解淀粉芽孢桿菌bgp14對胡蘿卜軟腐歐氏菌的分離鑒定及生物防控效果

解淀粉芽孢桿菌bgp14對胡蘿卜軟腐歐氏菌的分離鑒定及生物防控效果

芋頭是天南星科的一種植物。地下莖中富含淀粉和各種微礦物。具有二者之藥、食用之功效。它廣泛種植于中國長江流域和南部，是人們喜愛的健康食品。每年10—11月份采收芋頭塊莖,進行貯藏,以便長期供應市場。在保藏過程中,由于芋頭呼吸旺盛、濕度高、傷口多,容易引起病原菌的侵染,從而腐爛變質(zhì)。其中,由胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora,Ecc)引起軟腐病是導致貯藏期芋頭腐爛變質(zhì)的主要原因之一。目前,貯藏期芋頭軟腐病的防治主要依靠化學殺菌劑和抗生素,例如次氯酸鹽、農(nóng)用鏈霉素、代森銨等。近年來,隨著人們食品安全意識的提高,化學殺菌劑和抗生素被嚴格限制或禁止在采后農(nóng)產(chǎn)品上應用,這就促使研究者尋求更加安全的采后農(nóng)產(chǎn)品病害防治替代技術?；谖⑸锏纳锓揽丶夹g被認為是未來貯藏期農(nóng)產(chǎn)品病害控制的主要發(fā)展方向之一,例如枯草芽孢桿菌、羅倫隱球酵母等。本實驗擬從容易發(fā)生軟腐病的環(huán)境中分離篩選對Ecc具有較高拮抗活性的生防菌株,評估其對貯藏期芋頭軟腐病的生防效果,初步分析其可能的作用模式。1材料和方法1.1平板培養(yǎng)平板樣品分別來源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜田表層土壤和新采收的芋頭表面黏附土壤,每種樣品隨機收集200g,晾干、混勻。每種土壤樣品取10g,分別加入到含有100mL滅菌水的250mL錐形瓶中,在200r/min、30℃的條件下孵育4h。利用蒸餾水梯度稀釋,涂布2YT(胰蛋白胨17g/L、酵母提取物10g/L、NaCl5g/L,pH7.0)瓊脂平板,將平板在30℃條件下培養(yǎng)16h。從平板上挑取單菌落,在2YT平板上劃線純化培養(yǎng)2次,將純化后的單菌落劃線保存在2YT平板上待用。1.2yt液體培養(yǎng)基將純化的單菌落在2YT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為150r/min、30℃、36h,培養(yǎng)液備用。將病原菌Ecc(本研究室從貯藏期芋頭上分離鑒定并保存)在2YT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為150r/min、30℃、12h。將培養(yǎng)好的Ecc菌液按照1%的體積比加入到液態(tài)的2YT瓊脂培養(yǎng)基中(溫度低于40℃),迅速混勻、倒平板。凝固后利用滅菌打孔器在每個平板上均勻打6個孔(直徑為4mm),在每個孔內(nèi)滴加待驗證生防菌菌液40μL。將處理好的平板放置在30℃培養(yǎng)24h,然后調(diào)查每個菌株的拮抗圈直徑,以未加生防菌菌液的孔作為空白對照組。每個菌株接種3個孔,相同的實驗重復了3次。1.3人民群眾的培養(yǎng)根據(jù)初篩的結果,選擇拮抗圈直徑大于10mm的菌株進行生防效果的活體評價。挑取具有較高拮抗活性的菌株在2YT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為30℃、150r/min、36h。取上述培養(yǎng)液40mL、10000r/min條件下離心30min,將上清液經(jīng)0.22μm細菌過濾器過濾后備用。另外,挑取病原菌Ecc單菌落于2YT液體培養(yǎng)基中,在30℃、150r/min條件下培養(yǎng)12h,利用滅菌蒸餾水稀釋50倍備用。實驗用芋頭是從江蘇省靖江市購買的香沙芋,選擇新鮮、大小基本一致、無損傷的健康香沙芋,利用次氯酸鈉溶液(體積比0.1%的有效氯)浸泡1min,然后用自來水沖洗、晾干。將芋頭的柄掰斷1~2cm,產(chǎn)生新的創(chuàng)傷斷面。將芋頭的創(chuàng)傷斷面分別浸沒在拮抗菌發(fā)酵液或上清中10s,對照處理樣品浸泡在清水中,在室溫條件下風干2h。然后在每個斷面接種Ecc菌液5μL。將處理好的芋頭放置在塑料保鮮箱內(nèi),22℃條件下孵育,每天觀察芋頭的發(fā)病情況,于第10天調(diào)查芋頭的發(fā)病率和腐爛情況。病斑面積大于0.2cm2時,定義為發(fā)病。每個處理設置3個重復,每個重復包含10個芋頭。1.4菌落形態(tài)觀察將菌株在2YT平板上劃線培養(yǎng),30℃條件下培養(yǎng)1~3d,連續(xù)觀察菌株在2YT平板上的菌落形態(tài)。挑取菌體,按照改良的Schaeffer和Fulton氏染色法觀察菌體形態(tài)和芽孢的形成。1.4.2pcr產(chǎn)物的測序基于生防菌BGP14菌株的16SrRNA和gyrB基因部分序列,對其進行分子鑒定。利用基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取BGP14的基因組DNA。利用16SrRNA通用引物fd2(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)和rp1(5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)擴增其部分序列,將PCR產(chǎn)物測序。利用gyrB的通用引物UP-1(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’)和UP-2r(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’)擴增其部分序列,利用測序引物UP-1S(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’)和UP-2Sr(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’)對PCR產(chǎn)物進行測序?；讷@得的16SrRNA、gyrB及GenBank下載的參考序列,利用ClustalX1.83軟件分別進行多序列分析。然后,利用MEGA5.05軟件分別構建基于16SrRAN和gyrB基因的遺傳進化樹,選擇PseudomonasfluorescensSBW25(NC_012660.1)作為遺傳進化樹的外圍參照菌株。1.5菌落計數(shù)測定按照1.3節(jié)的描述接種BGP14和Ecc,將接種好的芋頭按照1.3節(jié)的條件進行孵育。分別于接種后0、1、3、6、10d,調(diào)查BGP14和Ecc在芋頭傷口上的群體動態(tài)。在每個調(diào)查時間點,每個處理隨機取4個芋頭,利用滅菌手術刀將芋頭傷口及腐爛部分切下來,放置到滅菌坩堝內(nèi),添加2~3mL滅菌水研磨勻漿,最后利用滅菌水定容至15mL。將研磨好的樣品梯度稀釋,分別涂布2YT平板(調(diào)查BGP14菌落數(shù))和含有100μg/mL利福平的2YT平板上。30℃條件下孵育16h,測定Ecc菌落數(shù)量。每個處理設置3個重復,每個重復接種25個芋頭。1.6酶活力測定按照1.3節(jié)的描述接種BGP14和Ecc,將接種好的芋頭按照1.3節(jié)的條件進行孵育。分別于接種后0、1、3、6、10d取樣。在每個調(diào)查時間點,每個處理隨機取5個芋頭。切取與接種傷口及腐爛病斑鄰近的組織,切成約5mm×5mm的小塊,用液氮速凍,保存在-70℃?zhèn)溆?。實驗開始時,每個處理取冷藏的樣品5g,加入到10mL200mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.4)中,再添加0.5g聚乙烯吡咯烷酮。利用勻漿機勻漿,然后在4℃、10000r/min離心40min,上清被用來測定酶活力。參照文獻ZhaoYancun等的描述方法測定芋頭的苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalaninammonia-lyase,PAL)活性。參照湯章城的描述方法測定過氧化物酶(peroxidase,POD)活性,根據(jù)芋頭的特點進行了一些改動。反應混合液包括0.5mL的粗提酶液和2mL愈創(chuàng)木酚(100mmol/L磷酸鈉,pH6.4,10~50mmol/L愈創(chuàng)木酚,現(xiàn)配現(xiàn)用),在30℃條件下孵育5min。然后加入1mL雙氧水(H2O2,24mmol/L),測定470nm波長處的吸光度變化。POD酶活力單位定義:每微克蛋白中每分鐘吸光值上升0.01個單位定義為1個酶活力單位(1U)。所有實驗數(shù)據(jù)是3個重復實驗結果的平均值。利用Excel2003和SPSS13.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析,采用Tukey’s測驗進行差異顯著性分析(P<0.05)。2結果與分析2.1土壤細菌生長數(shù)據(jù)分別從蔬菜田土壤和芋頭表面黏附土壤分離純化了267和244株菌,對其進行平板拮抗實驗,結果發(fā)現(xiàn)3株(BGP14、BGP67、BGP109)來源于蔬菜田土壤和3株(YT38、YT103、YT231)來源于芋頭表面土壤的細菌在含有病原菌Ecc的2YT平板上產(chǎn)生了清晰且明顯的拮抗圈(直徑>10mm)(圖1)。其中,BGP14對Ecc的拮抗圈直徑最大,為12.2mm,但是該菌株與其他5個菌株之間差異不顯著(P>0.05)。2.2不同處理對植物清液發(fā)酵的影響為了進一步評估上述6個拮抗菌株的實際生防效果,分別測定了它們的發(fā)酵菌液和無菌上清對貯藏期芋頭軟腐病發(fā)病率的影響。如圖2所示,發(fā)酵菌液處理芋頭的發(fā)病率在6.7%~40.0%,均顯著低于對照(90.0%)(P<0.05),其中BGP14處理的發(fā)病率顯著低于YT38、YT103、BGP67和BGP109處理,僅為6.7%;無菌上清液處理芋頭的發(fā)病率在36.7%~60.0%之間,對貯藏期芋頭軟腐病也具有一定防治效果,但是明顯高于相應發(fā)酵菌液處理芋頭的發(fā)病率。以上實驗結果表明,拮抗菌BGP14的發(fā)酵菌液對貯藏期芋頭軟腐病具有良好生防效果。2.3srrna和gyrb的序列及測序結果同源性分析拮抗菌BGP14在2YT培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)為乳白色,表面皺縮、菌體為桿狀、形成芽孢。根據(jù)以上特征,初步判定為芽孢桿菌。為了進一步確定BGP14的分類地位,利用16SrRNA和gyrB基因序列對其進行了分子鑒定。利用通用引物,我們成功獲得了16SrRNA(1432bp)和gyrB(1179bp)的部分序列,并提交到GenBank數(shù)據(jù)庫,序列登陸號分別為JQ734536(16SrRNA)和JQ734539(gyrB)。利用鄰接法(Neighbour-Joining)分別構建了基于16SrRNA和gyrB序列的進化樹如圖3所示。在這兩個進化樹中,拮抗菌株BGP14都與BacillusamyloliquefaciensFZB42聚類在一起。對這兩個菌株的16SrRNA和gyrB基因序列分別進行BLASTn分析,結果發(fā)現(xiàn)它們的核酸序列同源性分別為99.9%和99.1%。以上結果表明,BGP14菌株屬于Bacillusamyloliquefaciens。2.4生防菌bgp14對4eb群的影響由圖4可知,在接種后24h,在僅接種病原Ecc的對照處理和聯(lián)合接種生防菌BGP14及Ecc的生防處理芋頭傷口上,Ecc的群體數(shù)量分別下降99.1%和99.3%。隨后,對照處理芋頭傷口上Ecc的群體數(shù)量迅速上升,接種后第10天的菌體密度達到2.0×1011CFU/傷口;但是,在生防處理的芋頭傷口上,病原菌Ecc增殖緩慢,接種后第10天的菌體密度為2.3×108CFU/傷口,僅為對照處理的0.1%。上述結果表明,生防菌BGP14顯著抑制了Ecc的增殖,從而達到對芋頭軟腐病的防控。另外,在生防菌與病原菌互作的初期階段,BGP14的群體密度維持在一個相對恒定的水平,此后緩慢增加。在接種后第10天,BGP14的群體密度達到1.8×109CFU/傷口,是初始接種量的35.6倍。2.5bgp14對芋pal和pod活性的影響PAL和POD是與誘導抗病性緊密相關的酶。圖5A表明,在創(chuàng)傷接種處理后,各處理組和對照組芋頭的PAL活性均下降,第3天下降到最低點,隨后上升。在整個實驗過程中,利用生防菌BGP14和病原菌E.carotovora處理芋頭的PAL活性始終高于僅接種E.carotovora的芋頭,大部分時間內(nèi)也高于清水對照處理。以上結果表明,在生物防治過程中,BGP14誘導芋頭的PAL活性顯著上升。圖5B表明,病原菌E.carotovora能夠誘導芋頭POD活性大幅上升,接種后第6天達到最高點,是初始水平的1.93倍,然后迅速下降;在先后利用生防菌BGP14和病原菌E.carotovora處理的芋頭上,POD活性迅速上升,在接種后第3天達到最高值,是初始水平的1.73倍,然后迅速下降。滅菌水對照處理芋頭的POD活性變化幅度較小。3發(fā)酵微生物對饅頭軟腐病的生防效果胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Ecc)能夠引起多種天南星科植物軟腐病,例如魔芋、芋頭等,大量相關研究主要集中在田間病害的生物防治。截止目前,通過文獻檢索還沒有發(fā)現(xiàn)針對貯藏期芋頭軟腐病生物防治的研究報道。病害的生物防治是一個生防菌、病原菌與寄主互作的復雜過程,并且該過程受到環(huán)境因素的影響。通過實驗室內(nèi)的平板拮抗實驗,本研究從蔬菜田土壤和芋頭表面黏附土壤中共獲得6株對病原菌Ecc具有較強拮抗活性的生防菌,但是,這并不表示它們對實際病害具有良好生防效果。deCosta等通過平板拮抗實驗從香蕉種植園分離獲得32株對香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)具有顯著拮抗活性的細菌,但是僅有4株拮抗菌在生產(chǎn)上對香蕉炭疽病表現(xiàn)出良好生防效果。通過活體評價方式,本實驗發(fā)現(xiàn)僅BGP14菌株的發(fā)酵菌液對芋頭軟腐病具有較好生防效果,處理芋頭的發(fā)病率僅為6.7%,其他5個菌株處理的發(fā)病率為30%~40%。大量研究表明,生防菌主要通過拮抗次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、對寄主傷口營養(yǎng)和空間的競爭或誘導寄主抗病性等方式抑制或殺死病原菌,從而阻止或延緩病害的發(fā)生及發(fā)展。本實驗發(fā)現(xiàn),BGP14發(fā)酵液無菌上清對芋頭軟腐病的防效為63.3%,但是其發(fā)酵菌液的生防效果高達93.3%,這表明BGP14菌體細胞和其產(chǎn)生的抗菌次生代謝產(chǎn)物在防治芋頭軟腐病過程中都發(fā)揮了重要作用。通過對生防菌BGP14和病原菌Ecc在芋頭傷口上的群體競爭動態(tài)分析,也發(fā)現(xiàn)BGP14在芋頭傷口上具有較強的適應能力和增殖能力,并且將Ecc的群體數(shù)量壓制在一個