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丹莪婦康煎膏對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1表達的影響
子宮內(nèi)膜綜合征(iu)是婦女的常見病。近年來,發(fā)病率顯著增加,引起了學術界的關注,但其發(fā)病機制尚不清楚。Sampson最早提出了子宮內(nèi)膜種植學說,月經(jīng)期脫落的子宮內(nèi)膜碎片,隨經(jīng)血逆流經(jīng)輸卵管進入腹腔,種植于卵巢和鄰近的盆腔腹膜,并繼發(fā)生長和蔓延,發(fā)展成EMS。在這一過程中,脫落的子宮內(nèi)膜碎片的遷移和侵襲能力至關重要。而異位內(nèi)膜的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)之間的平衡失調(diào),會促進細胞外基質(zhì)降解,增加異位內(nèi)膜侵襲力??梢?MMPs/TIMPs系統(tǒng)在EMS的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的作用。丹莪婦康煎膏(DFD)為臨床治療EMS的常用中藥,能活血化瘀,疏肝理氣,調(diào)經(jīng)止痛,軟堅化積。我們前期研究發(fā)現(xiàn),其對EMS大鼠有較好治療作用,但作用機制不明。本實驗采用子宮內(nèi)膜自體移植法建立大鼠EMS模型,通過觀察丹莪婦康煎膏對EMS大鼠異位子宮內(nèi)膜組織MMP-9和TIMP-1mRNA表達的影響,探討其防治EMS作用的機制。1材料表面1.1syxk冀Wistar大鼠,清潔級,雌性,180~200g[河北省實驗動物中心,實驗動物使用許可證SYXK(冀)2006-0047,動物合格證號1009075]。飼養(yǎng)于溫度20~23℃,濕度45%~60%,過氧乙酸溶液消毒環(huán)境。1.2孕三烯酮和慶大霉素丹莪婦康煎膏(昆明滇虹藥業(yè)有限公司,批號100404);孕三烯酮(北京紫竹藥業(yè),批號53110101);慶大霉素(石家莊制藥集團有限公司,批號068100905);苯甲酸雌二醇(上海通用藥業(yè)股份有限公司,批號009004)。1.3timp-1擴增片段的構(gòu)建RT-PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司];Trizol(美國Invitrogen公司);PCR引物序列:MMP-9上游引物:5′-AAAGGTCGCTCGGATGGTTA-3′,下游引物5′-AGGATTGTCATCTGGAGTCGA-3′,預擴增片段為619bp;TIMP-1上游引物:5′-GCTAAATTCATGGGTTCCCCAG-3′,下游引物5′-TTGCTGAGCAGGGCTCAGATTA-3′,預擴增片段為279bp;β-actin上游引物5′-TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG-3′,下游引物5′-GGAACCGCTCATTGCCGATAGT-3′,預擴增片段為576bp。1.4pcr擴增及衍射分析超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);756MC型紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);PE9600型PCR擴增儀(美國PE公司);電泳儀及電泳槽(北京六一儀器廠);BIO-PROFIF凝膠圖像分析系統(tǒng)(法國VL公司);紫外透射儀(北京鼎國昌盛生物制品有限公司);MDF-382E超低溫保存箱(日本SANYO公司);1-15K高速冷凍離心機(美國Sigma公司)。2方法2.1患者安氏肌肉注射給予大鼠精子組織及術后觀察采用自體移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉2mL·kg-1,待麻醉后固定于操作板上。開腹找到子宮,暴露左側(cè)子宮,在離卵巢約1cm處,分離附著于子宮肌壁的脂肪和結(jié)締組織,兩端分別用手術線結(jié)扎,剪取中間約1cm長子宮組織,縱向剖開宮腔,暴露子宮內(nèi)膜,切取5mm×5mm的子宮壁塊。在腹壁切口右側(cè)的腹肌與皮下筋膜層之間打隧道,以正好能置入子宮壁塊為宜,將子宮壁塊平整的置入右側(cè)隧道底部,使內(nèi)膜面緊貼腹肌,常規(guī)關閉腹腔。假模型組按上述方法切取子宮組織,丟棄,關腹,其他操作同上。術后,每只大鼠腹腔注射慶大霉素0.4萬單位,連續(xù)5d。術后次日,各鼠肌肉注射雌二醇0.1mg·kg-1,每隔4d1次,共3次,以促進移植內(nèi)膜的生長。術后每周觸摸包塊2次,觀察是否出現(xiàn)包塊及包塊的體積變化。術后第21天,將大鼠麻醉后固定,開腹,觀察異位內(nèi)膜形態(tài)學變化。以游標卡尺測量異位內(nèi)膜組織體積,若體積增大≥8mm3,并出現(xiàn)液體積聚,隆起呈透明小囊狀,則為造模成功。2.2單次給藥劑量ldf取造模成功的大鼠40只,隨機分為模型組(MG),丹莪婦康煎膏高劑量組(DFD-H,6g·kg-1·d-1)、低劑量組(DFD-L,3g·kg-1·d-1)、孕三烯酮組(GSG,1.25mg·kg-1·d-1),每組10只。另設假手術組(SHM)大鼠10只。各組大鼠每日灌胃給藥(或蒸餾水)1次,給藥容量為10mL·kg-1,連續(xù)30d。末次給藥后禁食12h,麻醉,開腹,快速剪取異位子宮內(nèi)膜組織,假手術組剪取在位子宮內(nèi)膜組織,用高溫滅酶的鋁箔紙密封包裹,-80℃凍存。2.3mmp-1-actinTrizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進行PCR擴增。RT-PCR條件:MMP-9:94℃變性3min;94℃40s,55℃退火50s,72℃90s,循環(huán)30次;72℃延伸10min。TIMP-1:退火溫度為58℃,其他條件同MMP-9;β-actin:退火溫度為59℃,其他條件同MMP-9。反應結(jié)束后,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳,以DNAMarker(DL2000)作為標準片段標記,電泳后于紫外透射儀觀察,并用數(shù)碼相機照相,輸入微機應用QuantityOne凝膠圖像分析軟件對目的電泳條帶進行分析,以相應的內(nèi)參電泳條帶作為參照,結(jié)果以兩者之積分吸光度的比值表示。2.4分析過程統(tǒng)計結(jié)果用(ˉx±s)表示,采用SPSS11.5進行分析。所有數(shù)據(jù)先行正態(tài)性和方差齊性檢驗,各組間比較采用單因素方差分析,樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。3結(jié)果3.1各組大鼠精子內(nèi)皮中mmp-9mrna表達的比較模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織MMP-9mRNA的表達量明顯高于假手術組大鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達量(P<0.01)。丹莪婦康煎膏各劑量組及孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織MMP-9mRNA的表達量較模型組顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見表1、圖1。3.2各組大鼠精子內(nèi)皮組織timp-1的表達量模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織TIMP-1mRNA的表達量明顯低于假手術組大鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達量(P<0.01)。丹莪婦康煎膏各劑量組及孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織TIMP-1mRNA的表達量較模型組顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見表2、圖2。4儲底膜的活性EMS是一種危害婦女健康的常見病、多發(fā)病。正常情況下,子宮內(nèi)膜覆蓋于子宮體腔面,如因某些因素,使子宮內(nèi)膜在身體其他部位生長,即可成為EMS。EMS可致痛經(jīng)并進行性加重,還可引起月經(jīng)不調(diào)、性交痛、不孕等癥狀,雖為良性疾病,但具有增生、浸潤、轉(zhuǎn)移及復發(fā)的特點,病情遷延,嚴重影響婦女的身心健康及家庭幸福。研究人員雖已對EMS進行了多方面的研究,但其發(fā)病機制仍眾說紛紜,沒有定論。其中,子宮內(nèi)膜種植學說是EMS發(fā)病的主導理論,認為脫落的子宮內(nèi)膜碎片由輸卵管流入腹腔,種植在盆腔臟器表層而形成病灶。但流入腹腔的內(nèi)膜組織必須降解基底膜及其他細胞外基質(zhì)成分才能完成種植。MMP是催化細胞外基質(zhì)降解的主要酶類之一,幾乎能降解細胞外基質(zhì)的所有成分。其中,MMP-9是降解細胞外基質(zhì)最重要的酶類之一,它參與了細胞外基質(zhì)主要成分IV型膠原的降解,并能促進血管內(nèi)皮細胞出芽以及新生血管形成,促進EMS異位內(nèi)膜的形成和生長。而TIMP則是一類蛋白酶抑制劑,能抑制MMP的活性。其中,TIMP-1能夠與活化的MMP-9形成復合物而抑制其活性,降低細胞外基質(zhì)的降解,抑制新生血管形成。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),EMS患者異位內(nèi)膜可表現(xiàn)出MMP-9表達增強,而TIMP-1表達降低,細胞外基質(zhì)降解增多,導致異位內(nèi)膜侵襲性生長。本實驗結(jié)果也顯示,模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織MMP-9mRNA的表達明顯高于假手術組大鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(P<0.01),而TIMP-1mRNA的表達則明顯低于假手術組大鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(P<0.01),這與臨床研究結(jié)果相吻合,說明MMP-9/TIMP-1比例的升高與EMS的發(fā)病密切相關。丹莪婦康煎膏為臨床治療EMS的常用中藥,是由紫丹參、莪術、竹葉柴胡、三七等中藥組方而成,具有活血化瘀、疏肝理氣、調(diào)經(jīng)止痛、軟堅化積等功效。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn),丹莪婦康煎膏對EMS模型大鼠有較好治療作用,但作用機制不明。本實驗采用子宮內(nèi)膜自體移植法建立大鼠EMS模型
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