分子生物學(xué)常用技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用課件 酶切重組質(zhì)粒電泳分離所插入的dna

實(shí)驗(yàn)4酶切重組質(zhì)粒電泳分離所插入的DNA1實(shí)驗(yàn)41目的1．鑒定。鑒定所培養(yǎng)的單菌落中是否含有重組質(zhì)粒，或僅含有自身環(huán)化的質(zhì)粒。當(dāng)酶切產(chǎn)物電泳后，重組成功者電泳后會(huì)出現(xiàn)大小不等的兩條DNA條帶，一條為線性質(zhì)粒載體的DNA，分子量大，在后面，另一條為插入的目的基因，分子量小，在前面；而自身環(huán)化者僅有一條載體的DNA條帶。2．收獲。通過電泳分離，使載體與插入目的基因分開，便于分別回收載體和已大量擴(kuò)增了的插入目的基因。比如探針用片段。2目的2本實(shí)驗(yàn)由2個(gè)部分組成：（1）酶切重組質(zhì)粒；（2）DNA的瓊脂糖凝膠電泳?！耜P(guān)于限制性內(nèi)切酶本實(shí)驗(yàn)選用的限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)中最為常用的工具酶。通常不同的限制性內(nèi)切酶分別能識別一小段雙鏈DNA序列，長度多在4～6個(gè)核苷酸，且呈雙重對稱的DNA序列，并將其切斷。有粘端和鈍端兩種形式：3本實(shí)驗(yàn)由2個(gè)部分組成：3

EcoRI↓5'...GAATTC...3'→5'...GAATTC...3'3'...CTTAAG...5'3'...CTTAAG...5'PstI↓5'...CTGCAG...3'→5'...CTGCAG...3'3'...GACGTC...5'3'...GACGTC...5'

SmaI↓5'...CCCGGG...3'→5'...CCCGGG...3'3'...GGGCCC...5'3'...GGGCCC...5'4EcoRI4利用這種特性，可以選擇適當(dāng)?shù)拿竵砬懈钏璧腄NA片段，或選擇適當(dāng)?shù)拿盖虚_載體，造成載體的粘端序列與插入DNA的粘端序列相同，以便于重組質(zhì)粒。具體酶的特性、識別位點(diǎn)等可以參考不同公司的試劑目錄。5利用這種特性，可以選擇適當(dāng)?shù)拿竵砬懈钏璧腄NA片段，或選擇●瓊脂糖凝膠電泳DNA的瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用廣泛的技術(shù)，該技術(shù)利用DNA分子在電場下向電場一極遷徙的特性。在pH中性的條件下，DNA分子由陰極向陽極遷徙。其間，DNA分子量大，摩擦阻力大，在凝膠的孔隙中遷徙得慢；分子量小，摩擦阻力小，遷徙快，在電泳一定時(shí)間后，大小不等得DNA分子可以得到有效得分離。同樣分子量的DNA，環(huán)狀的較線性的遷徙速度快。分離的DNA可以方便地用溴乙錠染色，方法是：（1）在灌膠時(shí)直接把溴乙錠混入凝膠，或（2）電泳后將凝膠浸入溴乙錠染液（我們推薦前者），染色后在紫外透射燈下可以看到橘紅色的DNA條帶，在一般實(shí)驗(yàn)室最低分辨能力（肉眼可見的）約為50～100ng。6●瓊脂糖凝膠電泳6

原理采用限制性內(nèi)切酶HindIII切開插入DNA與質(zhì)粒載體，將這一反應(yīng)液上樣于瓊脂糖凝膠，電泳，使分子量小的插入DNA前移，并與分子量大的在電泳中滯后的質(zhì)粒載體DNA分開。7原理7實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（參考教材）8實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備8

實(shí)驗(yàn)步驟1．酶切質(zhì)粒取一潔凈的1.5mlEppendorf管，編好號，插入冰中，依次加入：

水 7ul

10×緩沖液

2ul

BSA

2ul

重組質(zhì)粒 8ul

HindIII

1ul

20ul蓋上蓋，混勻，將反應(yīng)物甩入管底，置37℃水浴中溫育1小時(shí)。9實(shí)驗(yàn)步驟92．灌膠將粘膠紙粘于灌膠模槽的兩端，制成灌膠模。放入梳子。將模放于水平臺上。取一燒杯，放入：

瓊脂糖

0.7g

5×TBE

10ml

水

40ml

50ml

混勻，加熱，至瓊脂糖徹底溶解。待稍冷后，加入5ul飽和的溴乙錠，輕晃混勻，然后輕輕倒入模子。用吸頭吸去表面小泡。待冷卻成膠。如果梳子大且角銳利，應(yīng)該離模具底部遠(yuǎn)些，以防拔梳子時(shí)將凝膠底部拔穿。102．灌膠103．上樣電泳

將膠兩頭粘膠紙揭去，移入電泳槽，梳子一側(cè)靠近操作者，注入1×TBE緩沖液，浸沒凝膠，輕輕拔出梳子。接上電源：陽極遠(yuǎn)離上樣孔，陰極靠近上樣孔（DNA向陽極移動(dòng)）。加4ul上樣緩沖液入酶切反應(yīng)液，混勻，插入冰內(nèi)。加2ul上樣緩沖液入10ul小量制備的重組質(zhì)粒，混勻，插入冰內(nèi)。上樣次序：由右向左。第1孔：5ul標(biāo)準(zhǔn)品梯度DNA，第2孔：12ul未經(jīng)切割的重組質(zhì)粒DNA，第3～6孔：24ul含上樣緩沖液的酶切反應(yīng)液。加樣時(shí)，加樣頭尖端插入上樣孔內(nèi)1/3高度，輕輕將樣品推入，使比重較大的樣品自然沉入上樣孔底。避免刺入前后凝膠和刺穿凝膠底部（幻燈）。開啟電源，電壓調(diào)至100V。通常半小時(shí)后檢查。113．上樣電泳111212

實(shí)驗(yàn)結(jié)果置凝膠于長波紫外透射儀上，可見清晰的呈淡橘紅色的標(biāo)準(zhǔn)品若干梯度條帶、一條對應(yīng)于2000～2500bp的未被切割的環(huán)狀含插入片段的質(zhì)粒和分別對應(yīng)于250bp和3000bp的兩條DNA條帶。前面一條約250bp的DNA條帶即放大了的插入DNA片段，后面一條為線狀的質(zhì)粒DNA。13實(shí)驗(yàn)結(jié)果131414

注意事項(xiàng)1．若所制備的質(zhì)粒不能被內(nèi)切酶切割，可用酚/氯仿抽提一次。2．如前所述，一些限制性內(nèi)切酶對乙醇敏感，比如EcoRI。一旦樣品有痕量乙醇污染，會(huì)引起酶的失活，難以切開DNA。此時(shí)，可以將樣品試管開蓋，置于70℃干浴器中若干分鐘，使乙醇逐漸揮發(fā)，這樣十分有效。15注意事項(xiàng)153．常見錯(cuò)誤（1）溶解凝膠時(shí)，凝膠沸騰后立即外溢。因此，加熱溶解凝膠時(shí)操作人員不能離開。（2）上樣的錯(cuò)誤：前后左右和底部的凝膠被刺破，樣品漏掉或電泳條帶的形態(tài)不好。尤其是底部刺穿，樣品遺失十分可惜。形成原因是沒有經(jīng)驗(yàn)和手法不好。介紹手法。另外，樣品溫度過高或上樣緩沖液含量不夠，比重不夠，上樣時(shí)樣品漂浮起來，溢出孔外。163．常見錯(cuò)誤16（3）電極放反。有時(shí)電極沒有放反，但接入電源時(shí)被接反，結(jié)果一樣，使DNA樣品倒遷徙，立即移出凝膠，工作失敗。因此，建議電泳前仔細(xì)檢查，電泳一段時(shí)間后，觀察染料確實(shí)向前移出后，方可離開。（4）電泳時(shí)間過頭。電泳時(shí)間通常視分離片段的大小而定，一般為半小時(shí)至1小時(shí)。如果電泳時(shí)間過長，目的DNA可能會(huì)遷移出凝膠外，實(shí)驗(yàn)失敗。因此建議使用定時(shí)器或含有定時(shí)功能的電泳電源。17（3）電極放反。有時(shí)電極沒有放反，但接入電源時(shí)被接反，結(jié)果一（5）凝膠自灌膠模具上滑落下來。由于觀察電泳結(jié)果要將凝膠自灌膠模具推移至紫外透射儀上，且往往紫外透射儀安放在暗室，這樣需要將凝膠自電泳槽中移出，搬遷。在此過程中容易發(fā)生凝膠自灌膠模具上滑落。避免的方法是以食指抵在灌膠模具槽的一端，槽向食指傾斜，使凝膠靠在食指上，左右由于有槽的兩側(cè)側(cè)壁護(hù)著，保證凝膠不致滑落。（6）凝膠滑入電泳緩沖液。當(dāng)紫外透射觀察后，如果不同片段的分離尚不徹底，需要進(jìn)一步電泳時(shí)，要將凝膠放回電泳槽。此時(shí)，凝膠因脫離過模具，粘附不緊，容易自模具中滑入槽內(nèi)的電泳緩沖液中。若未及時(shí)發(fā)現(xiàn)，通電后會(huì)造成DNA遷徙出凝膠。因此要求凝膠確保未移動(dòng)后方可通電繼續(xù)電泳。18（5）凝膠自灌膠模具上滑落下來。由于觀察電泳結(jié)果要將凝膠自灌（7）凝膠濃度不對。過濃或過稀。介紹手冊上的方法：大約小片段（100bp左右）用2%左右凝膠，大片段（500bp以上）用1%左右，可以用到0.8%。（8）電泳緩沖液比例或內(nèi)容不對，偶爾也可以見到。4．電泳后的DNA條帶會(huì)在凝膠中自行擴(kuò)散，因此要求電泳后立即觀察，以免條帶擴(kuò)散。19（7）凝膠濃度不對。過濃或過稀。介紹手冊上的方法：大約小片段實(shí)驗(yàn)5

從凝膠中回收DNA20實(shí)驗(yàn)520目的從凝膠中回收DNA是分子生物學(xué)中經(jīng)常要做的工作。為此，已發(fā)展了許多方法，比如：（1）低熔點(diǎn)凝膠。（2）透析袋電泳分離。（3）凝膠挖槽電泳分離。（4）S&SNA45DEAE膜DNA分離與回收。該方法回收率高，且具有很高的純度（教材上有詳細(xì)介紹）。（5）用QIAquickGelExtractionKits回收凝膠中的DNA。該方法效率高、所回收DNA的純度高，且能大大縮短了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，業(yè)已形成產(chǎn)品。我們予以介紹。21目的21

第一次使用前，在15ml漂洗液PW中加入60ml無水乙醇。

所有工作均在室溫下進(jìn)行。22第一次使用前，在15ml漂洗液PW中加入60ml無水乙醇

操作步驟

1．將目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入干凈的離心管中，稱取重量。

2．加入3倍體積溶膠液PN（如果凝膠重0.1g，其體積可視為100ul，加入300～500ul溶膠液），50℃水浴放置10分鐘。期間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解（若膠塊過大，請事先切碎）。

3．試管恢復(fù)至室溫。

4．加入10ul3MNaAC，混勻，室溫下10分鐘。

5．將此溶液加入一個(gè)吸附柱，下置收集管，13000rpm離心30秒。倒掉收集管中的廢液，將吸附柱再次插上收集管。23操2424

6．向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，13000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱再次插上收集管。

7．向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，13000rpm離心2分鐘。將吸附柱置于室溫或