第14章 核酸的理化性質(zhì)

第14章核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)——一般物理性質(zhì)DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末狀固體。都微溶于水，其鈉鹽在水中的溶解度較大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有機(jī)溶劑。DNA和RNA在細(xì)胞中常以核酸—蛋白復(fù)合體（核蛋白）形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液中的溶解度不同。

DNA核蛋白RNA核蛋白

0.14mol/LNaCl-+1-2mol/LNaCl+-DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸發(fā)生變性或降解后其粘度降低。核酸受到強(qiáng)大離心力的作用時，可從溶液中沉降下來，其沉降速度與核酸的大小和密度有關(guān)。與蛋白質(zhì)相似，RNA分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有弱堿性堿基基團(tuán)，因而RNA也具有兩性性質(zhì)。由于RNA分子中的磷酸是一個中等強(qiáng)度的酸，而堿基呈現(xiàn)弱堿性，所以RNA的等電點(diǎn)比較低。（當(dāng)核酸分子內(nèi)的酸性解離和堿性解離相等，本身所帶的正電荷與負(fù)電荷相等時，此時核酸溶液的pH值即為核酸的等電點(diǎn)pI）RNA在其等電點(diǎn)時溶解度最小。RNA的等電點(diǎn)比較低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通過氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子的解離。核酸的理化性質(zhì)——核酸的兩性性質(zhì)一、核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解1、酸水解

核苷酸的糖苷鍵和磷酸二酯鍵均可被酸水解，但糖苷鍵比磷酸二酯鍵更易被酸水解。

水解水解核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解2、堿水解

RNA的磷酸鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸，DNA的磷酸鍵則不易水解，因?yàn)镽NA上2‘-OH基，在堿作用下易形成磷酸三酯而易水解。

水解核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解2、堿水解

核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解2、堿水解

核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解2、堿水解

核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解3、酶水解

非特異性水解多聚核苷酸鏈中磷酸二酯鍵的酶稱為磷酸二酯酶，特異性水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶DNA水解酶（DNases）以DNA為底物，RNA水解酶（RNases）以RNA為底物。根據(jù)作用方式又分作兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3′-端或5′-端）開始，逐個水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。在分子生物學(xué)研究中最有應(yīng)用價值的是限制性核酸內(nèi)切酶。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解3、酶水解

蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶是從不同末端降解多聚核苷酸的核酸外切酶3、酶水解

核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解牛胰核糖核酸酶（RNaseI）作用位點(diǎn)為嘧啶核苷-3`-磷酸與其它核苷酸之間的連鍵，產(chǎn)物為3`-嘧啶核苷酸；或以3`-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解3、酶水解

限制性內(nèi)切酶是一類重要的作用于DNA的內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶識別部位一般都是由4-8個堿基對組成的一段序列，而且有一個二重對稱軸，即5`-3`方向殘基序列在DNA的兩條鏈上是一樣的，這樣的序列稱為回文結(jié)構(gòu)。E.CoRI是一個重要的限制性內(nèi)切酶，它識別由6個堿基對組成的特殊序列（每條鏈上是GAATTC）。大多數(shù)限制性內(nèi)切酶都是將雙鏈DNA切開，形成兩個粘性末端（帶有與另一末端互補(bǔ)的單鏈）限制性內(nèi)切酶往往與一種甲基化酶同時成對的存在，它們具有相同的底物專一性，具有識別相同堿基序列的能力。核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解3、酶水解

5`——N—N—N—N—G—A—A—T—T—C—N—N—N—N——3`3`——N—N—N—N—C—T—T—A—A—G—N—N—N—N——5`5`——N—N—N—N—G

A—A—T—T—C—N—N—N—N——3`3`——N—N—N—N—C—T—T—A—A

G—N—N—N—N——5`E.coRI核酸的理化性質(zhì)——核酸的水解3、酶水解

5`——N—N—N—N—G——3`3`——N—N—N—N—C—T—T—A—A——5`5`——A—A—T—T—C—N—N—N—N——3`

3`——G—N—N—N—N——5`5`——N—N—N—N—G—A—A—T—T—C—N—N—N—N——3`3`——N—N—N—N—C—T—T—A—A—G—N—N—N—N——5`二、核酸的理化性質(zhì)——核酸的紫外吸收1、紫外吸收

DNA和RNA的堿基有共軛雙鍵，而使核酸在240~290nm有光吸收，最大吸收在260nm附近。可用紫外分光光度法進(jìn)行核酸純度鑒定。純DNA樣品：A260/A280>1.8純RNA樣品：A260/A280>2.0

對純樣品：A=1.0相當(dāng)于50ug/mL雙鏈DNA或40ug/mL單鏈DNA或20ug/mL寡核苷酸。核酸的理化性質(zhì)——核酸的紫外吸收2、增色效應(yīng)與減色效應(yīng)核酸的理化性質(zhì)——核酸的紫外吸收2、增色效應(yīng)與減色效應(yīng)

有時核酸溶液的紫外吸收用摩爾磷吸光度表示，根據(jù)磷含量及紫外吸收值然后算出摩爾磷吸光系數(shù)。

(P)=A/cL=30.98A/WL一般天然DNA的

(P)為6600，RNA為7700~7800。由于單鏈核苷酸的

(P)比雙鏈的要高，所以核酸發(fā)生變性時，

(P)升高，故稱增色效應(yīng)；復(fù)性時

(P)降低，稱為減色效應(yīng)。三、核酸的理化性質(zhì)——核酸的變性、復(fù)性與雜交1、核酸的變性（denaturation）

是指核酸的雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，并不涉及共價鍵的斷裂。變性因素：酸堿、熱、尿素等；DNA熱變性后一些理化性質(zhì)改變：260nm紫外區(qū)吸收值升高；粘度降低；浮力密度升高；雙折射現(xiàn)象消失；

核酸的理化性質(zhì)——核酸的變性、復(fù)性與雜交1、核酸的變性（denaturation）核酸的理化性質(zhì)——核酸的變性、復(fù)性與雜交1、核酸的變性（denaturation）用加熱的方法使DNA變性叫做熱變性DNA的變性過程是爆發(fā)性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將DNA的變性達(dá)到50%時，即增色效應(yīng)達(dá)到一半時的溫度稱為DNA的解鏈溫度（meltingtemperature,Tm）,Tm也稱熔解溫度或DNA的熔點(diǎn)。一般DNA的Tm值在70-85

C之間核酸的理化性質(zhì)——核酸的變性、復(fù)性與雜交1、核酸的變性（denaturation）Tm與下列因素有關(guān)：1）DNA的均一性：均質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個較小的溫度范圍內(nèi)；異