紙色譜法實驗報告

文檔從網(wǎng)絡(luò)中收集，已重新整理排版.word版本可編輯.歡迎下載支持.紙色譜法實驗報告篇一：實驗六紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用實驗報告實驗六紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用【實驗名稱】：紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用09救援一班第三大組李嵐宇XX222336室溫：28°（一） 實驗目的：1、 學習氨基酸紙層析的基本原理。2、 掌握氨基酸紙層析的操作原理。（二） 實驗原理：轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸代謝過程中的一個重要反應(yīng)，在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸的a-酮酸與a-酮基的互換反應(yīng)稱為轉(zhuǎn)氨基作用。轉(zhuǎn)氨基作用廣泛地存在于機體各組織器官中，是體內(nèi)氨基酸代謝的重要途徑。氨基酸反應(yīng)時均由專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，此酶催化氨基酸的a一氨基轉(zhuǎn)移到另一a一酮基酸上。各種轉(zhuǎn)氨酶的活性不同，其中肝臟的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）催化如下反應(yīng)：a—酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸本實驗以丙氨酸和a-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨酸的出現(xiàn)，以證明轉(zhuǎn)氨基作用。紙層析屬于分配層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強，水被吸附在濾紙的纖維素的纖維之間形成固定相。有機溶劑與水不相溶，把預分離物質(zhì)加到濾紙的一端，使流動溶劑經(jīng)此向另一端移動，這樣物質(zhì)隨著流動相的移動進行連續(xù)、動態(tài)的不斷分配。由于物質(zhì)分配系數(shù)的差異，而使移動速度就不一樣，在固定相中，分配趨勢較大的組分，隨流動相移動的速度就慢，反之，在流動相分配趨勢較大的成分，移動速度快，最終不同的組分彼此分離，物質(zhì)在紙上移動的速率可以用比值Rf表示：？???ALT物質(zhì)在一定的溶液中的分配系數(shù)是一定的，故比值Rf也相對穩(wěn)定，因此在同一層析體系中可用Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。（三）實驗材料與儀器：試劑：1、 0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液。2、 0.2mol/LNa2HPO4溶液81ml與0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml混勻，用蒸餾水稀釋20倍。3、 0.1mol/L丙氨酸溶液稱取丙氨酸0.891克，先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0NNaOH仔細調(diào)至pH7.4后，加磷酸鹽緩沖液至100ml。4、 0.1mol/La一酮戊二酸稱取a一酮戊二酸1.461克，先溶于少量0?01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0NNaOH仔細調(diào)至pH7.4后，加磷酸鹽緩沖液至100ml。5、 0.1mol/L谷氨酸溶液稱取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0NNaOH仔細調(diào)至pH7.4后，加磷酸鹽緩沖液至50ml。6、 0.5%茚三酮溶液稱取茚三酮0.5克于100ml丙酮中溶解。7、 層析溶劑：將重蒸過的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震蕩，靜置24小時后分層，將下部酚層轉(zhuǎn)移到瓶中備用。儀器：玻璃勻漿器、10ml試管、培養(yǎng)皿、表面皿、沸水浴鍋、37°C恒溫水浴箱、9cm圓濾紙、烘箱、手術(shù)剪刀、分液漏斗。實驗步驟：1、 肝勻漿制備：取新鮮動物肝0.5克,剪碎后放入勻漿器，加入冷0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液1.0ml,迅速研成勻漿，用上述緩沖液4.5ml混勻備用。2、 酶促反應(yīng)過程取離心管兩支，編號：1(測定管)、2(對照管)，各加肝勻漿0.5ml。把對照管放沸水浴中加熱10分鐘，取出冷卻。各加0.1mol/L丙氨酸0.5ml,0.1mol/La-酮戊二酸0.5ml,0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液1.5ml,搖勻。37C保溫，30分鐘后取出，保溫完畢。（4）把測定管放沸水浴中煮10分鐘，取出后冷卻，過濾。3、層析（1） 取圓形濾紙一張（直徑9cm）放潔白紙上，以圓點為中心，約1cm為半徑，用鉛筆劃一圓線作為基線，在線上四等份處標清四點編號作為點樣原點。（2） 點樣：用四根毛細玻璃管分別進行點樣。把丙氨酸液、谷氨酸液分別點在原點2、4處。把測定液、對照液分別點在原點1、3處。注意斑點不宜過大（應(yīng)在直徑0.5cm以下）。在第一次點樣點干后，再在原處同樣點第2次。（3） 層析：先在濾紙圓心處打一小孔（鉛筆芯粗細），再取濾紙一條卷成捻如燈芯狀，上端插入濾紙中心孔中，下端剪成須狀。（4） 把濾紙平放在上述培養(yǎng)皿上，使紙芯下浸入層析液中，蓋上培養(yǎng)皿蓋?？梢妼游鲆貉丶埿旧仙綖V紙中心，漸向四周擴散。當層析液前緣到離濾紙邊緣約1cm時，約25分鐘，取出濾紙，用鑷子小心取下紙芯，放入烘箱中烘干。（5） 顯色：將上述濾紙平放在培養(yǎng)皿上，滴0.5%茚三酮的丙酮溶液，使濾紙全部濕潤，再放入烘箱干燥，此時可見紫色斑出現(xiàn)，比較色斑的位置，及色澤深淺，計算Rf值，分析是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。（五）實驗結(jié)果記錄：圖（1）（六）實驗討論：1、從表格（1）中可以看出，測定管上清液點樣出現(xiàn)了兩個色斑，根據(jù)Rf值的計算也可以看出，測定管中氨基酸發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基作用，生成的未知物質(zhì)b為谷氨酸，則未知溶質(zhì)a為丙氨酸；對照管中因為酶的失活而沒有發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，只有丙氨酸，所以色斑只有一個。2、 層析點樣時手要洗凈，操作中盡可能少量接觸濾紙，以免污染。3、 層析液中含有腐蝕性酚，取用時注意安全，防止濺到皮膚及眼睛。4、 點樣點不宜過大，直徑小于0.5cm.XX年9月19日篇二：實驗六氨基酸的紙層析法氨基酸的紙層析法一?目的了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。二、原理以濾紙為支持物的層析法，稱為紙層析法。紙層析所用展層劑大多由水和有機溶劑組成。展層時，水為靜止相，他與濾紙纖維親和力強；有機溶劑為流動相，它與濾紙纖維親和力弱。有機溶劑在濾紙上又下向上移動的，稱為上行法；文檔從網(wǎng)絡(luò)中收集，已重新整理排版.word版本可編輯.歡迎下載支持.有上向下移動的，稱為下行法。將樣品在濾紙上確定的原點處展層，由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進行分配，且他們的分離系數(shù)各不相同，所以不同的氨基酸隨流動相移動的速率也不相同，于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來，形成距原點不等的層析點。在一定條件下（室溫、展層劑的組成、濾紙的質(zhì)量、PH值等不變），不同的氨基酸有固定的移動速率（Rf值）Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。用混合氨基酸做樣品時，如果只用一種溶劑展層，由于某些氨基酸的移動速率相同或相近，就不能將它們分開，為此，當用一種溶劑展層后，可將濾紙旋轉(zhuǎn)90度，以第一次所的層析點為原點，在用另一溶劑展層，從而達到分離的目的。這種方法稱為雙向?qū)游龇?。本試驗主要介紹的是單向?qū)游龇?。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸組成。三、實驗儀器1、 新華濾紙2、 層析缸3、 細線4、 點樣管5、 橡皮筋6、 電吹風7、噴霧器四、 實驗試劑1、 混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2、 展層劑：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸餾水=13：3：3：1（v:v）3、 0.5%茚三酮一無水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml無水丙酮，貯于棕色瓶中五、 實驗步驟1、 取濾紙剪成20X10厘米的濾紙條一張，在一端打孔，系一根細線，在另一端2~3cm處用鉛筆畫一橫線，中間畫一圓點（原點）。2、 取毛細管一支（回收），吸取氨基酸混合液，在原點處點樣，樣點直徑不宜超過5mm，每點一次用吹風機吹干，點2~3次為佳。3、 點樣（原文來自：wWw.xiaOcAofANweN.coM小草范文網(wǎng)：紙色譜法實驗報告）后將濾紙放入層析缸中展層，注意點樣線要高于層析液面，濾紙不要貼在層析缸璧上，當展層至另一端1~2cm處時，停止展層（大約2~3小時）。4、 取出濾紙，用鉛筆記下溶劑前沿，然后用熱風吹干（或烘箱60°C）烘干。5、 均勻噴上茚三酮一無水丙酮液，注意使溶液不倒流，不間斷。6、 用吹風機吹干，觀察層析點，確定其幾何中心。7、 量取數(shù)值，計算各自的Rf值，與表中標準氨基酸Rf值比較，確定樣品氨基酸種類。（書上圖譜橫著看）實驗結(jié)果H1=1.0cmH2=4.4cmH3=5.0cmH4=0.99cmH=11.7cm由此可得Rf1=0.08547Rf2=0.37607Rf3=0.42735Rf4=0.08461據(jù)此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）組成。實驗分析實驗中出現(xiàn)了拖尾的現(xiàn)象。拖尾現(xiàn)象是指展層，顯色后在層析分配圖上，所看到的某一種氨基酸的分子位移，不是如標準圖譜所示的那樣，完整地顯示在某一位置上，而是形成象笞帚似的那樣，前端粗圓而逐漸細小下來，宛如拖著一個尾巴。其圖所呈顏色也是由濃漸淡。圖象的出現(xiàn)，是在實驗中對影響Rf值的主要因素要求，掌握不夠所致。諸如，物質(zhì)結(jié)構(gòu)與極性對Rf值的影響，層析溶劑對Rf值的影響，PH對Rf值的影響（溶劑、濾紙和樣品的PH值），溫度對Rf值的影響，濾紙的質(zhì)地是否均勻，薄厚是否適當，纖維的松緊度是否適中等對Rf值的影響，展層的方式（上行、下行）對Rf值的影響。然而在多次實驗過程中無論怎佯嚴格遵循其影響Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。此時，這就需要從具體操作規(guī)范方面，諸如樣品的處理，點樣、展層、顯色等幾個操作程序去考慮思索，經(jīng)仔細分析，樣品的處理是為除去雜質(zhì)純化樣品，達到層析分配某氨基酸的情晰顯色圖像；展層過程是在上述影響Rf值的主要因素要求下進行，使樣品達到一個適當?shù)奈灰?，便于在顯色后從圖象上，區(qū)分不同樣品的氨基酸；顯色是在用配制好的，與水不相混合，并揮發(fā)性較快噴霧后迅速吹干的。更何況顯色劑又是含水量極低，不會影響洋品的斑點擴散，那么問題就集中在點樣這個操作程序上了。點樣是將被層析分配的幾種氨基酸混合液，和為了對照實驗結(jié)果，而分別配制的幾種氨基酸的溶液，用微量點樣管或毛細管，或血球計數(shù)器將5一j5微升的樣品，點在以濾紙為惰性支持物的層析紙上設(shè)計好的多點位置中去。點樣后要自然風干，或冷風吹干。最好不要用加熱裝置，如吹風機，燈泡之類的熱源將其樣品點加速干燥。因為加熱裝置在學生操作時，一但注意不夠，掌握不好，則溫度升高勢必要使樣品破壞，更會使佯品點干的太燥。正是由于這樣，樣品點太干燥，使其樣品物的分子，牢固地吸牢在層析紙的纖維上。所以在展層過程中，樣品點的每個物質(zhì)分子，不能在層析紙上同時