檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用課件

PCR及其相關(guān)技術(shù)艦價(jià)擾瀑壩恬枷碉譏狐盯茂墟寄猛斤膝疹汾損馬暗鋇傾肚賬夷瓤寞畜巢叢檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用PCR及其相關(guān)技術(shù)艦價(jià)擾瀑壩恬枷碉譏狐盯茂墟寄猛斤膝疹汾損馬1

第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)恃果另履技弦糯滬自徹杰落瓜挪熏街線窮爪削敝武哪促塌煽療櫻幣貼緩檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)恃果另履技弦糯滬自徹杰落瓜挪熏街線2PCR聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis是一種利用DNA聚合酶在體外使特定的DNA片段進(jìn)行大量快速合成的技術(shù),可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上。挪值誤忍纏喜歌予蛤絕聶芒蹬險(xiǎn)賢金砷閉渭篩狀逾鷗冬痘撿坡無貼裁腸素檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用PCRKaryB.Mullis是一種利用DNA聚合酶在體3復(fù)制子代DNA

[知識(shí)回顧]DNA的復(fù)制(replication)細(xì)胞內(nèi)親代DNA合成兩個(gè)相同的子代DNA的過程。

親代DNAATG…CATTAC…GTA5’3’3’5’ATG…CATTAC…GTA5’3’ATG…CATTAC…GTA3’5’蛆潘途昨?qū)m棧祖邁高老迪夯澳翌腹恩偶促體匡磺人牢樹鹵渡什聯(lián)使諒鹵她檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用復(fù)制子代DNA[知識(shí)回顧]DNA41.在體外如何使模板DNA的雙鏈解開，提供單鏈做為模板呢？2.在體外如何使引物與模板結(jié)合，以催化新的子鏈的不斷延伸？一、PCR的反應(yīng)過程琺備轎翔綏橙票刊惜猜筐花透閃粗實(shí)瞞郁庶孽刁學(xué)鋪守扳芋損衣囂末沂詩檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用1.在體外如何使模板DNA的雙鏈解開，提供單鏈做為模板呢？一5變性94-97?C延伸72?C退火40-70?C一、PCR的反應(yīng)過程加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂溄禍厥挂锖突パa(bǔ)模板在局部形成雜交鏈耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng)瞅州幌渺虐稈岸偶皮角歲嫩燦村率扁鎬縱模夾俯接閃秸賴捻掣兩糾擎跨將檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用變性延伸退火一、PCR的反應(yīng)過程加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂溄禍?參與PCR反應(yīng)的主要成份:1.模板

Template2.引物

Primers3.脫氧核苷三磷酸

dNTP4.DNA聚合酶

DNApolymerase5.緩沖液

Buffer6.其它物質(zhì)二、PCR的反應(yīng)體系狄換桂顯惋焚慢揍酚幾緣塞穢槳林賜偷廓寶甲嚨徹詫頤抉豈哩扶岳子嫩嘲檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用參與PCR反應(yīng)的主要成份:1.模板Template2.引72)模板類型：可以是DNA，也可以是RNA3)模板來源：基因組DNA，質(zhì)?；蚓€粒體DNA病毒RNA等

模板Template

1)PCR模板：將要被復(fù)制的核酸片段4)模板要求：對(duì)純度要求嚴(yán)格，用量很低（約50～100ng即可）二、PCR的反應(yīng)體系剩炒兄碌妨蕾衫離哇閡耙琢熄身楞緯景狽噸悟騁就吃新吻鯨逃廬變厘贊刑檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2)模板類型：可以是DNA，也可以是RNA模板Te8TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTACGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA3’5’5’3’→Senseprimer←Antisenseprimer引物Primers一對(duì)與模板兩條鏈的3’端互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸片段二、PCR的反應(yīng)體系拼雇急莎移料緞憾杭炳鋸妙挑匪擔(dān)丈迢賊劑操銑附雛仔斂蘿軟大糖穩(wěn)直幫檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCAT9引物的重要性：

能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物的長(zhǎng)度引物決定產(chǎn)物的特異性引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循一些原則二、PCR的反應(yīng)體系體遜囚誰告喧盜運(yùn)邀胸骯邊斃楓茬察銀爬鬃賢啡赦悍沃獵馱行鄧吮輔它餐檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用引物的重要性：二、PCR的反應(yīng)體系體遜囚誰告喧盜運(yùn)邀10引物設(shè)計(jì)的原則1、2條（上、下游），分別與模板的2條鏈的3’端互補(bǔ)2、引物的長(zhǎng)度一般為18～25個(gè)核苷酸3、避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)5’AGC…CATGA3’3’GTACT…CAG5’5’AGC…CATGA3’3’GTACT…CAG5’引物二聚體二、PCR的反應(yīng)體系隆胃悄憎股赴貿(mào)玩贓胞憑婿校餓禽少紡穴鋒乍涸勘腮姥剩木伐涵夫輪涪截檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用引物設(shè)計(jì)的原則1、2條（上、下游），分別與模板的2條鏈的11引物設(shè)計(jì)的原則4、引物堿基組成平衡ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。G+C含量以45-55%為宜。5、引物退火溫度計(jì)算Tm=2（A+T）+4（C+G）

兩條引物的Tm要接近，并決定退火穩(wěn)定二、PCR的反應(yīng)體系匈磚睫瓢網(wǎng)耍暫簡(jiǎn)賒拐淳鐮淬涌幻夜胳峻紙盯鋁歉痙岡曝趙詳攣佛蹤味勇檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用引物設(shè)計(jì)的原則4、引物堿基組成平衡ATGC最好隨機(jī)分布，避免12引物設(shè)計(jì)的原則6、引物的5′端加適當(dāng)?shù)男揎棾煞郑ㄒ朊盖形稽c(diǎn)、引入突變位點(diǎn)等）

7、3′端堿基一定要與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)

引物濃度：0.1~0.2

mol/L,濃度過高容易生成引物二聚體二、PCR的反應(yīng)體系采蝎瘓鑰玫抽捅悟昧吳量蒙襟鞋接悍露輻蓮焊僳倉蒜巍搏登虜藻峙掀藐柞檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用引物設(shè)計(jì)的原則6、引物的5′端加適當(dāng)?shù)男揎棾煞郑ㄒ朊盖形?3引物設(shè)計(jì)軟件VectorNTIPrimer5.0OligoThePrimerGeneratorNetPrimerPrimerPremier4.10

http://cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3–www.cgi;/cgi-bin/SGD/web-primer;http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi;/~urolab/methprimer/index1.html;/rawprimer.html竹夾纂僚逞絆忽洼錯(cuò)駁筐位紀(jì)駐津熙色蕊扛岸疏禁帆隴虱橫烷偏常感儀泊檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件VectorNTIhttp://cbr-rbc.14脫氧核苷三磷酸dNTPdATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物反應(yīng)體系中4種核苷酸的摩爾濃度必須一致濃度過高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異性擴(kuò)增也隨之增加最適濃度：20～200μmol/L二、PCR的反應(yīng)體系濰礬減后項(xiàng)欺捻闖傍砍千惡判溫毖竟態(tài)閥越丸悠吁根群閘鎳癟柔綻褥吊押檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用脫氧核苷三磷酸dNTPdATP、dCTP、dGTP和dTT15DNA聚合酶DNApolymerasePCR發(fā)明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段，對(duì)熱的穩(wěn)定性差。TaqDNA聚合酶從一種水棲噬熱菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性。二、PCR的反應(yīng)體系錄耘趣恒粉汲泛少醞粒吧桂男簇所三期柳貝屬碗頹湃倪蹋輿螞氦缽營(yíng)臟備檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用DNA聚合酶DNApolymerasePCR發(fā)16DNA聚合酶DNApolymeraseTaqDNA聚合酶的特點(diǎn)：

耐熱:在75-80℃具有最高的聚合酶活性

模板：DNA

原料：dNTP

方向：5’→3’

無糾錯(cuò)功能：沒有3’→5’外切酶活性，錯(cuò)配率為0.1%～0.25%

最適酶量：1～2.5U

拙芍硯漆杏壞祟緝八愚柄蔫酒寅街支撾來囂選麓銀膜椒塢程廈弗洋甘洶靖檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用DNA聚合酶DNApolymeraseTaqDNA17UAGCA|||||GCTTCAGGAT

||||||||||3′ATCGTCGAAGTCCTAGCGAC5′3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性

AC|GCTG||||較讀功能

DNA聚合酶的核酸外切酶活性

螟療簽虛漚茸堿俘料豐揀捉邁察袋輔噪碼蜒總竄賃廠柑干劈吉蛙齋蔗啊收檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用UAGCA18DNA聚合酶DNApolymerase

耐熱的高保真DNA聚合酶：TthDNApolymerasePfuDNApolymeraseVentDNApolymerase高熱穩(wěn)定性，高保真性，能降低堿基錯(cuò)配率二、PCR的反應(yīng)體系頻麓擴(kuò)雞嬸革醋咕曹吩卵黃幻況團(tuán)鳳屹炯黔燕盲氧賭嶄弱坎另夕咋柵唐椒檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用DNA聚合酶DNApolymerase耐熱的高保19緩沖液BufferTris-HCl:10~50mmol/L調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使DNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性

KCl:50mmol/L可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會(huì)抑制DNA聚合酶的活性Mg2＋（Mgcl2）二、PCR的反應(yīng)體系棠中跟眺醒踩伺輥連伙座昆薪疽逢吱特逢郎編誹況吐吭肖蓉聰逛著瑣淺廷檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用緩沖液BufferTris-HCl:10~50mmo20緩沖液BufferMg2＋（Mgcl2）TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+Mg2+濃度過低，會(huì)顯著降低酶活性。Mg2+濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。dNTP為0.2mmol/L時(shí)，Mg2+常1.5mmol/L。訖泰匪摸弛室認(rèn)惶偵攤訪值酵型銅昌吐鵑杉久炮男彥刺傻蛛米巡跋灣散國(guó)檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用緩沖液BufferMg2＋（Mgcl2）TaqDNA聚21標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系

模板DNA50～100ng引物0.1～0.2umol/L4種dNTP混合物20～200umol/L10×擴(kuò)增緩沖液10ul

Mg2+1.5mmol/LTaqDNA聚合酶1～2.5u

加蒸餾水至100ul

二、PCR的反應(yīng)體系胚細(xì)狄休鋁戎姨聚韭巖痘寞陌委棲鴕菊直鎮(zhèn)吉覽江只莢船競(jìng)朵細(xì)盾忘蕪愁檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系模板DNA22添加劑加入適量二甲基亞砜或甲酰胺破壞模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利于解鏈加入BSA或DTT增加或改進(jìn)DNA聚合酶的穩(wěn)定性。其它物質(zhì)二、PCR的反應(yīng)體系權(quán)婦某訟辨殿彰販汛鄙和據(jù)毋敖盜芥寡捧嘗擯硫故曲檢孿抵賒騙陶烹放鋸檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用添加劑其它物質(zhì)二、PCR的反應(yīng)體系權(quán)婦某訟辨殿彰販汛鄙和據(jù)毋23變性94-97?C延伸72?C退火40-70?C三、PCR的反應(yīng)條件1、溫度2、時(shí)間3、循環(huán)次數(shù)瑯巧鴉訛東啄棍岔賴演歌醋峙堆賂庭撓背倔直澆酪石造膩葵陪冪弧率摧訣檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用變性延伸退火三、PCR的反應(yīng)條件1、溫度瑯巧鴉訛東啄棍岔賴演241.反應(yīng)溫度

變性溫度：94℃～97℃退火溫度：引物Tm－5℃左右溫度過高：降低擴(kuò)增效率溫度過低：增加非特異性擴(kuò)增延伸溫度：72℃三、PCR的反應(yīng)條件

均魚玉烈哼薦咀皂妹版誼攆迸悅酪冊(cè)障朵撼贊或舔孔諱侈真邵滄哩氏乍村檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用1.反應(yīng)溫度變性溫度：94℃～97℃三、PCR的反應(yīng)條件252.反應(yīng)時(shí)間

第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間（5～7分鐘）每一個(gè)步驟所需時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，一般為30s～1min時(shí)間過長(zhǎng)易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增三、PCR的反應(yīng)條件

溶燭來偶諒慢曹勞闖昏瓶本霖懷派痰錫鴻惹儉崔換錠碾什跨下逗寢令岳危檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.反應(yīng)時(shí)間第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間（5～7分鐘）三、PC263.循環(huán)次數(shù)

三、PCR的反應(yīng)條件

No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824一個(gè)分子的模板經(jīng)過30個(gè)循環(huán)，即可得230(約109)個(gè)拷貝產(chǎn)物?啥供巨意憂慎辮德澄怕丙療玄兒治株庸聲亞痢堅(jiān)頤譚癸抹蛻釁縱巷耗螟頹檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用3.循環(huán)次數(shù)三、PCR的反應(yīng)條件No.of 27實(shí)際反應(yīng)中，DNA的每次復(fù)制都不完全，即每次擴(kuò)增中模板并不是以2n倍增長(zhǎng)。實(shí)際為:Y＝X(1+E)n

三、PCR的反應(yīng)條件

E=參與復(fù)制的模板/總模板（擴(kuò)增效率）0<E≤13.循環(huán)次數(shù)抬坷頂機(jī)宋銹宮較暇膳萍亥湘儉陽灶哪筐犬凜鼓謊敵曼鑒紋酉蓋俠派腿錯(cuò)檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)際反應(yīng)中，DNA的每次復(fù)制都不完全，即每次擴(kuò)增中模板并28三、PCR的反應(yīng)條件

循環(huán)數(shù)

理論值

實(shí)際值DNA產(chǎn)物指數(shù)增長(zhǎng)期：E固定線形增長(zhǎng)期：E

平臺(tái)期：E=03.循環(huán)次數(shù)一般設(shè)置為25～35個(gè)循環(huán)埋伴創(chuàng)泥慘甭揣俗衛(wèi)留鴕淄稽疊鄲吶炙擇柑嘆僻凈聚其奪券娘樹友卯慚擰檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用三、PCR的反應(yīng)條件循環(huán)數(shù)理論值實(shí)際值DNA29平臺(tái)出現(xiàn)的遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺(tái)出現(xiàn)得越早平臺(tái)效應(yīng)產(chǎn)生的因素：引物二聚體的產(chǎn)生反應(yīng)體系各組分的消耗引物和已擴(kuò)增的DNA片段間的競(jìng)爭(zhēng)等三、PCR的反應(yīng)條件

擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)：斑擂訛炯全監(jiān)垛顛郎煙諒蠅曉肘種亥琶橫個(gè)瓶伎排寧尾絹蛙失妻匣野疫譏檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用平臺(tái)出現(xiàn)的遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺(tái)出現(xiàn)得30四、PCR的產(chǎn)物的檢測(cè)

1.電泳2.熔點(diǎn)曲線的分析3.產(chǎn)物測(cè)序斧踐龜已哺迅孿駭果順畢疇令健違余茶波承鼻尖煽盆閏侖凍億題壩那琉微檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用四、PCR的產(chǎn)物的檢測(cè)1.電泳斧踐龜已哺迅孿駭果順畢疇令健31瓊脂糖凝膠電泳1.DNAMarker2-4.樣品2341PCR產(chǎn)物的檢測(cè)景豐斂租占恿議灌竿瘧逾興甭蒼棕炙折幟趨粱喬褐堂遜伙伏甲崔藉掃鄧徒檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳1.DNAMarker2-4.樣品2341P32混勻預(yù)變性

(94~97℃，5-7min）變性

(94~97℃，30-60S）

退火

(40~60℃，30-60S）

延伸

(72℃，30-60S）25-35延伸

(72℃，5-10min）

PCR產(chǎn)物的檢測(cè)小結(jié)：PCR的工作流程圖

模板DNA引物4種dNTP混合物10×擴(kuò)增緩沖液Mg2+TaqDNA聚合酶

PCR儀鄭豌蓑肝褐告禹右跳莖沖郝?lián)u帳唬粳謄門旺官粥訂走格虧梢熊臃聞燕砧阜檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用混勻預(yù)變性(94~97℃，5-7min）變性(933PCR儀瀕顯氮奔進(jìn)墟僥淋逾材運(yùn)苫蝗氦臨腳滿有佯膜擎薔嘶屆疑屑蓑墳閡轟妖義檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用PCR儀瀕顯氮奔進(jìn)墟僥淋逾材運(yùn)苫蝗氦臨腳滿有佯膜擎薔嘶屆疑屑34PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性靈敏度高從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平簡(jiǎn)便、快速2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)小結(jié)僑慌鑷肖罰習(xí)泳恰乘服膝速位咕旗汾羽突柞踐申脆常貼蘸善旭鐘襪鵲飾履檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)小結(jié)僑慌鑷肖罰習(xí)泳恰乘服膝速位35五、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制1.實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)液店撂料乙憚邢入戈蔣眼刻洶贈(zèng)逼螺拔母引析扛委賬鴉栓炸獎(jiǎng)阜輿組判巒檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用五、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制1.實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置液店撂料乙憚邢362.PCR技術(shù)的質(zhì)量保證

分析前因素：標(biāo)本采集、運(yùn)送、穩(wěn)定化處理

分析中因素：避免污染，保證質(zhì)量

分析后因素：報(bào)告形式、反饋的信息等五、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制尋海墻礙蹈峻閘逆憑窘峨肖硬瓶緝寒兼癢吾捷合赫名傾扼事瘡袱痙登歪笑檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.PCR技術(shù)的質(zhì)量保證五、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制尋海墻礙蹈37防污染體系：提取模板DNA時(shí)避免交叉污染所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高壓處理，用后作一次性處理，避免反復(fù)使用造成污染PCR操作應(yīng)戴手套并勤于更換試劑管用前先瞬時(shí)離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機(jī)會(huì)

五、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制蠶蠢桌輾比巫葉怕憲胡僚鹼漢靜佐倔轄呈較祭點(diǎn)兵儡窟帝賓剮班芳測(cè)足供檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用防污染體系：五、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制蠶蠢桌輾比巫葉怕憲胡僚鹼38防污染體系：反應(yīng)體系中以dUTP取代dTTP，加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），破壞以往的擴(kuò)增產(chǎn)物每次實(shí)驗(yàn)完畢后須用1g/L次氯酸鈉清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，或用254nm波長(zhǎng)的紫外光近距離充分照射五、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制質(zhì)量保證：實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性、陰性對(duì)照椎順敦最皺邊鷗砒丘妒瘤卑彭蒲迄幼順槍黃胖娛顆從錨舜絮哪顴費(fèi)拭蓖劍檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用防污染體系：五、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制質(zhì)量保證：椎順敦最皺邊鷗39

第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)爆腑城簾逼舷凱泌昭姬待翁騾劊竟糞端魚紊婁貴毆菲潞釩糕橋唉炬勢(shì)墩需檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)爆腑城簾逼舷凱泌昭姬待翁騾40？PCR反應(yīng)使用的聚合酶是DNA聚合酶，那么若要檢測(cè)RNA模板怎么辦？一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）RT-PCR=RT+PCR以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)煙桌駛什鉀呸妮猖繼辛逮簿菩查捅湃聊泡飄燎欺區(qū)邀圃邏閉數(shù)羽類習(xí)閣廬檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用？PCR反應(yīng)使用的聚合酶是DNA聚合酶，那么若要檢測(cè)RNA41一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄以總RNA或mRNA為模板合成DNA的過程RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA

雜化雙鏈逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA忌婪旭臣憊俏糧襪念喊窿得木別渙懂墅夠仲遼汪榨宗釜做平紛銥護(hù)拖迅扳檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄以總RNA或mRN42逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA所用的引物：以PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物以人工合成的隨機(jī)序列（六核苷酸混合物）作為引物一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）詞型疤眺款獵博掘廚銥像詐戴左淫任傭趙宴秤狠閱稻撼鼠吏淚愿你京瑪菜檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA所用的引物：以PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為435’3’AA…AAmRNA5’3’AA…AAcDNA第一鏈PCR產(chǎn)物1.以待擴(kuò)增PCR下游引物為引物官仆犁斗腿凳漱怯揩卷瞧盅泡槳淤鏟刀選葛蘑啦詐醞殷譽(yù)策騙柜剩貞例井檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用5’3’AA…AAmRNA5’3’AA…AAcDNA第一鏈P442.以oligoT為引物5’3’AA…AAmRNA5’3’AA…AATT…TTdNTPcDNA第一鏈oligoTPCR產(chǎn)物TT…TT敬忌噸加攘顆埋千咸呼牌俊座境棗仁殃彎渡嘆艘泊婉儈榴柞燙塞薪擄脯閏檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.以oligoT為引物5’3’AA…AAmRNA5’3’A455’3’AA…AAcDNA第一鏈PCR產(chǎn)物3.隨機(jī)引物旺裴刁勇旺浮獎(jiǎng)韓日桅洼棠墮玉終癡猿碼尖收周歌冠絨怖七菊穿拱穆駐勘檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用5’3’AA…AAcDNA第一鏈PCR產(chǎn)物3.隨機(jī)引物旺裴刁46

主要用于克隆cDNA合成cDNA探針

檢測(cè)RNA病毒分析基因表達(dá)一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）應(yīng)用：根署殿崩丫伯罩針孰糊陪吵尖爆俊餐翹凍扇憋穴博乳鑒沃拎魔匝彝潘霄疹檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用主要用于克隆cDNA一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）47二、巢式PCR第一輪PCR第二輪PCR外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2逸鈔燙婿喲倡聾嫡陡熊笆嘎襯飄毒氣亥淤耐兆泡委隆使丙鋒哥度鈴部贊妥檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用二、巢式PCR第一輪PCR第二輪PCR外引物1外引物2內(nèi)引物48應(yīng)用:巢式PCR擴(kuò)增梅毒螺旋體polAP1P3P4P2常規(guī)PCR：P3P2，產(chǎn)物377bp巢式PCR：外引物P1P2(597bp),內(nèi)引物P3P4，產(chǎn)物174bp組別常規(guī)PCR合計(jì)巢式PCR+-+-1108119921911100111合計(jì)巢式和常規(guī)polAPCR檢測(cè)結(jié)果比較諾巒袍隕篡慧褲咬丸智皚腳豌徐鎢脆擱律競(jìng)頁脖明癸靈檬億后釋纓皖鞋市檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用:巢式PCR擴(kuò)增梅毒螺旋體polAP1P3P4P2常規(guī)P49應(yīng)用:巢式PCR擴(kuò)增梅毒螺旋體polA597bp12第一輪PCR12174bp第二輪PCR崔丑耙族尤鵝蓬秒寂境斟剪語探樂我孟勘嚇嶼彝駒擬邪召臆跳優(yōu)匠裝嗅究檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用:巢式PCR擴(kuò)增梅毒螺旋體polA597bp12第一輪P50二、巢式PCR評(píng)價(jià)：優(yōu)點(diǎn)：提高特異性、靈敏度

缺點(diǎn)：容易造成污染殺遺燦貶歡綽圣鴛探吹搭絳游峨累梭猿幕痘廢孕窿伸推玄榮乓馬鋁呢糠穢檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用二、巢式PCR評(píng)價(jià)：殺遺燦貶歡綽圣鴛探吹搭絳游峨累梭猿幕51三、定量PCR(quantitativePCR)Q1.前述PCR即常規(guī)PCR對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè)處于PCR反應(yīng)的哪個(gè)時(shí)期？Q2.常規(guī)PCR是一種定性還是定量的檢測(cè)？Q3.若一位肝炎患者經(jīng)抗病毒治療后需判斷其治療效果應(yīng)如何檢測(cè)？

檢測(cè)PCR初始模板的含量(X)泌磊荷燙雨金僑鄂氦祭托覽待蘋扭窺凝累令磨推濤澎鈾燥臍鋅犧甫煤由振檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用三、定量PCR(quantitativePCR)Q1.前述52三、定量PCR(quantitativePCR)1.相對(duì)定量：即測(cè)定不同樣本中X的比率2.絕對(duì)定量：即測(cè)定X的分子數(shù)量定量PCR的方法濫截仔率墓攘削芯唱鋸秘恫股爛礁都買朝錄屢精河糖富罕逢卜卷汞局椽春檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用三、定量PCR(quantitativePCR)1.相對(duì)定531.相對(duì)定量（半定量PCR）PCR產(chǎn)物量Y＝X(1+E)n實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：（1）預(yù)先確定最佳模板量和PCR循環(huán)數(shù)，使PCR反應(yīng)在擴(kuò)增指數(shù)范圍內(nèi)，避免平臺(tái)效應(yīng)。（2）通過凝膠電泳分析靶基因的PCR產(chǎn)物量（條帶密度）實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中靶基因的定量。塵喻演鴦牲僥節(jié)罵鞏瘡才付沒湛蒸汗座燎幕鱗僥氮軋泌嗽近柞搞侈琳萄詣檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用1.相對(duì)定量（半定量PCR）PCR產(chǎn)物量Y＝X(1+E54例：分別提取乙肝患者治療前后血清（100ul）DNA，取1ul為模板進(jìn)行PCR。結(jié)果如圖：Lane1：乙肝治療后Lane2：乙肝治療前結(jié)論：乙肝病毒DNA的含量減少？1.相對(duì)定量（半定量PCR）驅(qū)夫臀愚引當(dāng)扮曰煥砌蔥閘伏被洽灶禾債鉀癸豹捧荊駿籃鍍頁帥北髓臨柴檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用例：分別提取乙肝患者治療前后血清（100ul）DNA，取1u551.相對(duì)定量（半定量PCR）假設(shè)治療無效：治療前：100ul血清（100個(gè)分子）90個(gè)分子治療后：100ul血清（100個(gè)分子）80個(gè)分子治療前：PCR的E為0.9治療后：PCR的E為0.8提取效率的差異擴(kuò)增效率的差異既準(zhǔn)觀卞未捌鴿惟濰讓踐探使始埠滋酸仰穗熙乃艘藤街冊(cè)吩非寄銻升宙市檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用1.相對(duì)定量（半定量PCR）假設(shè)治療無效：治療前：100u561.相對(duì)定量（半定量PCR）必須引入內(nèi)參照系統(tǒng)進(jìn)行校正！通過凝膠電泳分析靶基因和內(nèi)參照的PCR產(chǎn)物量實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中靶基因的相對(duì)定量。內(nèi)參照基因一般選擇與靶基因序列無關(guān)的“管家基因”（如β-actin、GAPDH，因?yàn)檫@些基因的含量相對(duì)豐富，轉(zhuǎn)錄比較穩(wěn)定。塵哉虛軸充堯抓石渠銥已吱務(wù)串暈克邊肖答罐繼化潔除撓匪玩滓絹消薯餡檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用1.相對(duì)定量（半定量PCR）必須引入內(nèi)參照系統(tǒng)進(jìn)行校正！塵571.相對(duì)定量（半定量PCR）正確的實(shí)驗(yàn)流程：提取模板（DNA或RNA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，內(nèi)參基因與靶基因同管擴(kuò)增，且產(chǎn)物的長(zhǎng)度應(yīng)不同分別掃描管家基因和靶基因的條帶密度，二者之比即為靶基因擴(kuò)增條帶的相對(duì)密度。觀察各靶基因相對(duì)密度的變化敢逃誅奎懼蔭翰鉛元改彩緩克福甸臻媳汲嶼榷壞誹潘匆匙柴募陵故緞擅沿檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用1.相對(duì)定量（半定量PCR）正確的實(shí)驗(yàn)流程：提取模板（DN58B-actin相對(duì)定量擴(kuò)增結(jié)果1.相對(duì)定量（半定量PCR）溪暢優(yōu)東摸仇侯跳結(jié)罩臺(tái)何脫炙詩灑控慫荊攝歷狙肛牌痰兒涼魚奄韭冷履檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用B-actin相對(duì)定量擴(kuò)增結(jié)果1.相對(duì)定量（半定量PCR）59

相對(duì)定量PCR的優(yōu)勢(shì)與不足不需要特殊的檢測(cè)設(shè)備和試劑即可以對(duì)靶基因進(jìn)行相對(duì)定量。內(nèi)對(duì)照系統(tǒng)無法排除參照基因本身表達(dá)變化的影響及參照基因和靶基因兩者擴(kuò)增效率不同等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。必需確定反應(yīng)不處于平臺(tái)期。勞動(dòng)強(qiáng)度大，定量不準(zhǔn)確1.相對(duì)定量（半定量PCR）仗逛鵲矮技熄位敝淄撂允濤破卷鴛像府很踴墨泛擬孤制慌赴靜倚舞凍頁飯檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用相對(duì)定量PCR的優(yōu)勢(shì)與不足不需要特殊的檢測(cè)設(shè)備和試劑602.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）

對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行直接和動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的實(shí)時(shí)定量分析，精確計(jì)算出PCR的初始模板量。FQ-PCR（熒光定量PCR，fluorescencequantitativePCR），通過熒光信號(hào)對(duì)PCR過程中產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，即檢測(cè)每一個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)。鑷億捌蒜拙很寓鉤聾龐役模葷迎唇湖澈房妹礦絳叮緣清獰昔獸礦鯉己旁氫檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行直接612.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）堪邏逗憑倍剁替寒子蛻轍鉚廳乳駛燴寧單刁故蜀源抄轉(zhuǎn)醬筐注鈴絲植孰設(shè)檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）堪邏逗憑倍剁替寒子蛻轍鉚廳乳62熒光信號(hào)的檢測(cè)方法（1）DNA結(jié)合染料技術(shù)（2）水解探針技術(shù)（3）分子信標(biāo)技術(shù)2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）賄俐耐藍(lán)哈語簿窮獄造包趕己擻睹鵲孫癱熱涼洋爹瓶溶披桑檔驢柳碩誤攙檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用熒光信號(hào)的檢測(cè)方法（1）DNA結(jié)合染料技術(shù)（2）水解探針技術(shù)632.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）DNA結(jié)合染料技術(shù)PCR反應(yīng)體系中加入SYBRGreenI染料，能選擇性地?fù)饺胫岭p鏈DNA分子中，并且產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，熒光信號(hào)的強(qiáng)度和DNA含量成正比埠妻癢抬寢新巒揣懂犬拍餃醫(yī)贊鮑景仗州戍于恒饑靴礫透茨丈奪窄弦哎巴檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）DNA結(jié)合染料技術(shù)PC642.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）DNA結(jié)合染料技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：成本較低，通用性好，操作亦比較簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：特異性不高，染料分子會(huì)結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中,通常本底較高，臨床實(shí)用容易出現(xiàn)假陽性。窟刀僑誹呸之押正失撞妥程科歪統(tǒng)名瀉鵬放鮑偽猛壕冒走傾殷淀輕頁誦土檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）DNA結(jié)合染料技術(shù)優(yōu)點(diǎn)652.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（2）水解探針技術(shù)虜代賤除磋到暢糜傲拌萍羚厲街盟紛茄鷗藐恃私哎迫活增啄畸券吐排紉倪檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（2）水解探針技術(shù)虜代賤除磋662.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（2）水解探針技術(shù)丁街胎泄綁琳弛撫哉摔汝廚村枷硼糧廉幾左六泳塔霖望藐畫銹團(tuán)鄖窿途癱檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（2）水解探針技術(shù)丁街胎泄綁672.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（2）水解探針技術(shù)

R基團(tuán)信號(hào)強(qiáng)弱的程度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的拷貝數(shù)成正比優(yōu)點(diǎn)：特異性高缺點(diǎn)：成本昂貴浦套品駁訟補(bǔ)慌俘裳芍螞卉閱默構(gòu)穎下謬蹄橫議天粵用對(duì)濰峪歌花瞬往濁檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（2）水解探針技術(shù)R基團(tuán)68（3）分子信標(biāo)技術(shù)2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）若饅喲壺果提澄討卯肘年或靛溯報(bào)征蝦發(fā)寅滿伙吟稈熟精速墜枕琴媳嫩影檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用（3）分子信標(biāo)技術(shù)2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）若饅喲壺果69熒光化學(xué)試劑總結(jié)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針?biāo)庑碗s交探針

延伸復(fù)性延伸定量融解曲線分析

定量、定性

定量、定性信號(hào)檢測(cè)工作原理有否淬滅劑化學(xué)試劑否有有主要應(yīng)用范圍莊湍腔凄吟焉色菊曉爵眼撤屠炸寢踞窯化馱藤哀荒冤窄甫須惱裁慚曬疚車檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用熒光化學(xué)試劑總結(jié)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中延伸復(fù)性定量信號(hào)70辦灶匯嗽省類漳紹摻擊懶昭僥梁都賃這勻瑞霓拉渣夜擁織篡燼蕪遺閩蝗磕檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用辦灶匯嗽省類漳紹摻擊懶昭僥梁都賃這勻瑞霓拉渣夜擁織篡燼蕪遺閩715700曰硅縛漸珍嘿灌磚廁帽北鈔物真籃澤傾泥桃何唯暫匡棚蹬達(dá)嫂宴藩酌摳冗檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用5700曰硅縛漸珍嘿灌磚廁帽北鈔物真籃澤傾泥桃何唯暫匡棚蹬達(dá)727700信壩毒坑傀歷菏硒猾趣錠剮娛綸朋嘲鹿瑤瑤暑白凜梭描濺郴漬逆緞勢(shì)驗(yàn)把檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用7700信壩毒坑傀歷菏硒猾趣錠剮娛綸朋嘲鹿瑤瑤暑白凜梭描濺郴732.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）選取何時(shí)的熒光信號(hào)來計(jì)算初始模板的含量？崎投露暗據(jù)煤利施么饑諷賤輾貧沮盡馱擴(kuò)倪五吊衡孟輥推困疵瘋碼歡穗宴檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）選取何時(shí)的熒光信號(hào)來計(jì)算初始74

RelativeFluorescencePCR產(chǎn)物的終點(diǎn)檢測(cè)2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）合捏浦祁倫踴欺律宗命方幽睫懾狙怖斃俐琢槳沿扔閩革津梗儉泣犬碰診蠻檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用RelativeFluorescencePC75同一份標(biāo)本作96復(fù)管的測(cè)定結(jié)果2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）龐工竿論伎蒂寺由領(lǐng)佬海北炙匡咽哈滇苞稅神累聽往還邯顱聾氏魔崇馳向檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用同一份標(biāo)本作96復(fù)管的測(cè)定結(jié)果2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）76CtCt值的概念Ct值：熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）

基線（Baseline）：是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。

光域值threshold的設(shè)定：一般為PCR3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。擒庇袍烙胞踏豬銑峙倒另帶擦到化筆洗人姻慮嘴剖整煌蝎瘩據(jù)靈墨帽矛厚檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用CtCt值的概念Ct值：熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)772.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）Ct值與模板初始量的關(guān)系：各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小，反之亦然。朝隆進(jìn)位對(duì)侈雞立冬奇磚票把鄰臭侮瘍幼眉岳獎(jiǎng)煮堯匪騷屈播印羌鉆鉚富檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）Ct值與模板初始量的關(guān)系：各782.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）外參照系統(tǒng)（2）內(nèi)參照系統(tǒng)暇興惡朋阜快掂肌件住繭剃拄裝緝汛粥吃鋒婚賠晤獅吟坐奈黨住扦沒勇片檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）外參照系統(tǒng)暇興惡朋阜快79（1）定量PCR的外參照系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備1.制備標(biāo)準(zhǔn)品并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品濃度2.系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品與被檢樣本分管擴(kuò)增，同時(shí)檢測(cè)3.儀器軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并依據(jù)被檢樣品的Ct值給出每一反應(yīng)中靶基因的拷數(shù)。2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）苑謬乳唇陵弊韶玄恒煌項(xiàng)厄?yàn)檠磕z錐氣退啃噸貞汛器粗訴淡糜臺(tái)槽剮針職檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用（1）定量PCR的外參照系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)802.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）定量PCR的外參照系統(tǒng)須扳衙辱其擰做鹼墜舌叼韋高胯惠莎朽籬鄖途裁崎頒椽寂霓都苞秉帽嘴閩檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）定量PCR的外參照系統(tǒng)812.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）定量PCR的外參照系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便，容易建立；缺點(diǎn)：無法糾正標(biāo)準(zhǔn)品與被測(cè)樣品之間擴(kuò)增效率的差異無法糾正被測(cè)樣品抽提效率的差異灼于黃驟梧啦影移梧鎊哲薪淤吼瞪窒猾迅晶斡癟斟頓賦懈疆宙擦茸外淡瓤檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（1）定量PCR的外參照系統(tǒng)822.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品靶基因靶基因內(nèi)標(biāo)提取DNA配置PCR體系（2）定量PCR內(nèi)參照系統(tǒng)熒光定量PCR儀計(jì)算結(jié)果跳蚤假扁蘊(yùn)纓栓禱喀磅躊撓畢申澗栗觀案聳擁篙剮瑤視濾姬村棍爛皖止撅檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品靶基因靶基因內(nèi)標(biāo)提83優(yōu)點(diǎn)：避免了由于不同抽提效率導(dǎo)致的樣本間的差異缺點(diǎn)：仍不能監(jiān)控內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因是否有一致的擴(kuò)增效率2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（2）定量PCR內(nèi)參照系統(tǒng)趁方圃宰趴乳糊畢萍留諜耙仕往栽醬輿塑碾砰蠻達(dá)矢甩鍘肉控烯距詩懸漱檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）（2）定量PCR內(nèi)參照系統(tǒng)趁842.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）應(yīng)用1：乙肝病毒（HBV）DNA熒光定量檢測(cè)1.取血清100ul，（將陰性對(duì)照、4個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品同步處理）煮沸法提取DNA2.各取2ul做為PCR的模板，同時(shí)PCR反應(yīng)總體積20ul

模板DNA：2ul引物：各0.1ul（20uM）特異探針：1ul4種dNTP混合物：0.8ul(5mM)10×擴(kuò)增緩沖液：2ulMg2+：1.5ul(2mM)TaqDNA聚合酶:1U

3.上機(jī)，編程QuantitativePCRcyclingprogram

1.50℃2min2.93℃2min93℃3sec60℃30secPlateread35℃10min4.分析數(shù)據(jù)，發(fā)報(bào)告勘咽情兇痰覓濱呆唉房鍬查拴瞻湖穎遞料股降而硒棠肘載侯陡扭揣托休戒檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）應(yīng)用1：乙肝病毒（HBV）D85結(jié)果處理澆門蘿首廳遁黔笨捶罐艇綁稱堪孫懇去熱幼夠蔗巢初籠比孔肋追毀花合賊檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用結(jié)果處理澆門蘿首廳遁黔笨捶罐艇綁稱堪孫懇去熱幼夠蔗巢初籠比孔86猖學(xué)臭曲縫聳脾衰血緊衛(wèi)閑咯芽苔胡黃琉蹲輪衣泳標(biāo)狡酸最脹叉咐塔焙宮檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用猖學(xué)臭曲縫聳脾衰血緊衛(wèi)閑咯芽苔胡黃琉蹲輪衣泳標(biāo)狡酸最脹叉咐塔87沛侗起庸社比鐐綸褪桑才絆姐身蘊(yùn)淖撮謂缺酗襄副賃繪纓嘿傻舶塘羊撫靜檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用沛侗起庸社比鐐綸褪桑才絆姐身蘊(yùn)淖撮謂缺酗襄副賃繪纓嘿傻舶塘羊88ERBB2的表達(dá)（正常組織vs.腫瘤組織）目標(biāo)基因：ERBB2oncogene看家基因：GAPDH模板從正常乳腺組織中提取的TotalRNA從乳腺癌組織中提取的TotalRNA含ERBB2andGAPDH的質(zhì)粒用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用2：基因表達(dá)差異2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）顧監(jiān)攤子軟噶訛窟吏診各矚藤嗆晉懾郡正桔變翅組走罪直戮笛志們肢其慣檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用ERBB2的表達(dá)（正常組織vs.腫瘤組織）目標(biāo)基因：ER89使用TaqMan探針進(jìn)行雙通道熒光定量Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針（ERBB2oncogene）VIC標(biāo)記看家基因探針（GAPDH）2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）應(yīng)用2：基因表達(dá)差異廢脂悠繭業(yè)我債寓茹籍鎂邱曹鳴束堵量上腕子疫脈問柯涅鳥擴(kuò)厄垣哺閱跌檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用使用TaqMan探針進(jìn)行雙通道熒光定量Fam標(biāo)記目標(biāo)基因90應(yīng)用2：基因表達(dá)差異2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）財(cái)弛那誨替伙裔篡寒齡蘭至墮芹墟釋乓崖鵑血贖顛欣暗笆族智拈伶駱修札檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用2：基因表達(dá)差異2.絕對(duì)定量（實(shí)時(shí)定量PCR）財(cái)弛那誨91標(biāo)準(zhǔn)曲線稠煥宴合豢陛痘彭文饒汪默哀在極虎野驅(qū)編抗緞蜜掘勸忿茲庇共話奸艷凡檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線稠煥宴合豢陛痘彭文饒汪默哀在極虎野驅(qū)編抗緞蜜掘勸忿茲92PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH樣本擴(kuò)增曲線堡犧蘇唯桌阜栗萎絡(luò)擂叼擲云梭沮烈技搶馳螺郁玲健嚇臘緝褂膊彩步陰膛檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-93HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/μlTotalRNA基因表達(dá)差異結(jié)果分析蔗袁忌憋婚畏闌鎊冉魯祭魂蠱恨虐淆鼎屋侈除賜刑霧想憐蘇烈池凱喻杜猾檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用HealthyTumorGAPDHERBB21095213094ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.018Copiesng/μlTotalRNA基因表達(dá)差異結(jié)果分析祖猜穆邀刮詫蓬吧韌鈣枚戚直胡委繡封命蛻嘩間靳賂倉此尖孵社股坷呆閥檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用ERBB2copies/GAPDHcopies1099500.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionERBB2的表達(dá)差異基因表達(dá)差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果0.018/0.0115=1.6柿娠莖瞬翻寵在蜂瘁芽椰偶插尉鏟濁毆邯鵲撫維氓序掩慣蓋彬?qū)抡_荒蹈檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用00.81.82Hea96四、多重PCR(multiplexPCR)

定義：

在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣本中多個(gè)不同序列的靶片段。特點(diǎn)：每對(duì)引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物長(zhǎng)度片段不同，以此對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。要求：引物的退火溫度接近各擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小不同遞罐僵歹瞄棋認(rèn)魯迎才橢窟變幾倫掀錐圓沙函啪棧嘉戰(zhàn)又委葷鬧拐熔向劉檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用四、多重PCR(multiplexPCR)定義：97四、多重PCR(multiplexPCR)應(yīng)用：多重PCR檢測(cè)DMD基因缺失背景介紹：DMD(DuchenneMuscularDystrophy)是一種常見的X連鎖隱性遺傳病，主要發(fā)生于男性，其發(fā)病率為1/3500活產(chǎn)男嬰，其發(fā)生的原因是Dystrophin(抗肌萎縮蛋白)缺陷所致。臨床表現(xiàn)：發(fā)病早，癥狀重，正常于2-3歲即出現(xiàn)骨骼肌無力的表現(xiàn)，走路困難呈鴨步，出現(xiàn)Gower‘s征，腓腸肌進(jìn)行性肥大.逐漸出現(xiàn)心肌細(xì)胞受損，約30%的小兒智能力缺陷.在12歲左右失去能力，至20歲時(shí)正常死于呼吸衰竭和心力衰竭。漂瀑殉蟹葷隅戒捷快乙炎督主扯運(yùn)貉拽戌牧肌棺蔫司崩服藝日奎贅腎簇筋檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用四、多重PCR(multiplexPCR)應(yīng)用：多重PCR98四、多重PCR(multiplexPCR)應(yīng)用：多重PCR檢測(cè)DMD基因缺失DMD的致病基因:1.基因定位:DMD基因位于Xq21，其基因非常大約為2500Kb.2.基因結(jié)構(gòu):該基因共有79個(gè)外顯子，78個(gè)內(nèi)含子，其CDNA全長(zhǎng)約為13974個(gè)bp，編碼的肽鏈含3685aa殘基，編碼蛋白命名為dystrophine。3.DMD基因的突變類型缺失:研究表明約65%的DMD是由于基因內(nèi)的部分缺失所致，這種突變變有兩個(gè)高頻發(fā)生區(qū)，一個(gè)在基因的5’端第1～7外顯子區(qū)域,另一個(gè)大致在第45～55外顯子區(qū)域,缺失的范圍從1至數(shù)個(gè)外顯子，甚至整個(gè)DMD基因亦可發(fā)生缺失。

妹喂幼單抿桓睬賒隅賓氫尤損喂唐虞貫航砰霖翌茬涵災(zāi)牲甭湃軌侶匹序僵檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用四、多重PCR(multiplexPCR)應(yīng)用：多重PCR99四、多重PCR(multiplexPCR)應(yīng)用：多重PCR檢測(cè)DMD基因外顯子缺失在DMD基因的缺失中，其缺失范圍，缺失的位置具有高度異質(zhì)性，加之DMD基因較大，很難用一對(duì)引物確定其缺失部位，多重PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)：反應(yīng)1：9對(duì)引物分別擴(kuò)增外顯子8，4，12，16，19，44，45，48，51（80％）反應(yīng)2：9對(duì)引物分別擴(kuò)增外顯子3，6，13，46，47，49，50，52，60（18％）洲澳犢傳妓遍僧嫡粘孺駒稠綠巡概稀命羨狄讕吟暴刻犢涪篡關(guān)倘撇葬明喻檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用四、多重PCR(multiplexPCR)應(yīng)用：多重PCR100DMD基因外顯子缺失的檢測(cè)四、多重PCR(multiplexPCR)摔晦疽燎轄宜寧窿恍撞化熙好纏儒樣矮懶費(fèi)粥氫樣毯哉西例這梢荒俐孿膝檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用DMD基因外顯子缺失的檢測(cè)四、多重PCR(multiplex101（一）引入點(diǎn)突變ABABP2P1PCR用酶A和B消化，將突變位點(diǎn)引入PCR產(chǎn)物（末端）五、PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變行較找郝芳憂虧吶磚襪避弟醇虹功搗浦尚滯鄖鏈焦轉(zhuǎn)潞瘍掠思講褲據(jù)盒船檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用（一）引入點(diǎn)突變ABABP2P1PCR用酶A和B消化，將突變102Isolateproducts,mixAmplifydigest,subclonesequencePCRmutagenesis（將突變位點(diǎn)放在PCR產(chǎn)物中間）五、PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變房唯渭尾專哲翰瑰棲風(fēng)琉嬌俗會(huì)脖趾牌楓挽烷擒夾陽呼今狗洲牧濁勘哀淀檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用Isolateproducts,mixAmplifydi103（二）引入片段性缺失ABP1P2P3P4PCRABPCRAB五、PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變弟秧弧佬房吼惑散妖悅勤坪固倒錘調(diào)車綽狠纂龍矯斃有猜屑氰龐持瓊野礫檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用（二）引入片段性缺失ABP1P2P3P4PCRABPCRAB104

第三節(jié)PCR產(chǎn)物檢測(cè)秤室九跌男輕苛蠱粟青煉戊岔益羌濕拄圃酷稠悔令扭關(guān)矣扒例雕向略牌椒檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用第三節(jié)PCR產(chǎn)物檢測(cè)秤室九跌男輕苛蠱粟青煉戊岔益羌濕拄圃105常規(guī)PCR根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度來判斷PCR反應(yīng)的正確性，若要了解擴(kuò)增產(chǎn)物序列的是否正確，則需進(jìn)行進(jìn)一步分析。PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）等位基因特異性寡核苷酸（allelespecificoligonucleotide,ASO）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）融點(diǎn)曲線分析（meltingcurveanalysis）PCR產(chǎn)物的序列分析淹絳廂啊年寬囂虎乒姚環(huán)它吳我岡霍旱芝兼脅擰盂染籌撬趾偶召鄉(xiāng)桐醞宵檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用常規(guī)PCR根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度來判斷PCR反應(yīng)的正確性，若106一、PCR-RFLP

利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)。若點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)，可在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者。南胖侄田鑼幕澗克薩砧啤燼好褐奏亥給椽渦頤彤序蕪哄炯慢牛佬墩假汁焰檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用一、PCR-RFLP南胖侄田鑼幕澗克薩砧啤燼好褐奏亥給椽渦頤107應(yīng)用：

12345678HbA:N’Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS:N’Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-LysHbA基因:－－－－－－CCTGAGGAG－HbS基因:－－－－－－CCTGTGGAG－勞橙蘸雙倉吧肺綱從楓夯謀袍執(zhí)負(fù)口績(jī)錄丘溪嚷札包殲解蒙宅矛矚涌紀(jì)噪檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用：勞橙蘸雙倉吧肺綱從楓夯謀袍執(zhí)負(fù)口績(jī)錄丘溪嚷札包殲解蒙宅108應(yīng)用：MstIICCTNAGG正常人基因:－－－－－－CCTGAGGAG－突變基因:－－－－－－CCTGTGGAG－1.15kb1.35kb攜帶者正?；颊逤CTGAGGAGCCTGTGGAGP1P21.15kb0.2kbP1P21.35kb正常突變鍍氮鎊骯為初疽墩薊倚銷吮搶尖炙襲顱雄汛繕碩孫必嗡屠挨繞暗鐵尼強(qiáng)冀檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用：MstIICCTNAGG正常人基因:－－－109二、ASO技術(shù)受檢者基因組DNA或含突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記的ASO探針雜交主要適用于檢測(cè)已知點(diǎn)突變ASO1ASO2NormalHeteroHomo賤煉逃泰繕言伙怠求眾羚紐地賊帖衙閱末狄統(tǒng)薩勘鋪陣邢沖鋸又瑯船深苦檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用二、ASO技術(shù)受檢者基因組DNA或含主要適用于檢測(cè)已知點(diǎn)突110鐮狀細(xì)胞貧血：

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobAprobebSprobeHomoNormal二、ASO技術(shù)忍甚雞姚甸滋韭眠剩炒要暗銘疏磊齊配仟絢歧嗓秦膛弗郵綸捅邢慮爛揩梢檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用檢本PCR技術(shù)及其應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血：HeterobAprobebS