基因工程技術(shù)

基因工程技術(shù)Jackson,Symons,andBerg(1972)–generatedfirstrecombinantDNAmoleculesCohenandBoyer(1973)–producedfirstplasmidvectorcapableofbeingreplicatedwithinabacterialhostTheNobelPrizeinChemistry1980定義：基因工程（geneengineering）

重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique）：是指在各種酶的作用下，將細胞外的核酸片斷（目的基因）在體外與病毒、細菌或其它載體通過入工剪切、連接構(gòu)成重組DNA分子，將其導入受體細胞并使之無性繁殖（稱之為“克隆”）和表達，這種有目的的應(yīng)用分子克隆技術(shù)，人為地改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程，總稱為基因工程。應(yīng)用：克隆感興趣基因進行序列分析，研究其組織結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)入原核表達載體，進行大規(guī)模蛋白質(zhì)合成，生產(chǎn)多肽產(chǎn)品。轉(zhuǎn)入真核表達載體，導入細胞，研究其功能，表達調(diào)控機制等基因工程基本步驟：分、切目的基因+載體分子轉(zhuǎn)導入到合適的受體細胞（轉(zhuǎn)化）接構(gòu)成重組DNA分子篩篩選含有重組分子的克隆鑒鑒定重組分子片段

基因工程流程示意圖構(gòu)建重組分子（連接）原料：目的基因：研究對象載體：目的基因的運載工具工具酶：連接酶、限制性內(nèi)切酶

目的基因片段來源：基因組DNA（非編碼序列）PCR方法擴增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它克隆構(gòu)建或從商品化的cDNA文庫擴增）通過RT-PCR方法得到目的基因cDNA人工合成基因片段（價錢昂貴）目的基因來源選擇：取決于解決什么問題？基因功能研究

cDNART-PCR基因表達調(diào)控的研究基因組DNAPCRPCR：引入合適的酶切位點，一個/兩個。加保護堿基，1-3個。加上想要的標簽，如Flag,Myc,His,HA。啟始及終止密碼子。高保真聚合酶：HF，Pfu，Probest等。片斷的回收與純化載體：載體(Vector)是目的基因的運載工具，其作用是將目的基因帶入受體細胞中，并使目的基因擴增和表達。種類：按來源分：

質(zhì)粒載體(plasmidvector)、噬菌體載體(phagevector)、柯氏質(zhì)粒載體(cosmidvector)、病毒載體(virusvector).按作用分：

克隆載體(cloningvector)、表達載體(expressionvector)、穿梭載體(shuttlevector)

克隆載體(cloningvector)

用于在受體細胞中進行目的基因擴增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。主要由細菌質(zhì)粒或與其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的DNA重組構(gòu)建（pBR322）。表達載體(expressionvector)

使目的基因在宿主細胞中得以表達的載體?？蓪⒅亟M體DNA導入適合的受體細胞，使所載荷的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯（pcDNA3）。穿梭載體(shuttIevector)

能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來穿梭的載體。其可同時具有細菌質(zhì)粒的復(fù)制原點和真核生物可識別的復(fù)制原點或酵母菌的自主復(fù)制序列（ARS），它即能在

原核細胞中擴增又能在真核細胞中復(fù)制和表達。主要用于原核細胞與真核細胞之間進行基因轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒載體具有復(fù)制起始點，這是質(zhì)粒自我增殖的必要條件。具有較小的分子量，較高的拷貝數(shù)，是一個松弛型的質(zhì)粒。具有某種選擇性標記以區(qū)別轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細胞。大多是一些抗菌素抗性基因，賦予受體細胞對某些抗生素的抗性，為轉(zhuǎn)化子選擇提供便利。（Ampr；Tetr）具有若干限制性內(nèi)切酶單一識別位點，便于外源基因插入。

是細菌染色體外能夠自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。克隆載體:pBR322

特點：分子量小，4.3kb，便于操作。有兩個抗性基因，便于轉(zhuǎn)化子篩選。有幾個常用的限制性內(nèi)切酶的單一位點，分布在抗性基因上，7種位于四環(huán)素選擇標記上，4種位于Amp抗性基因上。外源基因的插入將破壞抗性基因的完整性，導致抗性基因插入失活，這種特性可用于區(qū)分重組和非重組分子。松弛性質(zhì)粒，在大腸桿菌細胞內(nèi)有較高的拷貝數(shù)，當細菌蛋白質(zhì)合成停止時，它仍能繼續(xù)復(fù)制。TA克隆AATOPO-TA原核

His-tag:pQE系列(Qiagen),pET22(Novagen)GST-tag:pGEX系列(Pharmacia)表達載體：帶有調(diào)控基因表達所必需的轉(zhuǎn)錄與翻譯元件，如啟

動子等，這些調(diào)控元件應(yīng)與宿主細胞相適應(yīng)。pcDNA3系列(Invitrogen)，真核表達載體：大多是穿梭載體。pFLAG-CMV系列(Sigma)

DNA分子的體外連接：方法

粘性末端：相同的粘性末端互相配對進行連接

兩種情況：（a）目的基因和載體用同一種限制酶切割后連接。載體易自身環(huán)化。用堿性磷酸酶(能除掉DNA兩端的5’磷酸基團）處理載體，可防止載體自身環(huán)化。（b）目的基因和載體用兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶切割后連接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。堿性磷酸酶處理：平頭末端：（1）增加連接酶的量（連接酶對平末端DNA的Km約高于粘性末端DNA100倍）（2）在末端加上一個人工接頭，內(nèi)含有一定的限制性內(nèi)切酶位點，經(jīng)酶切處理產(chǎn)生粘性末端，然后與載體連接。如加上一個人工接頭內(nèi)含GAATTC序列，用EcoRI酶切，產(chǎn)生EcoRI粘性末端。EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ連接策略：pCMV連接濃度：

片段與載體連接機率＞自身環(huán)化

一般計算公式：粘性末端：載體片段含量（ng）/載體長度（kb）1DNA片段含量（ng）/DNA片段長度（kb）3-5

平末端1：5~10﹦連接反應(yīng)：10ul體系H2OBufferVectorInsertligase14℃過夜連接反應(yīng)條件連接酶的活性；DNA的純度；載體與目的基因的比例；PH值7.2-7.8適宜；14℃(不高于16℃)過夜連接酶：兩種DNA連接酶：連接雙鏈中兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，封閉雙螺旋骨架缺口。需要一條DNA鏈的3‘-末端具有游離的OH，另一條DNA鏈5’-末端的磷酸基團-P，吸能反應(yīng)，需ATP存在。也可做DNA修復(fù)。但不能連接兩條單鏈DNA分子和環(huán)化的單鏈DNA分子。而且只能連接粘性末端。T4DNA連接酶：是從感染T4噬菌體的E．coli中分離得到的一種連接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接頭。用途比DNA連接酶廣泛，是分子生物學研究及基因克隆中較常用的連接酶。其他酶：末端修飾酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）

簡稱末端轉(zhuǎn)移酶。在合適的反應(yīng)系統(tǒng)中，這種酶使DNA片段平末端的3′-OH加上同聚核苷酸，產(chǎn)生具有poly（A）、或poly（T）、或poly（G）、或poly（C）的粘性末端。堿性磷酸酶

根據(jù)DNA重組的需要，為防止兩DNA片段末端之間連接，經(jīng)常采用堿性磷酸酶處理，使DNA末端的5′-P成為5′-OH。目前采用的堿性磷酸酶有兩種，即來源于大腸桿菌的細菌堿性磷酸酶（BAP）和來源于小牛腸的小牛腸堿性磷酸酶（CIP）。CIP的比活性比BAP高出10倍以上，而且對熱敏感，便于加熱使其失活。重組子導入受體細胞：把重組DNA導入受體細胞進行擴增.根據(jù)所用載體的特性選擇適宜的受體細胞（原核，真核）及選擇適宜的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法。受體細胞的要求：必須具備使外源DNA進行復(fù)制的能力（提供復(fù)制所需的原料）而且還應(yīng)該能夠表達由導入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細胞的選擇與鑒定。重組子導入受體細胞：途徑轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導入細菌（感受態(tài)菌）的過程轉(zhuǎn)染：噬菌體、病毒、或以它作為載體構(gòu)建的重組子主動或被動被導入細胞的過程。

感染：以病毒為載體的重組子，在體外包裝成具有感染力的病毒顆粒，通過感染受體細胞，然后整合到受體細胞基因組上。轉(zhuǎn)化受體細胞：大腸桿菌，基因工程中最常用的宿主細胞轉(zhuǎn)化機理：細菌細胞的生物學特性由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變。轉(zhuǎn)化效率：只有很少比例的細胞有能力摻入質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化時大約在1000個DNA分子中，只有一個DNA分子獲得成功。一般每微克完整的pBR322DNA產(chǎn)生105-107轉(zhuǎn)化