【實用資料】上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程PPT

上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程（優(yōu)選）上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程2.HGP發(fā)展過程：（1）源起“腫瘤計劃”擱淺60年代初期，腫瘤發(fā)病率在世界各國急劇上升決心在20年內(nèi)解決腫瘤的早期診斷和治療斥資幾百億美元，動員全國的力量幾乎所有同細胞增殖有關(guān)的基因，都與腫瘤有關(guān)人類所有疾病，都直接或間接與基因有關(guān)（2）提議1985年，能源部(DepartmentofEnergy，DOE)在加州大學圣克魯滋會議上第一次對人類基因組全部測序進行可行性論證形成“人類基因組計劃”草案。（2）提議1986年，諾貝爾獎獲得者RenatoDulbecco發(fā)表于《Science》雜志的短文《腫瘤研究的轉(zhuǎn)折點：人類基因組測序》中高瞻遠矚地率先向世界公開提出人類基因組計劃，并倡導全世界有能力的科學家共同完成這一國際性大課題?！叭绻覀兿敫嗟亓私饽[瘤，我們從現(xiàn)在起必須關(guān)注細胞的基因組?！祟惖腄NA序列是人類的真諦，這個世界上發(fā)生的一切事情，都與這一序列息息相關(guān)?！?987年人類基因組創(chuàng)意報告（能源部）1988年人類基因組的作圖與測序報告（科學院），同年底國會通過1990年開始實施，預計15年完成，撥款30億美元.J.Watson擔任“國家人類基因組計劃研究中心”首任主任1997年：大腸桿菌基因組（5Mb）全部測序完成，毛細管測序儀上市（3）發(fā)展1992年：和法國的兩支研究隊伍分別完成了人類Ｙ染色體和第21條染色體的第一張物理圖譜；隨后又分別完成了鼠和人的遺傳圖譜。1993年：位于英國劍橋的Sanger中心加入人類基因組計劃，并成為一個重要的測序中心。1994年：與法國完成了人類基因組中的第一個完整遺傳連接圖譜1996年：各國科學家聚集在百慕大群島，討論并通過了充分體現(xiàn)HGP精神（全球共有，國際合作，即時公布，免費共享）的百慕大原則。1998年：CraigVenter宣布成立Celera公司，并宣稱將采用“全基因組鳥槍法”完成人類基因組的全部測序。從此，人類基因組測序在“公、私”之間展開了激烈競爭線蟲基因組測序完成。

（3）發(fā)展1999年：中國獲準參加HGP，承擔測定人類基因組1%測序任務；英國和共同完成了第一條人染色體—第22條染色體的全部測序工作。（3）發(fā)展（3）發(fā)展2000年：6月26日，HGP與Celera公司的領(lǐng)導人在白宮的慶祝儀式上共同宣布了人類基因組工作框架圖的完成，并約定將雙方的研究成果同時發(fā)表2000年6月公共領(lǐng)域測序計劃工作框架圖2000年Celera公司完成了果蠅基因組(180Ｍｂ)的全部測序工作，證明了“全基因組鳥槍法”的可行性；德國和的科學家公布了人類第21條染色體的測序結(jié)果；第一個植物基因組—擬南芥基因組（125Mb）被全部測序。（3）發(fā)展2001年2月：HGP將人類基因組工作框架圖發(fā)表在《Nature》;Celera公司則將其成果發(fā)表在《Science》上。“工作框架圖”已能覆蓋人類基因組的97%，其中至少92%的序列已組裝得準確無誤，并顯示其中只有3萬到3.5萬個編碼蛋白質(zhì)的基因，這是人類基因組研究的一個重要里程碑。Celera公司：Science,2001,291:1304-1351

六國科學家：Nature,2001,Vol.409:860

（作者274人，其中中國科學家57人）（3）發(fā)展（3）發(fā)展2003年4月14日當?shù)貢r間11時HGP負責人CollinsF.在華盛頓宣布，人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)2006年5月18日人類最后一個染色體－1號染色體基因測序完成，發(fā)表在Nature上。至此“生命之書”覆蓋基因組99.99%。我國是一個人口大國，豐富的人群遺傳資源1994年，在吳旻、強伯勤、陳竺、楊煥明的倡導下啟動中國HGP1998年，國家自然科學會和863高科技計劃的支持，先后啟動了“中華民族基因組中若干位點基因結(jié)構(gòu)的研究”和“重大疾病相關(guān)基因的定位、克隆、結(jié)構(gòu)和功能研究”；1998年，在上海成立了南方基因中心；1999年，在北京成立了北方人類基因組中心；1999年7月，在國際人類基因組注冊，得到完成人類3號染色體短臂上一個約30Mb區(qū)域的測序任務，該區(qū)域約占人類整個基因組的1％。國際人類基因組

測序任務分配情況遺傳圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜0.7cM或kb

序列圖譜物理圖譜100kbSTSmap四張圖：遺傳圖、物理圖、序列圖、轉(zhuǎn)錄圖（1）遺傳圖（geneticmap,又稱連鎖圖）

指基因根據(jù)重組頻率在染色體上的線形排列和分布。是以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標記為路標,以遺傳學距離為圖距繪制的基因組圖。遺傳多態(tài)性：在某個遺傳位點上具有一個以上的等位基因,且其在群體中出現(xiàn)的頻率均高于1%。遺傳學距離：在減數(shù)分裂事件中,兩個位點之間進行交換、重組的百分率,規(guī)定1%的重組率為1cＭ(厘摩爾根）。cM值越大，兩者之間距離越遠。第一代多態(tài)性標記:RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段長度多態(tài)性）不同個體的DNA在用某種限制性內(nèi)切酶水解時，會產(chǎn)生兩種不同長度的水解片段。由一個多態(tài)性位點出現(xiàn)在某種限制性內(nèi)切酶的酶切位點上造成的。缺點：數(shù)量較少，信息量有限第二代多態(tài)性標記

微衛(wèi)星標記（microsatellitemarker，MS),簡短串聯(lián)重復序列（shorttandemrepeat，STR）,短序列長度多態(tài)性（shortsequencelengthpolymorphism,SSLP)

重復單元2-6bp，多態(tài)性主要來自重復序列拷貝數(shù)的變化優(yōu)點：高度多態(tài)性，信息量大，符合孟德爾遺傳規(guī)律可采PCR使操作自動化CTAGCTTATATATATATATATATATATATAAGCTTGC1994年底，完成由RFLP和STR組成的遺傳圖譜，第三代多態(tài)性標記：單核苷酸的多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)性。

人類基因密碼差異不到0.1％，不同人群僅有140萬個核苷酸差異。這些差異是SNP產(chǎn)生的，它構(gòu)成了不同個體的遺傳基礎。特點：SNP在基因組中的數(shù)目多，可達到300萬個，平均每1000個堿基對就有一個。因而成為一種信息量非常大的遺傳標記系統(tǒng)。SNP可能在密度上達到人類基因組“多態(tài)”位點數(shù)目的極限。SNP與RFLP、STR等DNA標記的不同,是不再以“長度”的差異作為檢測手段,而直接以序列的差異作為標記。SNP為DNA芯片技術(shù)應用于遺傳作圖提供了基礎。

定位基因的重要手段，大致了解各個基因或DNA片斷之間的相對距離與方向研究人類基因組遺傳與變異的重要手段意義：(2)物理圖（physicalmap)以已知核苷酸序列的DNA片段為“位標”（STS），以DNA實際長度為圖距的基因組圖譜。

標記：序列標記位點(sequence－taggedsite，STS)。指基因組中任何單拷貝的長度在100～500bp之間的DNA序列，與核酸內(nèi)切酶識別序列相關(guān)聯(lián)。在基因組中有明確位置。圖距：Mb或Kb主要內(nèi)容：建立含有STS對應序列的相互重疊連接的DNA片段重疊群（Contig）只要有一定數(shù)量的STS標簽，所有DNA大片段在該染色體或基因組中的位置都能被確定。1995年，完成分辨率為200kb，以STS為標志的物理制圖意義:把遺傳學的位點信息轉(zhuǎn)化為基因組位點的物理信息基于STS位點信息的大片段DNA克隆重疊群(clonecontig)提供基因定位的參考依據(jù)(3)序列圖最詳盡的物理圖。測定總長約lm、由30億個核苷酸組成的全序列。既包括可轉(zhuǎn)錄序列，也包括非轉(zhuǎn)錄序列，是轉(zhuǎn)錄序列、調(diào)節(jié)序列和功能未知序列的總和HGP的基本目標(4)轉(zhuǎn)錄圖(基因圖譜）

目的：在人類基因組中鑒定出全部基因的位置、結(jié)構(gòu)、功能。方法：把mRNA先分離、定位，再轉(zhuǎn)錄成cDNA片段，就構(gòu)成一張人類基因的轉(zhuǎn)錄圖。cDNA片段又稱表達序列標簽(expressedsequencetag，EST)。

EST：通過從cDNA文庫中隨機挑選的克隆進行測序所獲得的部分cDNA的5'或3'端序列稱為表達序列標簽（EST），一般長300-500bp左右。意義有效反映在正常或受控條件中表達的全基因的時空圖EST除提供序列信息外，同時也提供了該基因表達的組織、生理狀況與發(fā)育階段的信息。1990年，提出了HGP的大規(guī)模cDNA測序研究戰(zhàn)略并建立了EST技術(shù)。至1998年，公共數(shù)據(jù)庫中EST序列已達一百多萬條，加上各公司已測但未公布的數(shù)據(jù)，估計現(xiàn)有的EST已包含了絕大多數(shù)的人類基因序列。

（1）實驗室測序Sanger的末端終止法：在PCR時加入熒光標記的復制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應于4種堿基）ddX的兩個作用：可以當作正常堿基參與復制一旦鏈入DNA中，反應終止電泳誰終止，堿基就是誰此方法獲1974年的Nobel獎（2）大規(guī)模測序與實驗室測序的不同實驗室測序：手工操作，效率低，結(jié)果是第一位的大規(guī)模測序：流水線操作，自動化追求穩(wěn)定、高效、低成本（3）大規(guī)模測序基本策略基于BAC的逐個克隆法：先把基因組打碎成200－300kb的片段并制成BAC文庫，再對連續(xù)克隆系中排定的BAC克隆逐個進一步打碎成小片段，進行亞克隆測序并進行組裝（公共領(lǐng)域測序計劃）全基因組鳥槍法（Shotgun)：直接將基因組分解成小片段隨機測序，利用超級計算機進行組裝（Celera公司）1）基于BAC的方法全基因組DNA隨機打成大片段選擇并克隆大片段排序，選擇再打碎，克隆，測序，拼接細菌人工染色體（BAC)BacterialArtificialChromosomePlasmidtransformingandcloninginbacteriarangefrom100to300kbpStable2）Shotgun測序DNA片段的制備：將DNA用超聲波切成能夠測序的小片斷轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：小片斷和載體結(jié)合，植入細菌中進行擴增。提質(zhì)粒：從細菌中提取出繁殖好的質(zhì)粒電泳檢測：檢測質(zhì)量的好壞測序：上測序儀測序Shotgun測序DNA全自動分析儀：ABIPrism?

3700型全自動遺傳分析儀安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號：MegaBACE500/1000/4000

DNA的鳥槍法測序的優(yōu)缺點：優(yōu)點：速度快缺點：●隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加●高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復序列，導致判斷失誤拼接錯誤：Repeat的存在拼接軟件的新需求能充分利用正反向測序的配對信息,避免重復序列造成的錯誤拼接能處理數(shù)以百萬甚至千萬計的數(shù)據(jù)程序并行化高效率比對能逐步拼接bp組成：個人差異：0.1％外顯子1.1％，內(nèi)含子24％，間隔序列75％基因重復片段高達5.3％人類基因組人類蛋白質(zhì)61%與果蠅同源43%與線蟲同源46%與酵母同源80％與小鼠同源公用基因組瀏覽器國立衛(wèi)生研究院（NIH）國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的Genbank圣克魯斯加州大學（UCSC）的UCSC基因組瀏覽器英國WellcomeTrustSanger研究所和歐洲分子生物學實驗所（EMBL）－歐洲生物信息學研究所的總基因組瀏覽器DNA數(shù)據(jù)庫

EMBL的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的EMBL-Bank，為：

分析序列，描述基因組所有基因的功能，包括研究基因的表達及其調(diào)控模式。核心問題：1）基因組多樣性的研究2）基因組的表達調(diào)控和蛋白質(zhì)組學的研究3）模式生物體（ModelOrganism）作為

功能基礎組學工具

三、后基因組計劃1）基因組多樣性的研究疾病基因組學通過分析細胞在正常和患病狀態(tài)下表達基因譜的差異，尋找與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因。

環(huán)境基因計劃(Enviromentalgenomeproject,EGP)研究對環(huán)境發(fā)生反應的基因中多態(tài)性對其功能的影響以及在流行病學中研究基因與環(huán)境的相互作用。先把基因組打碎成200－300kb的片段并制成BAC文庫，再對連續(xù)克隆系中排定的BAC克隆逐個進一步打碎成小片段，進行亞克隆測序并進行組裝（公共領(lǐng)域測序計劃）缺點：數(shù)量較少，信息量有限斥資幾百億美元，動員全國的力量(Enviromentalgenomeproject,EGP)上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程追求穩(wěn)定、高效、低成本上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程2）基因組的表達調(diào)控和蛋白質(zhì)組學的研究（haplotypemap,HapMap)ModelOrganismsUsedinGenomics高效率比對安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號：MegaBACE500/1000/4000幾乎所有同細胞增殖有關(guān)的基因，都與腫瘤有關(guān)指基因組中任何單拷貝的長度在100～500bp之間的DNA序列，與核酸內(nèi)切酶識別序列相關(guān)聯(lián)?！祟惖腄NA序列是人類的真諦，這個世界上發(fā)生的一切事情，都與這一序列息息相關(guān)。至此“生命之書”覆蓋基因組99.藥物基因組學（Pharmacogenomics)研究所有與藥物作用有關(guān)的基因在不同個體的多樣性，以及這些多樣性對藥物的療效、毒性或不良反應等的影響。藥物遺傳多態(tài)性：藥物代謝酶、藥物受體、藥物靶標藥物分析：尋找藥物靶點，進行大批量藥物篩選和分析。藥物設計：針對基因組多樣性設計更安全有效的個性化治療方案目標：臨床個體化用藥數(shù)據(jù)處理和關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)藥物作用對象確定靶目標分子針對靶目標進行合理的藥物設計國際單體型圖譜計劃（haplotypemap,HapMap)繪出人類基因組的單體型模塊，以及與此相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性標記。2002年10月啟動。單體型：一個染色體區(qū)域中所有相關(guān)聯(lián)的SNP等位基因的集合。這些SNP之間高度相關(guān)。單體型模塊：一個在上從未發(fā)生重組，并且只存在幾個單倍型的染色體區(qū)段。意義：為疾病相關(guān)基因?qū)ふ姨峁┯行а芯抗ぞ呷祟惢蚪M多樣性計劃(humangenomediversityproject,HGDP)采集世界各地人群標本，鑒定人群基因組的多態(tài)性，建立資源庫儲存世界人群多樣性的信息及遺傳統(tǒng)計數(shù)據(jù)和各種生物樣本。2）基因組的表達調(diào)控和蛋白質(zhì)組學的研究蛋白質(zhì)組(proteome)：由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部相應的蛋白質(zhì)。是一個動態(tài)的概念。雙向凝膠電泳

（2－dimentionalgelelectrophoresis,2-DGE）質(zhì)譜鑒定（massspectrometry,MS）計算機圖像數(shù)據(jù)處理和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)芯片生物信息學以大分子為研究對象，以計算機為工具，運用數(shù)學和信息科學的觀點、理論和方法去研究生命現(xiàn)象，組織和分析呈指數(shù)級增長的生物信息數(shù)據(jù)的一門學科。由數(shù)據(jù)庫、計算機網(wǎng)絡、和應用軟件組成。研究熱點：序列對比基因識別和DNA序列分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測分子進化數(shù)據(jù)庫中知識發(fā)現(xiàn)（Knowledgediscoveryindatabase,KDD)常用數(shù)據(jù)庫Thehumangenomeorganization

Genbank

基因圖譜

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）

蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot)

目的：利用模式生物基因組與人類基因組再編碼序列和組織結(jié)構(gòu)上的同源性，用單一或簡單的生物模式闡明人類基因組在結(jié)構(gòu)和物種進化的內(nèi)在聯(lián)系。3）模式生物體（ModelOrganism）作為

功能基礎組學工具要求:成本便宜，供應量高容易安置繁殖容易，世代間隔短，生產(chǎn)量大容易操作處理基因量小而簡單。ModelOrganismsUsedinGenomics(1)大腸桿菌（Escherichicoli)原核生物模式生物(2)果蠅

（Drosophlmelanogaster,FruitFly）果蠅是遺傳學和分子發(fā)育生物學的國王，研究信號傳遞的模式生物。

日變周期老化性行為成癮行為（3）美麗線蟲

(Caenorhabditiselegans,C.Elegant)第一個完成基因組測序的多細胞生物細胞分裂與分化的調(diào)控的研究細胞凋亡的研究6月26日，HGP與Celera公司的領(lǐng)導人在白宮的慶祝儀式上共同宣布了人類基因組工作框架圖的完成，并約定將雙方的研究成果同時發(fā)表“腫瘤計劃”擱淺現(xiàn)HGP精神（全球共有，國際合作，即時公布，免費安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號：MegaBACE500/1000/40001％，內(nèi)含子24％，間隔序列75％HGP負責人CollinsF.隨機打成大片段選擇并克隆優(yōu)生優(yōu)育6月26日，HGP與Celera公司的領(lǐng)導人在白宮的慶祝儀式上共同宣布了人類基因組工作框架圖的完成，并約定將雙方的研究成果同時發(fā)表有重復序列存在，小鼠和人類比例最高指基因組中任何單拷貝的長度在100～500bp之間的DNA序列，與核酸內(nèi)切酶識別序列相關(guān)聯(lián)。意義：為疾病相關(guān)基因?qū)ふ姨峁┯行а芯抗ぞ邘缀跛型毎鲋秤嘘P(guān)的基因，都與腫瘤有關(guān)共享）的百慕大原則。細胞分裂與分化的調(diào)控的研究（4）酵母(Saccharomycescerevisiae,Yeast)細胞周期核DNA修復的模式酵母雙雜交技術(shù)的發(fā)展（5）小鼠(Musmusculus,Mouse)2002年12月完成基因草圖小鼠的蛋白質(zhì)與已知的人類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)很相似，與人的同源性高達80%理想的模式生物，與人親緣最近。6)其它模式生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)

Nature408:796-815(2000)

第一個植物的全基因組全長125Mb，10條染色體，25,498個基因。共同特征：基因組比較小，編碼基因比例高，重復序列少GC含量高，CpG島比例也較高。和進化程度成反比。有重復序列存在，小鼠和人類比例最高不同物種中，重要生物功能由同源序列基因蛋白承擔。同線（Synteny）的同源基因在不同物種基因組中有相同連鎖關(guān)系生物體復雜性與基因組的C值大小及基因數(shù)量未必呈線性關(guān)系在基因組圖譜和測序基礎