腫瘤基因治療基本方法

腫瘤基因治療基本方法基因是一段染色體DNA序列，用于產(chǎn)生功能產(chǎn)物多肽或功能RNA分子?；蛑委熞话闶侵笇⑾薅ǖ倪z傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入病人特定的靶細胞，以達到預(yù)防或治療疾閏的目標的方法。腫瘤基因治療是用正常或野生型基因矯正或置換致病基因或引入有治療價植的其它來源基因的一種治療方法?；蛑委熞话闶且胄揎椈蛴诓∪梭w內(nèi)而并非該基因的產(chǎn)物，即是一種療法而非新產(chǎn)品。但是，通過體內(nèi)直接途徑可將外湖DNA象傳統(tǒng)的藥物一樣注射到機體內(nèi)，幫、故有人稱這些外源的DNA的基因藥物?；蛑委熤?，從分子生物學(xué)角度可分為兩種方式：一是基因矯正和轉(zhuǎn)換，即將基因的異常序列進行矯正和置換，即將基因的異常序列進行矯正和精確的原位修復(fù)；二是基因添加和增補，即不去除異常基因，而是通過具有治療意義的外源基因的定點整合，使其表達正常產(chǎn)物以補償缺陷基因的功能。根據(jù)針對宿主病變細胞基因采取的措施不同，可分為基因置換、基因修正、基因轉(zhuǎn)移和基因滅活四種方法。腫瘤基因治療研究中，通常采用基因轉(zhuǎn)移和基因滅活方法。基因轉(zhuǎn)移是指將外源性目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎?，目的基因的表達產(chǎn)物修飾缺陷細胞，使其恢復(fù)功能或使原有的功能得到加強，故又稱為基因修飾。腫瘤基因修飾治療研究包括免疫基因治療、增強抑癌基因表達、靶向化療或提高機體化療耐受性等內(nèi)容。基因滅活是應(yīng)用反義技術(shù)特異性封閉某些基因的表達。反義技術(shù)是指利用針對特異性DNA和RNA片段按堿基配對的原則人工合成小分子核苷酸序列（反義寡苷酸），與其目的DNA和RNA序列互補結(jié)合，以選擇性抑制目的基因翻譯或轉(zhuǎn)靈過程的技術(shù)和方法。在腫瘤基因滅活治療中，訂要是利用反義寡核苷酸抑制或封閉某些癌基因的表達?；蜣D(zhuǎn)移療法一般分為兩類：一是體細胞系基因轉(zhuǎn)移，主要用于防治遺傳性及非遺傳性疾病；二是胚胎基因轉(zhuǎn)移，用于預(yù)防遺傳性疾病。臨床上，基因治療是指體細胞基因治療?；蛑委熁旧戏譃槿剑孩倩?qū)耄菏侵赴鸦蚧蚝谢虻妮d體導(dǎo)入機體；②基因傳遞：是指基因從導(dǎo)入部位進入靶細胞核；③基因表達：是指細胞中治療性基因產(chǎn)物的形成。1990年，Rosenberg等首次在晚期癌癥病人中利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將轉(zhuǎn)導(dǎo)了編碼腫瘤壞死因子的腫瘤浸潤淋巴細胞用于治療晚期癌癥。近10年來，隨著人們對腫瘤免疫、腫瘤病因及分子機制等研究的深入，腫瘤基因治療獲得了突飛猛進的發(fā)展，并逐漸走向成熟，批準進入臨床試驗的基因藥物逐年增多。目前開展的免疫基因治療、轉(zhuǎn)導(dǎo)抑癌基因、反義癌基因以及靶向化療等腫瘤基因治療研究，其結(jié)果令人鼓舞。腫瘤基因治療已成為目前攻克和治愈腫瘤最具希望的，也是最活躍的領(lǐng)域。1、腫瘤基因治療的基本方法1.1確定基因治療載體運載或攜帶治療性遺傳物質(zhì)的工具稱之為載體（Vector）。天然存在的載體可通過三種不同的機制在不同細胞之間轉(zhuǎn)移：結(jié)合（和運動），轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于整合入細胞基因組并經(jīng)細胞分裂繁殖的病毒DNA分子。轉(zhuǎn)染是DNA通過物理或化學(xué)的方法被動轉(zhuǎn)運至細胞的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)用載體通常是病毒，也是非病毒載體。基因治療載體應(yīng)具備以下條件：①易于進入細胞；②在特異細胞或組織達到有規(guī)律的、充分的及持續(xù)的外源基因表達；③外源基因應(yīng)含有或整合于基因組活化區(qū)內(nèi)或能自主復(fù)制的構(gòu)件。④整個過程應(yīng)安全有效并具有選擇性；⑤易于大量生產(chǎn)。目前采用的載體還沒有一種能具備上述所有的條件。理想的基因治療載體除具備以上條件外，應(yīng)該是靜脈內(nèi)傳遞并只轉(zhuǎn)染特異細胞。目前常用基因治療載體可分為病毒載體和非病毒載體兩類。1.1.1病毒載體1.1.1.1逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）載體RV載體是經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其復(fù)制所需要的基因被除去，代之以治療性基因和選擇性標記物。RV優(yōu)點是能在體外條件下把基因高效轉(zhuǎn)入增殖細胞，可同時感染大量細胞，有廣泛的宿主范圍，能穩(wěn)定整合，插入基因的表達時間長等；缺點是RV的負載容量限于8kb,整合的隨機性有潛在的危險性，基因?qū)朐祟惣毎男实图鞍屑毎€(wěn)定轉(zhuǎn)化后就難以逆轉(zhuǎn)治療等。在腫瘤基因治療研究中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛、有效的基因轉(zhuǎn)移方法。1.1.1.2腺病毒（AV）載體重組腺病毒載體在基因轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛。AV優(yōu)點是能感染非增殖細胞，不整合入機體細胞染色體，滴度高，免疫原性強等。缺點是容量小（4.5kb）,體仙表達時間短，使用次數(shù)受限制等。1.1.1.3痘苗病毒（VV）載體VV載體的優(yōu)點是復(fù)制能力強，載體容易構(gòu)建，容量大，可容納25kv片段并且摻入基因的數(shù)量沒有限制，免疫原性強，使用安全等。據(jù)點是病毒的強復(fù)制能力可能對處于免疫抑制狀態(tài)的病人有害，偶爾也在健康個體致病等。1.1.1.4腺相關(guān)病毒（AAV）載體AAV是4.7kb單鏈DNA基因組的人類微小病毒。AAV載體的優(yōu)點是：①AAV并不引起任何疾病，而在細胞培養(yǎng)及動物模型可表現(xiàn)抗腫瘤作用；②病毒本身只有兩個基因，即復(fù)制基因rep和編碼衣殼蛋白的基因cap,后者易于消除并可降低細胞毒性T』林巴細胞反應(yīng)的危險性；③可在19號染色體上進行位點特異性整合，如果沒有輔助病毒如腺病毒、皰疹病毒或水痘病毒等共感染，野生型AAV就潛伏在19號染色體上的特定部位，直到輔助因子出現(xiàn)才復(fù)制；④病毒DNA能夠穩(wěn)定有效地整合人細胞基因組；⑤有寬廣的宿主范圍，該載體似乎易感染造血干細胞，能潛伏感染非分裂期細胞；⑥AAV是一種可富聚的物理性質(zhì)穩(wěn)定的病毒體；⑦單鏈載體基因組存活于靜態(tài)培養(yǎng)基，但經(jīng)刺激后可分裂，然后可進行收獲轉(zhuǎn)導(dǎo)；⑧在動物模型中表達可持續(xù)半年以上。AAV載體也有一些局限性，如病毒小，最大插入痛列僅4.5kb，復(fù)制基因rep缺失的AaV與野生型AAV相比，載體整合效率較低、位點特異性較差。1.1.1.5單純皰疹病毒（HSV）HSV-1是嗜神經(jīng)性病毒，該載體可用于腦腫瘤基因治療。其優(yōu)點是容量大（40~45kb），能感染有絲分裂后細胞，能永久維持潛伏狀態(tài)等。缺點是可能引起潛伏感染等。1.1.1.6其它病毒載體EB病毒（EBV）衍生的載體、猴病毒40（SV40）、人類巨細胞病毒（hCMV）、狂太病與假狂犬病病毒及基于HIV的載體等病毒載體都可用于基因治療。1.1.2非病毒載體1.1.2.1脂質(zhì)體(Liposime)脂質(zhì)體是由磷脂和相似的兩性脂形成的穩(wěn)定的微囊?？煞譃閹д姾傻幕蜿栯x子型脂質(zhì)體和帶負電荷的或pH敏感的脂質(zhì)體兩種類型。基因治療用脂質(zhì)體多為陽離子型脂質(zhì)體，其優(yōu)點有：①制備與使用方法簡單；②可攜帶大片段DNA，乃至整個染色體；③可容納疏水性及親水性物質(zhì)；④能與100%DNA形成復(fù)合物；⑤消除了危險重組于形成的可能性；⑥通用于各種類型的裸露DNA或RNA；⑦能轉(zhuǎn)染各種類型的細胞，轉(zhuǎn)染率較高；⑧沒有免疫原性。陽離子型脂質(zhì)體已成為商業(yè)化產(chǎn)品。1.1.2.2配體-多聚賴氨酸-DNA復(fù)合物(Polyplex)Polyplex是有效的轉(zhuǎn)染制劑，其活性發(fā)揮并不需要脂質(zhì)體的參與。陽離子聚胺(Polymine)是該制劑的重要成分，并與陰離子DNA形成復(fù)合物。另一種制劑多聚-L-賴氨酸的優(yōu)點是不同的配體與堿性氨基酸基團耦聯(lián)。多聚乙烯亞氨(PEL)是具有最高陽電荷密度的有機大分子，是基因治療的高度有效載體?？捎靡赃M行體內(nèi)外寡苷酸和質(zhì)粒的傳遞。此外，各種脂精氨(Lipospermine)顯示了較高的基因轉(zhuǎn)移水平。樹突三聚體(Dendrimer)樹突三聚體作為基因轉(zhuǎn)移載體的優(yōu)點有：①可形成精確的大分子結(jié)構(gòu)；②構(gòu)件極其微?。虎蹧]有免疫原性。受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用受體介異載體也稱為分子交連載體。其原理是DNA連接到靶向分子如多聚賴氨酸，交連的DNA復(fù)合體再結(jié)合到特異的細胞表面受體，通過內(nèi)吞作用將DNA轉(zhuǎn)入細胞。其他非病毒載體合成的肽復(fù)合物、人工(合成)病毒載體及人工染色體等非病毒載體在基因治療的應(yīng)用在不斷研究和完善中。1.2確定基因治療的靶器官、組織、細胞及目的的基因1.2.1基因治療的靶器官及組織基因轉(zhuǎn)入某一組織，可能對有這一組織的器官的疾病有治療意義，也可能對超出靶組織的器官疾病有治療作用。已涉及基因治療的靶器官及組織見表15-1。1.2.2基因治療的靶細胞基因治療靶細胞(Targetcell)或稱受體細胞(Recipientcell)一般要求符合下列基本條件：①來源容易；②蝗在體外培養(yǎng)和擴增；③易于被基因轉(zhuǎn)染并進行高效表達；④易于體內(nèi)移植或回輸，用于人體后所攜帶的目的基因能穩(wěn)定地表達；⑤具有比較長的生存壽命。目前用于基因治療的受體細胞有淋巴細胞類、腫瘤細胞、造血干細胞、肌細胞、皮膚或纖維細胞等。表15-1基因治療的靶器官/組織及其優(yōu)勢組織 優(yōu)點骨髓容易獲得：可在體外培養(yǎng)；易返回機體上皮細胞使用腺病毒可在體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)入呼呼上皮。經(jīng)內(nèi)窺鏡接近腸上皮進行體細胞基因療法皮膚最容易大面積接近的組織；干細胞可使表面持續(xù)更新；皮膚中轉(zhuǎn)基因表達可影響全身血管內(nèi)皮外源性遺傳物質(zhì)可轉(zhuǎn)入血管組織內(nèi)皮細胞間皮間皮覆蓋了體腔內(nèi)表面，由單層細胞組成肌肉裸露質(zhì)粒DNA可注射轉(zhuǎn)入骨骼肌或心肌?；蜣D(zhuǎn)入骨骼肌后可在體內(nèi)持續(xù)表達并釋放治療性蛋白質(zhì)神經(jīng)基因?qū)肽X循環(huán)；基因?qū)肽X脊液；CNS間接打靶技術(shù)肝臟肝臟疾病的基因療法的重要靶器官胰腺基因轉(zhuǎn)入胰腺為治療胰腺癌等提供了可能眼組織眼組織內(nèi)注射可作為基因治療的靶1.2.2.1免疫細胞外周血淋巴細胞是惡性腫瘤、獲得性及遺傳性免疫系統(tǒng)紊亂性徉病的基因治療的主要靶細胞。主要以T淋巴細胞為主。腫瘤侵潤性淋巴細胞（TLL）、腫瘤引流淋巴結(jié)（TDLN）細胞、巨噬細胞等作為受體細胞很受關(guān)注。成纖維細胞成纖維細胞位于全身并具有較強的自我更新能力。在各種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)中可采用成纖維細胞作為靶細胞。優(yōu)點有：①易于獲得；②容易體外培養(yǎng)和擴增；③分裂中的成纖維細胞易與逆轉(zhuǎn)錄病毒一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，并能較穩(wěn)定的表面外源目的的基因；④攜帶外源基因后能穩(wěn)定地回植體內(nèi)并進行表達；⑤回植的成纖維細胞容易取出，等。主要缺點是在體內(nèi)由于細胞凋亡而引起的基因表達失活。骨骼肌細胞遺傳工程化的成肌細胞可能是體內(nèi)傳遞重組蛋白較好的系統(tǒng)。其優(yōu)點有易于獲得及在體個可大量擴增，可用于治療累及肌肉的遺傳病及一旦插入分泌性基因可使基因產(chǎn)物直接分泌進入血流等。由于肌源性前體細胞的存在與穩(wěn)定性，故有學(xué)者認為骨骼肌細胞是基因治療的理想靶細胞。血管平滑肌細胞血管平滑肌細胞易于獲得、培養(yǎng)和移植，故是基因治療常用的靶細胞。腫瘤細胞癌細胞是腫瘤基因治療的主要靶細胞之一。可采用原代腫瘤細胞或HLA配型的腫瘤細胞株。通過構(gòu)建腫瘤細胞特異性定向高表達病毒載體使腫瘤細胞作為受體細胞更具有優(yōu)越性。造血干細胞造血干細胞是基因治療遺傳病、自身免疫性疾病及癌癥常用的靶細胞。在腫瘤基因治療中，造血干細胞是耐藥基因、細胞因子基因等較理想的受體細胞。其他肝細胞存活期長，又在機體代謝中有重要作用，因而是肝癌等腫瘤基因治療的受體細胞。另外，角質(zhì)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、上皮細胞等也各有其特點而被用于腫瘤基因治療的受體。1.2.3腫瘤基因治療的目的的基因腫瘤基因治職的目的基因主要包括細胞因子基因、MHC分子基因、協(xié)同刺激分子基因、抗癌基因、反義核酸、腫瘤的藥物相關(guān)基因及病毒基因等。腫瘤基因治療的目的及常用目的基因簡介如下。1.2.3.4能改變腫瘤細胞的惡性表型的基因腫瘤細胞主要有癌基因的突變、擴增、過度表達，對此可采用反義核酸或核酶；抑癌基因的突變、失活等，可采用野生型的正?；蜃鳛橹委熁?，用正?；蛱蕹蛱鎿Q缺陷基因。1.2.3.2能提高腫瘤細胞的免疫原性的基因向腫瘤細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細胞免疫的細胞因子（如IL-2、GM-CSF）基因，共刺激分子B7基因等，以增強宿主的抗癌免疫反應(yīng)，可統(tǒng)稱為免疫基因治療。腫瘤藥物增敏基因腫瘤藥物敏感基因治療是將編碼某一敏感性因子的基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞，使腫瘤細胞對某種原本無毒或低毒的藥物產(chǎn)生特異的敏感性而死亡。這一表達敏感性因子的基因也被稱為自殺基因（Suicidegene）。常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因、水痘-帶狀皰疹病毒苷激酶（VZV-TK）基因、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（CD）基因、黃嘌吟-鳥嘌吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因、嘌吟核苷磷酸化酶CPNT）基因、細胞色素氧化酶P450基因、胞苷激酶（dck）等。如向腫瘤細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)HSK-TK基因、，該基因能將無細胞毒性的原藥丙氧鳥苷（GCV）磷酸化，對細胞產(chǎn)生毒性作用；向腫瘤細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)CD基因，能將無毒的前藥5-氟尿嘧啶（5-FU）轉(zhuǎn)化成有細胞毒性的5-氟尿嘧啶。自殺基因多是由病毒載體轉(zhuǎn)移進入細胞，故該方法又稱為病毒導(dǎo)向的酶前藥療法（VDEPT）。耐藥基因耐藥基因治療的目的是提高造血細胞等對化療藥物的耐受性。目前研究的耐藥基因有多藥耐藥基因（MDRL）、二氫葉酸脫氨酶（DHFR）等。如向造血干細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)耐藥基因MDRL，防止化療藥物的骨髓抑制作用。1.3基因轉(zhuǎn)移技術(shù)基因轉(zhuǎn)移至病人可以離體轉(zhuǎn)移（exvivo）后再回輸給病人，即回體基因治療：還可采用體內(nèi)直接注射途徑?；伢w基因治療一般應(yīng)用病毒載體，由于該法比體內(nèi)法更有效，故在臨床試驗中較常使用?；伢w基因治療的缺點是在把細胞植入機體之前，可能發(fā)生細胞的遺傳性改變；值人生長的培養(yǎng)基中的遺傳工程細胞時，大部分在體內(nèi)不能長期生存等。體內(nèi)基因治療是直接把遺傳物質(zhì)導(dǎo)入人體，這可以用非病毒載體完成。體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移可以是局部（原位的）或者是全身性轉(zhuǎn)移，其中原位基因轉(zhuǎn)移（Insitugenetherapy）指將遺傳物質(zhì)直接導(dǎo)入人體局部區(qū)域；全身性基因轉(zhuǎn)移時，基因傳遞的部位可能與某種形式的靶位無關(guān)，只要治療分子最終到達作用部位。體內(nèi)基因治療的優(yōu)點是：①不需要特殊細胞培養(yǎng)設(shè)施；②在控制條件下，大量制備臨床用質(zhì)粒DNA要比制備病毒載體容易;③沒有回體基因治療可能造成的致病性，一般較為完全等。體內(nèi)基因治療的缺點是由于難以接近靶組織，故轉(zhuǎn)移效率較低，注入的DNA的穩(wěn)定整合的水平也較低，等。體內(nèi)直接途徑的基因治療是指不需要細胞移植而直接將外源DNA注射至機體內(nèi)，DNA可單獨注射，也可以與畏助物如脂質(zhì)體一起注射，使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，表達而發(fā)揮作用。體內(nèi)直接途徑比exvivo或invitro的基因治療方式簡單、直接、經(jīng)濟、療效也比較確切。下面對各種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)作以簡要介紹。1.3.1回體法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)1.3.1.1化學(xué)法常用鈣磷酸鹽轉(zhuǎn)染法：先將質(zhì)粒DNA與氯化鈣溶液混合，然后再加入磷酸鹽緩沖液。該技術(shù)取決于通過與鈣粒子相互作用形成的質(zhì)粒DNA的沉淀，其轉(zhuǎn)移效率通常很低（小于1%），轉(zhuǎn)染之后幾乎難以在體內(nèi)觀察到轉(zhuǎn)移基因的表達。極低的細胞毒性及簡單便宜是該法的優(yōu)點。1.3.1.2物理法（1）電穿孔法：電穿孔法是通過電場作用于細胞幾微秒到幾毫秒之后，在細胞膜上暫時形成小孔或開口吧便把大分子如dna導(dǎo)入細胞的技術(shù)。一旦dna擴散進入細胞，就立即終止作用，這時細胞膜上的小孔又可自動重新閉合。該法具有可重復(fù)、干凈、快速及相對沒有毒性等優(yōu)點，但存在基因轉(zhuǎn)移的效果較差等缺點。（2） 基因槍：基因槍技術(shù)也稱顆粒轟擊法或生物子彈微射法，基因槍可直接轟擊包被金屬顆粒的dna，把攜帶有治療性kna的顆粒直接射入靶組織或單個靶細胞。該法具有簡單、快速、可重復(fù)、基因傳遞譜廣泛、不受基因大小及數(shù)量限制等優(yōu)點。其缺點是進入內(nèi)臟器官受限、基因轉(zhuǎn)入細胞核的效果差、洲入的dna穩(wěn)定整合的水平較低等。（3） 顯微注射法：顯微注射法是在顯微鏡下人工用帶細針的注射器穿透細胞膜并把遺傳物質(zhì)注入細胞質(zhì)的方法。該法用于胚素基因轉(zhuǎn)移。（4） 超聲波介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染：超聲波增加細胞膜的通盤性并使質(zhì)粒被動擴散進入細胞變得容易。該法是把外源性dna及其他大分子導(dǎo)入細胞的較有前景的方法。細胞介導(dǎo)的基因治療細胞在體外擴增、修飾后，注入機體靶組織。常用的介導(dǎo)基因治療的細胞有成纖維細胞、骨骼肌細胞、血管平滑肌細胞、淋巴細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞等。囊包細胞植入囊包技術(shù)涉及用選擇性通透膜包囊細胞，植入宿主體內(nèi)特定部位。靶向基因治療將基因轉(zhuǎn)運到特定的靶細胞是提高基因治療效果和減少不良反應(yīng)的重要措施。常用靶向基因治療轉(zhuǎn)移技術(shù)見表15-2。1.3.2體內(nèi)基因治療的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)體內(nèi)基因治療的載體可以是病毒載體，也可