細菌及細菌類疾病的實驗室診斷-動物細菌病的實驗室診斷方法（動物微生物技術(shù)課件）

動物微生物應(yīng)用技術(shù)動物細菌病的實驗室診斷方法

初診：根據(jù)流行病學(xué)、癥狀、病變等方面的疾病特征，做出初步診斷。通過實驗室診斷，確定病原是否是細菌以及病原菌的類型。實驗室診斷是在臨床診斷的基礎(chǔ)上進行的病料的采集、保存和運送細菌的形態(tài)學(xué)檢查——涂片鏡檢細菌的分離培養(yǎng)生化檢測血清學(xué)試驗動物試驗分子生物學(xué)技術(shù)基本程序一、細菌性病料的采集、保存與送檢標本采集的一般原則無菌采集，應(yīng)無污染，嚴格進行無菌操作。注意在不同病程采集不同部位標本，采集量不應(yīng)過少。。病程早期、急性期或癥狀典型時，使用抗生素前。采集的標本必須新鮮，采集后盡快送檢。送檢過程中，多數(shù)菌冷藏運輸。采集標本時要防止傳播和自身感染。一、細菌性病料的采集、保存與送檢防止污染動物剖檢個人防護和消毒動物尸體處理廢棄物處理一、細菌性病料的采集、保存與送檢動物剖檢剖檢場所：應(yīng)選擇便于消毒、不滲水的解剖地點，最好有專門的剖檢場所和剖檢臺。剖檢前，動物尸體應(yīng)浸泡消毒。一、細菌性病料的采集、保存與送檢個體防護和消毒做好個人防護：剖檢過程中，注意個人防護。剖檢后的器械浸泡消毒后洗刷。一、細菌性病料的采集、保存與送檢動物尸體的處理動物尸體焚燒爐深埋（投入消毒藥）焚燒或深埋：剖檢后動物尸體和病料焚燒滅菌或消毒深埋。一、細菌性病料的采集、保存與送檢廢棄物的處理垃圾直接洗刷處理不當(dāng)會引起人和動物疫病的散播動物或人的傳染病一、細菌性病料的采集、保存與送檢無菌采樣目的防止病料被污染方法所用器械和器皿必須滅菌點燃酒精燈注意無菌操作一、細菌性病料的采集、保存與送檢適時采樣細菌豐富增殖時期、病料應(yīng)該新鮮：取瀕死動物或剛死亡的動物。死亡動物采集病料夏天不宜遲于6～8h，冬天不遲于24h。一、細菌性病料的采集、保存與送檢適當(dāng)部位選擇病料的部位可采用兩個原則第一原則：根據(jù)疾病的類型和表現(xiàn)采集病變最典型的部位第二原則：一般采集正常無菌的部位一、細菌性病料的采集、保存與送檢實質(zhì)臟器的采集剖開體腔后，立即采集，置于無菌容器內(nèi)。污染或剖開過久的被檢器官：先燒烙表面，然后在燒烙的深部取一塊實質(zhì)臟器，放在滅菌容器內(nèi)。如有細菌檢驗條件，可在剖檢后直接做病料的觸片染色和細菌的分離培養(yǎng)。一、細菌性病料的采集、保存與送檢液體病料的采集膿汁、胸水一般用滅菌的棉棒或吸管吸取放入試管內(nèi)，塞好棉塞送檢。血液可無菌操作從靜脈或心臟采血，然后加抗凝劑（每1ml血液加3.8%枸櫞酸鈉0.1ml）。若需分離血清，則采血后放在滅菌的容器中，擺成斜面，待血液凝固析出血清后，再將血清吸出，置于另一滅菌試管中送檢。一、細菌性病料的采集、保存與送檢其他病料的采集皮膚要取有病變且?guī)в幸徊糠终Ｆつw的部位。被毛或羽毛取病變明顯部位，并帶毛根放平皿。胎兒可將流產(chǎn)胎兒送往實驗室，也可用吸管或注射器吸取胎兒胃內(nèi)容物放入試管送檢。腸道及內(nèi)容物需選擇病變最明顯的部分，將其中內(nèi)容物去掉，用滅菌水輕輕沖洗后放平皿內(nèi)。一、細菌性病料的采集、保存與送檢細菌性病料的保存和送檢低溫保存盡快送檢做好記錄畜主姓名、動物種類、地址、發(fā)病情況、欲檢部位及檢驗項目、采集時間等。二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢方法光學(xué)顯微鏡檢查電子顯微鏡檢查意義觀察病料中有無細菌以及細菌的形態(tài)、數(shù)量、分布、結(jié)構(gòu)、種類等，進行初步判斷普通光學(xué)顯微鏡用油鏡放大1000倍，一般細菌均能清楚看到。熒光顯微鏡可看到發(fā)射熒光的細菌。還應(yīng)用于免疫熒光技術(shù)中。電子顯微鏡有透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。前者適于觀察細菌內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，后者適于對細菌表面結(jié)構(gòu)的觀察。二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢不染色細菌標本檢查1.主要用于檢查生活狀態(tài)下細菌的動力及運動狀況?？蓪δ承┎≡鞒龀醪借b定，如霍亂菌。2.螺旋體由于不易著色并有形態(tài)特征，故多用不染色標本作暗視野顯微鏡檢查。二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢常用染料分為堿性、酸性、復(fù)合染料：堿性染料電離后顯色離子帶正電荷，易與帶負電荷的被染物結(jié)合。由于細菌均帶負電荷，易與染料結(jié)合而著色。常用的有堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍等。細菌染色標本的檢查二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢酸性染料電離后顯色離子帶負電荷，易與帶正電荷的被染物結(jié)合。細菌都帶有負電荷故不易著色。通常用來染細胞漿，而很少用于細菌的染色。常用的酸性染料有伊紅、剛果紅等。常用染料細菌染色標本的檢查二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢復(fù)合染料(中性染料)及熒光染料復(fù)合染料是堿性染料和酸性染料的復(fù)合物，如瑞氏染料(伊紅美藍)、姬姆薩染料(伊紅天青)等；熒光染料如熒光標記的抗體，熒光素常用異硫氫基熒光素。這些染色常用于某些特殊的染色技術(shù)中。常用染料細菌染色標本的檢查二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢

革蘭染色抗酸染色熒光染色常用染色方法細菌染色標本的檢查二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢革蘭染色最經(jīng)典、最常用的染色方法。在分離培養(yǎng)前都要進行革蘭染色、鏡檢。分為G+菌和G-菌，可初步識別和鑒定。結(jié)果為臨床早期診斷及治療提供依據(jù)。可為臨床選擇用藥提供參考，有針對性的治療方案。常用染色方法細菌染色標本的檢查二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢抗酸染色將細菌分為抗酸性和非抗酸性細菌兩大類。只用于結(jié)核病等檢查?？顾崛旧蔫b定結(jié)果，對疾病的診斷和治療具有重要參考價值。常用染色方法細菌染色標本的檢查二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢敏感性強，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細菌鑒定中有很大的實用價值。主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及志賀菌等的檢測。還有：鞭毛染色可觀察有無鞭毛、鞭毛的位置及數(shù)量，在細菌鑒定中很重要。異染顆粒染色鏡檢異染顆粒，為臨床早期診斷白喉提供依據(jù)。熒光染色常用染色方法細菌染色標本的檢查二、細菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢絕大多數(shù)細菌在適宜的條件下可以生長，細菌感染性患畜標本只有經(jīng)過細菌的分離培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感試驗，才可對感染性疾病進行病原學(xué)診斷并指導(dǎo)臨床用藥。因此，細菌培養(yǎng)對疾病的診斷、預(yù)防和治療具有重要的作用。二、細菌的分離培養(yǎng)（一）細菌室的符合條件細菌室必須安裝嚴密的門窗，以防室內(nèi)環(huán)境受到外界的污染。且室內(nèi)禁用風(fēng)扇，避免細菌的播散。細菌室必須安裝供空氣消毒的紫外線燈，置于操作臺上面1m處，每天開始工作前照射20min。對其消毒效果要定期檢查，及時更換失效的燈管。二、細菌的分離培養(yǎng)室內(nèi)應(yīng)備有消毒劑，用于試驗中發(fā)生菌液灑濺時的及時消毒處理。同時還應(yīng)備有供工作人員浸手用的盛有消毒劑的水盆、肥皂及自來水源等。室內(nèi)操作臺須每日用消毒劑擦洗，地面至少一周用消毒劑擦洗1次。（一）細菌室的符合條件二、細菌的分離培養(yǎng)對接收的標本、無菌器具、用過的物品等應(yīng)明顯分開井放在指定位置。同時要對用過的物品及時進行滅菌處理。細菌室應(yīng)有當(dāng)?shù)氐臍鉁靥攸c的消防設(shè)備。（一）細菌室的符合條件二、細菌的分離培養(yǎng)（二）無菌實驗室（三）基本設(shè)備和器具二、細菌的分離培養(yǎng)

培養(yǎng)基的組成成分營養(yǎng)物質(zhì)：(1)蛋白胨；(2)肉浸液；(3)牛肉膏；(4)糖類；(5)血液；(6)無機鹽類；(7)雞蛋和動物血清；(8)生長因子：提供細菌生長繁殖所需要的氮源和碳源，還有生長因子。凝固物質(zhì)：制備固體培養(yǎng)基時，加入瓊脂，瓊脂是半乳糖膠，98℃以上時可溶于水，在45℃以下則凝固成凝膠狀態(tài)。抑制劑和指示劑：用于選擇、鑒定及判斷結(jié)果。二、細菌的分離培養(yǎng)二、細菌的分離培養(yǎng)方法：用分區(qū)劃線法在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)意義看培養(yǎng)基中有無細菌生長推斷是否為細菌??；依據(jù)菌落的特征判斷細菌種類；用菌落中的細菌進一步作形態(tài)學(xué)鑒定；可進一步作生化鑒定、血清學(xué)鑒定及動物試驗；可進一步作藥敏試驗；二、細菌的分離培養(yǎng)通常選用適合目標菌生長的平板培養(yǎng)基對細菌進行分離培養(yǎng)。不同細菌的菌落大小、形態(tài)、色澤、表面特征、邊緣狀態(tài)、隆起度、透明度等特征不同。有的細菌在鮮血瓊脂平板上形成溶血環(huán)。也可采用選擇培養(yǎng)基或鑒別培養(yǎng)基，以起到抑制雜菌或快速鑒別的效果。比如腸道桿菌科可選擇麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂。二、細菌的分離培養(yǎng)分區(qū)劃線法二、細菌的分離培養(yǎng)伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上大腸桿菌菌落不同的培養(yǎng)方法需氧培養(yǎng)法：最常用的培養(yǎng)方法，適于需氧和兼性厭氧菌的培養(yǎng)。二氧化碳培養(yǎng)法：二氧化碳培養(yǎng)箱：是一臺特制的培養(yǎng)箱，既能調(diào)節(jié)C02的含量，又能調(diào)節(jié)所需的溫度。此法適于大型實驗室應(yīng)用。燭缸法：將已接種好的培養(yǎng)基置干燥器內(nèi)，并放人點燃的蠟燭。干燥器蓋的邊緣涂亡凡士林，蓋上蓋子，燭光經(jīng)幾分鐘后自行熄滅，此時干燥器內(nèi)C02含量約占5％-10％，然后將干燥器放入35℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。二、細菌的分離培養(yǎng)化學(xué)法：按每升容積加入碳酸氫鈉0.4g和濃鹽酸0.35ml的比例，分別置于容器內(nèi)。將容器連同接種好的培養(yǎng)基都放人干燥器內(nèi)，蓋緊干燥器的蓋子，傾斜容器使?jié)恹}酸與碳酸氫鈉接觸生成CO2。(三)厭氧培養(yǎng)法不同的培養(yǎng)方法二、細菌的分離培養(yǎng)三、細菌的生化檢測進行生化試驗的細菌必須是純培養(yǎng)物。檢驗時，根據(jù)可疑細菌的生化特性選擇特定的一組生化試驗，將結(jié)果與標準進行對比，以確定病原菌的種類。例：不同種沙門氏菌的生化鑒定三、細菌的生化檢測雞白痢沙門氏菌雞傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌不同種沙門氏菌的生化鑒定糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗VP試驗甲基紅試驗枸櫞酸鹽利用試驗吲哚試驗IMViC試驗大腸桿菌產(chǎn)氣桿菌三、細菌的生化檢測四、細菌的血清學(xué)實驗臨床診斷中，可用于細菌的血清分型、快速診斷或大群檢疫。用已知抗體檢測動物體內(nèi)的病原菌用已知的病原菌抗原檢測動物血清中的抗體例：雞白痢的檢疫四、細菌的血清學(xué)實驗1、加一滴抗原2、加一滴雞的全血3、將抗原和血液混勻4、靜置2min,觀察結(jié)果雞白痢檢疫—