蒙藥瑞香狼毒的體外抗腫瘤活性研究

蒙藥瑞香狼毒的體外抗腫瘤活性研究

又名斷腸草、山椒草、紅狼毒、蒙藥名為da管理機(jī)構(gòu)，屬于瑞香科的狼毒科。瑞香狼毒性味苦平,毒性較大,具有逐水祛痰、破積殺蟲之功效。最新研究成果表明,瑞香狼毒具有抗腫瘤、抗病毒等作用,提示瑞香狼毒將具有更廣泛的藥用價(jià)值。本研究選用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、狗腎MDCK細(xì)胞作為觀察對(duì)象,采用噻唑藍(lán)(MTT)法對(duì)瑞香狼毒的各蛋白質(zhì)溶液、不同溶劑提取物及單體化合物的體外細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性進(jìn)行了測(cè)定。1材料和方法1.1材料表面1.1.1藥物、藥品和試劑瑞香狼毒藥材采自內(nèi)蒙古武川縣西北段,經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所康雙龍主任藥師鑒定為瑞香科狼毒屬植物;瑞香狼毒奶制品及煎膏制品為本研究所自制;石油醚、醋酸乙酯、正丁醇購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑二廠。DG3022A型酶標(biāo)儀為南京華東電子集團(tuán)有限公司(原國(guó)營(yíng)華東電子管廠)產(chǎn)品。1.1.2細(xì)胞、細(xì)胞和細(xì)胞人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、狗腎MDCK細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(北京)生命科學(xué)研究院。RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。1.2方法1.2.1樣品的制備1.2.1.乙醇浸膏的制備分別稱取瑞香狼毒藥材生品、奶制品、煎膏制品各100g,加入95%乙醇300ml超聲提取3次,每次1h,減壓回收溶劑,獲得各樣品的乙醇浸膏。取少量乙醇浸膏留樣,將剩余樣品懸浮于蒸餾水中,依次加入石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取,濃縮后獲得各溶劑提取物。1.2.1.正丁醇萃取化合物ivi的合成取干燥的瑞香狼毒根3.5kg,粉碎后加入95%乙醇冷浸提取、濃縮后獲得總浸膏?？偨嘣僖来渭尤胧兔选⒋姿嵋阴ズ驼〈驾腿?經(jīng)濃縮后獲得各萃取物。各萃取物再經(jīng)反復(fù)色譜分析柱分離純化,正丁醇萃取物分別獲得6種單體化合物,分別命名為I~VI,即傘形花內(nèi)酯7-O-β-D-吡喃木糖(1→6)β-D-吡喃葡萄糖苷(I)、芥子醇1,3′-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(II)、丁香苷(III)、落葉松樹脂醇4,4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(IV)、松樹脂醇4,4′-O-雙-β-D-吡喃葡萄糖苷(V)、丁香樹脂醇-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(VI);醋酸乙酯萃取物則分別獲得3種單體化合物,分別命名為VII~IX,即西瑞香素(VII)、狼毒色原酮(VIII)、異狼毒素(IX)。1.2.1.相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)稱取瑞香狼毒藥材1.5kg,用純化水冷浸提取24h后,過(guò)濾、濃縮。濃縮液再經(jīng)鹽析、透析后獲得瑞香狼毒總蛋白質(zhì)。將總蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱分離純化、SDS電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量,獲得相對(duì)分子質(zhì)量分別為14400、35000、28000、23000、10000、94000的6個(gè)蛋白質(zhì)組分,分別命名為蛋白質(zhì)-1(Pr.1)、蛋白質(zhì)-2(Pr.2)、蛋白質(zhì)-3(Pr.3)、蛋白質(zhì)-4(Pr.4)、蛋白質(zhì)-5(Pr.5)、蛋白質(zhì)-6(Pr.6)。1.2.2樣品溶液的制備1.2.2.1.提取不同溶劑和單化合物溶液的制備稱取各樣品適量,加入3ml蒸餾水,制成終濃度為2.0mg/ml的水溶液,置于4℃冷藏,備用。1.2.2.成終濃度的測(cè)定稱取總蛋白質(zhì)適量,加入3ml蒸餾水,制成終濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mg/ml的水溶液,經(jīng)0.45μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后,置于4℃冷藏,備用。1.2.2.制備溶液和密封液稱取相對(duì)分子質(zhì)量不同的各蛋白質(zhì)組分適量,加入3ml蒸餾水,制成終濃度均為10mg/ml的水溶液,經(jīng)0.45μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后,置于4℃冷藏,備用。1.2.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的制備采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、狗腎MDCK細(xì)胞分別置于RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2種細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后,分別加入相應(yīng)的RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml,以100μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同劑量的各瑞香狼毒樣品溶液,其中蛋白質(zhì)溶液劑量均為100μl,各單體化合物和不同溶劑提取物溶液的劑量分別為100、50、20μl;同時(shí)以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對(duì)照組,每組4個(gè)平行孔。將96孔板培養(yǎng)板置于37℃、5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后,棄培養(yǎng)基。每孔加入MTT溶液(0.20mg/ml)20μl,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后,670×g離心5min,棄去上清液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl,振蕩5min使沉淀充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490nm處吸光度(A490)值,并按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:抑制率(%)=(l-實(shí)驗(yàn)組平均A490值/空白對(duì)照組平均A490值)×100%。2結(jié)果2.1總蛋白質(zhì)及體外藥養(yǎng)學(xué)成分檢測(cè)以不同濃度的瑞香狼毒總蛋白質(zhì)溶液和相對(duì)分子質(zhì)量不同的各蛋白質(zhì)組分溶液分別作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、狗腎MDCK細(xì)胞,結(jié)果顯示瑞香狼毒總蛋白質(zhì)及其組分均具有一定的抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性,且抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性隨總蛋白質(zhì)濃度增加而增強(qiáng)。而在相同濃度下,6個(gè)蛋白質(zhì)組分中有4個(gè)蛋白質(zhì)組分對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的抗腫瘤活性,其活性由強(qiáng)至弱依次為:Pr.4≥Pr.6≥Pr.3=Pr.2;有3個(gè)蛋白質(zhì)組分對(duì)狗腎MDCK細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,其毒性由強(qiáng)至弱依次為:Pr.4≥Pr.3≥Pr.1(表1)。2.2mtt-7721細(xì)胞的藥代動(dòng)力學(xué)以劑量分別為100、50、20μl的瑞香狼毒各單體化合物溶液(2.0mg/ml)分別作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、狗腎MDCK細(xì)胞,結(jié)果顯示在分離獲得的9個(gè)單體化合物中,西瑞香素(VII)、狼毒色原酮(VIII)、異狼毒素(IX)對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的抗腫瘤活性,而狼毒色原酮(VIII)、異狼毒素(IX)則對(duì)狗腎MDCK細(xì)胞同時(shí)具有較弱的細(xì)胞毒性(表2)。2.3微生物活性和細(xì)胞毒性以劑量分別為100、50、20μl的瑞香狼毒生品及炮制品各溶劑提取物溶液(2.0mg/ml)分別作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、狗腎MDCK細(xì)胞,結(jié)果顯示除煎膏制品正丁醇提取物無(wú)抗腫瘤活性外,生品及炮制品的乙醇和正丁醇提取物均具有不同程度的抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性,并呈藥物劑量依賴性;生品及炮制品的醋酸乙酯提取物則均無(wú)抗腫瘤活性,僅具有不同程度的細(xì)胞毒性,并呈藥物劑量依賴性;生品的石油醚和多糖提取物均未呈現(xiàn)抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性。同時(shí)與生品相比,在保留一定程度抗腫瘤活性的基礎(chǔ)上,炮制品相應(yīng)各溶劑提取物的細(xì)胞毒性均有所降低(表3)。3總蛋白質(zhì)濃度對(duì)瑞香狼毒檢測(cè)的影響本研究結(jié)果表明,瑞香狼毒總蛋白質(zhì)及其組分均具有一定程度的細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性。當(dāng)總蛋白質(zhì)溶液濃度增大至2.0mg/ml時(shí),呈現(xiàn)抗腫瘤活性;當(dāng)總蛋白質(zhì)溶液濃度進(jìn)一步增大至4.0mg/ml時(shí),其抗腫瘤活性增強(qiáng)的同時(shí)也出現(xiàn)一定程度的細(xì)胞毒性,且抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性均隨總蛋白質(zhì)溶液濃度的增加而增強(qiáng),提示蛋白質(zhì)可能是瑞香狼毒的主要毒性位點(diǎn)之一。除石油醚和多糖提取物外,瑞香狼毒不同溶劑提取物均表現(xiàn)出不同程度的抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性,并呈藥物劑量依賴性;而瑞香狼毒藥材經(jīng)炮制后,在保留一定程度抗腫瘤活性的基礎(chǔ)上,其相應(yīng)各溶劑提取物的細(xì)胞毒性均有所降低。此外,瑞香狼毒的臨床用藥方式主要為外用,且要求炮制后應(yīng)用,通常用藥時(shí)將瑞香狼毒根奶制品粉末與成方的其他藥味粉末混合,加入適當(dāng)?shù)娜軇?水、食用醋或雞蛋清)調(diào)成