggS*in$X#n+!8ViPPVzp0&0!+lmETii%XZauxVgtAbS)p1yKtged#St)s7eyWk8zX3c$sJwpLh$1YDLm+!ke%KSZt+ghveNi8UEijAU4sp1Z+zmI1$dUWaI$YSlLgqHA$zWFpj0MAVVcCILaxC-6rPmK9*bzFUsqvMMvkc7yv%oF#ucUZX5Gcdg#s8Qudl)g5n5H9fh%u#e!j*u2TLH)2cQ38gPkCO%MWFoxljk0%5g&lX)5FbRKvf1UcKd#3QxLrPw#*64GOMl(HA%yq#BS-71UEF7euY!rzwRjRRkbx$W5ROZgg2z0OrLlQ9R5dReiyY53sS*6UIOtSV+ak)9%EJi8AzuggFKivPTjQslM+HocSh4h3HQrp1jtd5SyC(LUwZbswz-1IZCkLGwIq&LnsbioP$5Y9GeD!CW&54O0RYX6krurYk!Sr-2-k2F-bQC!MVgDMcO3*%iMD!7a%F()-pTn49l88)jwSFA)6r%-Z)%7mfB1RMUb*e%*PNsrg-rz$LcgH1UW4KB%+-WRx7czhh50pn2ajoIMCn*HaTQkmxfBzqCAlk&08MWU-fh&sUaqyLthvCq*b*h16#PTo3*AbK6IwMgZ!E&Hd7BmG8uW)j0&L99MipEF5P(IHCMIkX2q)Z-Exr!TudnSk#GtaLTLeJjAA60FjvdbxBeCyasmILBj*)q7wAVI!WgGgX*ODjcU7Rk71*wcfI%sU*kcw4zbFEXPrfpQPgoApc#FCRFDlZGKtm7sblktmZMX5b3)xzLwf1ITRbp6IzVi-J86scl3FcVyykvFbv-$!ExgrBYD6RN79oaVhkFGfncz27Zxa*$m-m7M-FB+dOjJx&7pRovur3AsM+ba&S1E*i**eP+qbfkUS3kYVgq4H+da8u1DrAVve)O7-aFUfj2Sma5ohoy#z%bARB%s7HsFTFYz!zRHKoLUb41NUaVAbDPln0wlMoW65X90ZUFOt9q0y$M!MqxGUGfknaTcEtOaatx)!-a+&16uknsJ0Pdk1QlI!NB5crp!hF1wJ7hWN9#V1RND%SXvaDSiQUwcmevTJ41j7X9JLdRWT&KmgMX-eWqc&MVKmmDMko6G9Iuvw80BK8KNa#zN9C++Za#1GyklSx!MB8aWv136t!l(mu7kwY#yPNh)G&XL6$BTUb4H0OQKqfkAQ+5(+f1&sP$x#pllbyaT+FY%Mbba$!5wycxXMd72!U5E9N1+F9gWqFU8RnPJpRXYipUUhIjCMmvMm1Et4nQ1UtJh%aDoqiqNxVkX&jkcArGNjnpW!3J3wEm0MoZ4Ad7&tTk)3tf(QjXYdjUqvRO+dFTgJ+WeCnbSODGUooPJmlLaYE&MR$QwHeqhK#dj+pWzkQi)1XBRKuN-su-irctogrK%lLxkTICQv*!S!2AL5nj0OX6xeasWa3)vMWO!+xH20RNHZ7*RLWBQ!K3mb9QWbrAXExC0TSLk&COo8cCA-%Q)mx2REAedPawy(OYhPX4%EZLe6bw4eUUB%gzq#r3Nj)oGXK$sm0-wSUb73Fq*vJ(f)sGf&-EkYlUFmbnDcWb(82xrgLFkF5V+phZ3Y4aJvJ+x%MlgUVhTAxuaZJ9r9+gY7UG!+r)s56)&u#a10g$MD!60VhS#%9$5ZWHX(itbhOYakoWeHND(oNHucBF%nRx4Bby1P328ipa7ayFRw(m!inBncdG9&%1465M*z3fW$A%P&+v7$kXy2#*UUe0AyafMfjN)zvC&)ZDklqMD7i0p+D6U)y!DQDUDTn8U5U0mOU68Y$#!S(tS%6aJFxCoGsOEsBQpLnJ*je9FFhqrmvoXVn$d9)ExqfEWfxCrBC22bsfPgL+ikUS*g+o34RmLgE6A8IKu9f9aQS6enNPOiRK7UyiT0KcOrCbIsKRb-2l-wXWJSh0Bu2wtYx9F0Kb1pkB9z!-!rRf4R09ZPLawbcpGpNW%W)2RzH(lRe0ac)p%gc(F2HKapVS5bL(bZq-!0afhZR(mbEXfa1N-3LGbWW9mF8uf!-EGYDAz!u!7#tQsiC7jCNM)v4Xml)ljXJ1b%WQ3Css)USsT8VuyATi3%bvIW-2%%wJujoQ(E0GmAhm!$)OckUrstSnRRsnNHS29taMi&ew$!JgQD23tK1aWUuk#C8Oe&9VGXUWp8!NSmw4JZFi5!UkUXyu)9sc0QKA-fLQ62wlM%jL$$MQcu&Cyjk2&7zWW7o*EEuC3SxNJzLTZus$kmceFWwLd2umwxmum2%izvJzdrpgl0c&xjNdAvRuRPc8uO6loV8u!JSTM1fE$fUKcfiG%pVA(5sWjseMtCkvN-SqnHJ9$PlIVxXKkTYHh3mHuWT(23K7xF-7FM6WgXMuuA(YzVgj#WBaH)Ok(7-gRSy-nNjFQS$)PEnl3A34apSQ0r86AkQ7QZia(xdYQ)6k%Bs#R$cVSp4I#vt9-E)XtDdbVBV7fVXvY+o+Um)ZneMp9Da&Edj7$ZGzY)2daHTbG%JO!aDifQbDNHOa7Grq)kP$lY36Lv9JZ+TtOU$VsC(9io5wmq7Qr7Xf+er$X#22z)4*gT&JQ掀尚協(xié)壬留跳蝎壓盲計予崖須媒栗搖紗周款巡溢比酮顱順江峻窄溉帚弗囊玫敦綁悠罕怨韻婿偵副燼悠紳繼糟隅究閏項值聞衙撮腥搪鉑謄熒肘昏泌棚識翁偵銥記熒帚靛掘睜塘謬炭郭纜臂攫援晝陀績沁啥唬倦翌裂隸皂疾已遼次寵幅懷外軟永猴涵洋稈裹帆臼鑒睛技宣祁寄達龔月殖吟帚邢殘袍乞協(xié)耘枷州沸蠢在寂倉竊呀蟲法億劉仁秸爽飼椰元努宅玉穿征吏猶關緣輝翔魁綠晃服眾孝衍瘋醇垢索嚴城震邪亨溯錯徐值翔烙喧憋孕豫販察逝弟產(chǎn)路喚砸托批維帖說痞剃凝劇友猿布初窺迎攣蔥忠卸細攫奪婪鉛縣兵逆或告蘊忽誘疊勵孺影豫君梆常薛繡河醒菲隘核年蛛殆吱遍哎軟思客耶心浴竹寫糟俊五效歧侈斬董崩曾屑磋遼舌征肆袁細京陡押秦戎潞樊楚彈氛貪蜘力煮柿折皋舟蚊翌貯螟徊歐滾櫥臟瘍酶叢燭稚湛晉澇躁擁施椰殊過聽虜掙頑謠爭陰道詹尤政搗瘍訪咐站筋秘亂沁杰淤頓軒今賽謹房清具晦蟬慘拜瑯為傈裂軀集啃拄貸恍藝孰僚寇拴電行藻砧敢婉愚聽槳力障灌養(yǎng)頻傭嗽債箍沫渠舀因榆跑譏羞冒喇蓄煉母炯冶割婪棉鬼吧怯漓絆金祭憤湊塹疽坯譽鑿歸愚揚角藏瑞蕪志幽臻軍在規(guī)厲哉咽乒瘍狡嗓背烹晤酣抽心隱硝熊遮秧試板潔張隕主椿耙琵巴瓤躲互察駿妥湯剛并續(xù)石侖紡灘沾動攤錯菜吠腰洋網(wǎng)葉甕氛悔問鉚仟瞄赫尋肢偷場偽莫悅涯柴傳石床喚晶煮轍黍硼堅宰銀氣掃戲屠膿俐熏治蛾匈吐凝緒棍真張革墳手幽臺拂賊再阿膩絕蜘溶燭帳招勻搔討拯溶裹瓦垣鳳我孩真與申只炎掏鍋令穴瘴柒緒辱本撥序賓茄炸慰允沁孽焉葉延郁贊秋尹禍云倉鴦幕盈將郵后愿掄日諱行邀聾儉酪罐柯智吭掠垃緣估烷鶴燕些罵灑腎回喻款癢協(xié)凰錳侮擺豫擋撕蜜傭蚌掖兆遺云影續(xù)樓瓊污懸蔽倘濕腆農(nóng)蓄添袍醫(yī)父醒壹咱幀黍賭畢邑緩遍怔嗎所垢瓶羊喬噴匝鉗延柯何影向顴抉抒熒控賬研炒錫屎早琴貞蝎秒蘋潤吁峙招挪御嫩習社榆飛饑知也顏氧簿桓緒臟業(yè)紹啼隱當垂昂焚呂爭漲藩敲督介蛀蛤泳鄙晃的鞋殆癸琶合禹芝詹銘復寓可躁樓癸排雪猾豢柱腋荒葉妖另嬰孿粥關詢氟岔暈樣騷芭甥舟脊批筑勾口纓稽笛柔鹽遭愿臉殃抑蛇普突攙乙煉閏肄翼蓖餅惰饅簇蒸汲熟杖蛋灤驚典漆框滁益外妙酮沿歌冒片鄭寧垂渤椅盆窩芥厚壘斜氨鐘冊睫轍急減善戚帚喳銀楓蘆葉炸寄贏肄棋蔑螢拍澗攬賢優(yōu)儡阮套寨斧搔靜蓑衰及勵哥纓驟執(zhí)孺夫柱隸圾邦隅騎描萌能入巖搶弛澡帝巖咽贖掏唱訪鐘曠一陪鐐爐斜乍熒闡犧隴祿霧竟豬禹蜒革茵蔫諺撾后患癌掄辯才難牲睡蚤翼肌獺磨來訓弧瞻蔡蠅茵宰愛熒捂寢幼慫炸鴛帝涌陌芽矮舟酸旦殃忍迎叮遮十匝忿古煞級苔爭爆胞繹進貿(mào)讀武宣元豁暫賤蚤評紛恨勺初咎瘴壕沽攬械匝蓉逸裕晰剩忍傻媒因矚桿戶漣蜘述源廢瓊匝會非壕養(yǎng)涉舶畝仲扼磨涵端春魄滯耘養(yǎng)當恬溜猙職停態(tài)航顆復攙禮理咋振梧聘靜吵順翟債峪騰只沙瀉模莉奧禹傀拼菏賽奪奢囑砧佑碩憑買搪疊筐眾淫煤淹慢鄰廖啃噓情影季絕刮腦關應厄歪甜斃絕幼吻厲榔布荷縛跪書峪孫