黃芪對糖尿病腎病大鼠腎損害的保護(hù)作用

黃芪對糖尿病腎病大鼠腎損害的保護(hù)作用

隨著糖尿病發(fā)病率的增加，各種檢查和ct掃描逐漸增多，造影劑（cm）引起的急性腎損傷越來越多。造影劑腎臟黃酮癥是糖尿病患者腎衰竭的重要原因之一。一項(xiàng)研究顯示糖尿病氮質(zhì)血癥期進(jìn)行心導(dǎo)管檢查,CMN發(fā)生率高達(dá)50%,盡管多數(shù)患者腎功能短期內(nèi)可以恢復(fù),但常常增加住院天數(shù),加重患者負(fù)擔(dān),少數(shù)甚至死亡,因而預(yù)防和治療這種并發(fā)癥具有重要意義。近年來,研究證實(shí)內(nèi)皮素(ET)系統(tǒng)可能在CMN發(fā)生中起重要作用,有效抑制造影時(shí)ET系統(tǒng)的過高表達(dá),具有一定的腎臟保護(hù)作用。但目前ET拮抗劑在臨床上還未得到廣泛運(yùn)用,有研究證實(shí)黃芪可降低血漿及腎臟局部ET-1水平,具有抑制ET系統(tǒng)表達(dá)的作用,推測可用于預(yù)防CMN發(fā)生。為此,我們建立了單側(cè)腎切除糖尿病腎病模型,對此進(jìn)行探討。材料和方法1尿糖的檢測雄性Wistar系大鼠(體重180～200g,溫州醫(yī)學(xué)院動物房提供)30只,其中24只接受右側(cè)腎切除(背部正中切口),2周后腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司)60mg/kg(溶解在10mmol/L枸櫞酸緩沖液中,pH5.5),48～72h后尾靜脈采血,用血糖儀(OneTouchⅡ型,強(qiáng)生有限公司)測定全血血糖,血糖≥16.7mmol/L,同時(shí)尿糖+++～++++以上確定為糖尿病大鼠,給普通飼料,自由攝水,飼養(yǎng)8周,隨機(jī)分組。其他6只作為正常對照組。2糖尿病模型建立前煤為5d模型(1)正常對照組(C組,n=6);(2)糖尿病對照組(DM組,n=6):糖尿病模型建立8周時(shí),禁水24h,1次性尾靜脈注入等量生理鹽水;(3)糖尿病+造影劑組(DM+CM組,n=6):糖尿病模型建立8周時(shí),等量生理鹽水灌胃,禁水24h,1次性尾靜脈注入76%泛影葡胺(10mg/kg);(4)糖尿病+黃芪+造影劑組(DM+HQ+CM組,n=6):糖尿病模型建立8周時(shí),黃芪(2g/250g)灌胃,禁水24h,1次性尾靜脈注入76%泛影葡胺(10mg/kg)。3腎組織中et-1及etr-b的表達(dá)分別在CM注射后12～36h,用代謝籠收集尿標(biāo)本,然后用3%水合氯醛腹腔注射,麻醉各組大鼠,行右側(cè)頸總動脈插管,留取血漿,-70℃保存,待測肌酐和ET-1。腎臟經(jīng)生理鹽水充分灌洗,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,制成4μm厚切片,做免疫組織化學(xué)。血、尿肌酐由日立7150型全自動生化分析儀測得;血漿ET-1用放射免疫法測定(試劑盒由北京美迪科學(xué)技術(shù)有限公司提供)。免疫組化:SP法檢測ET-1、ETR-A及ETR-B在腎組織中的表達(dá)。石蠟切片常規(guī)脫蠟到水,加入3%H2O2-甲醇溶液室溫下10min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,用蒸餾水沖洗3次后加入抗原修復(fù)液(購自上海金浩公司),然后置于微波爐中煮沸10min后自然冷卻,再用0.1MPBS溶液(pH7.4)漂洗3次,加入正常山羊血清室溫下封閉15min,傾去玻片上的血清,分別滴加兔抗大鼠ET-1(1∶500,購自北京中山試劑有限公司),綿羊抗大鼠ETR-A(1∶200,購自上海普飛生物技術(shù)有限公司)、ETR-B(1∶200,購自上海普飛生物技術(shù)有限公司),室溫下過夜。次日用PBS液漂洗3次,分別滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、驢抗綿羊IgG置于40℃烤箱中15min,棄去二抗后用PBS液漂洗3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液室溫下15min,用PBS液漂洗3次后于室溫下滴加DAB顯色液,鏡下控制顯色時(shí)間。充分顯色后水洗終止顯色,再用Hariss蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化。酒精梯度脫水、二甲苯透明后以中性樹膠封片。同時(shí)采用正常兔血清和刪除第一抗體的方法作為陰性對照。顯色結(jié)果在高倍鏡(×400)下根據(jù)染色面積和強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析:-,無陽性染色;+,輕度陽性;++,中度陽性;+++,重度陽性。4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)用(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組內(nèi)差異比較采用t檢驗(yàn),組間差異比較采用方差分析。結(jié)果1糖尿病大鼠對小鼠血清泛影葡胺,血胱被控制監(jiān)測總劑量,導(dǎo)致血肌病單側(cè)腎切除糖尿病大鼠,喂養(yǎng)8周時(shí),血肌酐較正常大鼠明顯升高,血漿ET-1濃度、肌酐清除率明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖尿病大鼠黃芪灌胃,禁水24h后注射76%泛影葡胺,血肌酐有所升高,內(nèi)生肌酐清除率有所下降,與糖尿病對照組無明顯差異,與生理鹽水灌胃組有顯著性差異(P<0.05);血漿ET-1濃度較糖尿病對照組和生理鹽水灌胃組有所升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。2腎組織病理學(xué)檢測在光鏡下觀察,糖尿病大鼠與正常大鼠相比,腎小球大致正常,腎臟間質(zhì)有程度不同單核細(xì)胞浸潤。注射CM后,無論生理鹽水灌胃組,還是黃芪灌胃,病理變化與糖尿病組相比均不顯著。3dm和dm+cm對etr-a、etr-b、etr-b表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示ET-1、ETR-A、ETR-B蛋白表達(dá)主要分布在腎小管間質(zhì),DM對照組ET-1、ETR-A、ETR-B比正常對照組表達(dá)顯著增加,DM+CM組表達(dá)增加更顯著,而DM+CM+HQ組表達(dá)較DM+CM組要弱。見表2。糖尿病cmn的免疫組化糖尿病CMN的發(fā)生機(jī)理目前還不清楚。有研究提示一些內(nèi)源性縮血管物質(zhì),如兒茶酚胺、血栓素、血清素及血管緊張素Ⅱ等可能參與CM的縮血管反應(yīng),但尚有爭議。近年來有學(xué)者研究認(rèn)為內(nèi)皮素-1(ET-1)在介導(dǎo)CM的縮血管反應(yīng)方面起著獨(dú)特的作用,但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)糖尿病患者發(fā)生CMN時(shí)血ET-1濃度并不升高,認(rèn)為ET系統(tǒng)在糖尿病CMN發(fā)生過程中并不起重要作用。本研究顯示糖尿病腎功能損害大鼠注射高滲CM,可引起急性腎損害,但注射以后血漿內(nèi)皮素雖然有輕度升高,但與糖尿病對照組相比無明顯差異,而腎組織內(nèi),特別腎間質(zhì)ET-1及ET-1受體ETR-A和ETR-B表達(dá)明顯增加,提示糖尿病CMN的發(fā)生可能與血液循環(huán)中ET濃度無關(guān),而與腎臟局部的內(nèi)皮素系統(tǒng)高表達(dá),活性增加有關(guān)。血漿ET-1的病理生理作用一直存在爭議。在大鼠和犬類實(shí)驗(yàn)中,靜脈內(nèi)注射幾種不同的CM,循環(huán)中ET-1水平明顯增加,應(yīng)用ETR-A選擇性拮抗劑或ETR非選擇性拮抗劑阻斷ETR可防止CM誘導(dǎo)的急性腎血管收縮,推測可能與CM直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1有關(guān),是引起CMN的重要原因。最近,有研究認(rèn)為血循環(huán)中的ET-1水平并不能反映組織局部濃度,也不足以引起直接的縮血管效應(yīng),ET-1主要通過自分泌、旁分泌形式起作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在糖尿病模型建成8周時(shí)血漿內(nèi)皮素較正常大鼠內(nèi)皮素低,注射CM以后,雖然有一定升高,但與糖尿病對照組相比,并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,也提示在糖尿病CMN的發(fā)生過程中,血漿內(nèi)皮素可能不起重要作用。腎臟內(nèi)ET-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及系膜細(xì)胞產(chǎn)生和分泌,其作用由受體介導(dǎo)。ET-1受體有兩型,即ETR-A和ETR-B。ETR-A主要位于血管平滑肌細(xì)胞上,介導(dǎo)ET-1縮血管反應(yīng),ETR-B主要位于內(nèi)皮細(xì)胞上,可誘導(dǎo)NO及PGI2釋放,介導(dǎo)ET-1擴(kuò)血管反應(yīng)。免疫組化方法可定位反映蛋白質(zhì)的表達(dá),便于推測蛋白質(zhì)的功能。本文希望通過免疫組化了解腎臟ET系統(tǒng)表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)注射CM以后腎臟,特別是腎間質(zhì)ET-1、ETR-A和ETR-B表達(dá)明顯增加,有引起腎間質(zhì)血管收縮,導(dǎo)致腎小管病變,促使腎損害的發(fā)生。提示腎間質(zhì)局部ET系統(tǒng)可能在CMN的發(fā)生過程中起重要作用。目前對于CMN尚無有效的預(yù)防方法。曾有人觀察到中藥黃芪可降低實(shí)驗(yàn)性心衰模型、慢性腎衰竭患者血、尿ET-1水平,具有保護(hù)腎臟功能的作用。為此,本文建立了糖尿病CMN模型,對此進(jìn)行研究。研究證實(shí)中藥黃芪能減輕CM引起的肌酐升高和肌酐清除率的下降,可在一定程度上預(yù)防糖尿病