藥物分析第四章

第四章藥物的含量測定方法與驗證定量分析方法的分類與特點

1樣品分析的前處理方法2藥品質(zhì)量標準分析方法驗證3熟悉分析法的原理2.不同前處理方法的適用范圍3.不同方法對驗證內(nèi)容的要求掌握容量,光譜和色譜分析法2.滴定度與含量計算3.系統(tǒng)適用性試驗內(nèi)容與要求4.樣品分析的前處理方法5.分析方法的驗證內(nèi)容學(xué)習(xí)要求滴定液的配制與標定2.分析儀器的校正和檢定了解第一節(jié)

定量分析方法的分類與特點

一、容量分析法二、光譜分析法三、色譜分析法一、容量分析法(一)特點與適用范圍

(1)方法簡便易行

(2)方法耐用性高

(3)測定結(jié)果準確

(4)方法專屬性差

適用于原料藥含量測定(二)有關(guān)計算:1.滴定度與滴定度計算2.含量計算

(1)直接滴定法

(2)間接滴定法生成物滴定法剩余量滴定法也稱滴定法:將已知濃度滴定液滴加至被測藥物溶液中,至滴定終點,根據(jù)滴定液的濃度,體積和滴定度,計算含量

容量分析法自動電位滴定儀(二)相關(guān)計算每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y藥物的質(zhì)量,mg

1.滴定度每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6

溴酸鉀法測定異煙肼(C6H7N3O=137.14)的含量,溴酸鉀滴定液濃度為0.01667mol/L(KBrO3為單元)

反應(yīng)式:每1ml溴酸鉀滴定液(0.01667mol/L)

相當(dāng)于3.429mg的異煙肼(C6H7N3O)滴定度:2.含量測定直接滴定法

生成物滴定法剩余量滴定法(1)(2)(3)(1)直接滴定法注意掌握滴定反應(yīng)的原理,藥物與滴定劑在反應(yīng)中的摩爾比正確計算滴定度和百分含量(2)生成物滴定法注意摩爾比的替換藥物與A作用生成B,用滴定液滴定B百分含量計算方法與直接滴定法相同滴定度

葡萄糖酸銻鈉含量測定:本品約0.3g,加水100ml、鹽酸15ml與碘化鉀試液10ml,暗處放置10分鐘,用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定每1ml硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于6.088mg銻(Sb)反應(yīng)式:(3)剩余量滴定法(回滴法)加入定過量滴定液A,用滴定液B滴定剩余的A注意:滴定度為滴定液A的滴定度無空白進行空白校正

司可巴比妥鈉含量測定:本品約0.1g,加水10ml溶解,精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml,再加鹽酸5ml,放置15分鐘,加碘化鉀試液10ml,用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定,滴定的結(jié)果用空白試驗校正

W=0.1022g;硫代硫酸鈉滴定液F=1.038;供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液15.73ml;空白23.21ml滴定度司可巴比妥鈉M=260.27,與溴摩爾比為1:1滴定液A與滴定液B濃度是相當(dāng)?shù)匿宓味ㄒ?0.05mol/L)與硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)

因為溴(Br2)等摩爾轉(zhuǎn)化為碘(I2),而碘(I2)與硫代硫酸鈉(Na2S2O3)反應(yīng)的摩爾比為1:2,所以溴滴定液與硫代硫酸鈉滴定液的濃度比也是1:2

滴定液A與滴定液B經(jīng)濃度校正后的消耗體積(V’=V×F)是相當(dāng)?shù)亩?、光譜分析法定義分類

UV-Vis利用物質(zhì)的光譜進行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法——光譜分析法IRAAFluorFP(flamephotometry)(一)特點與適用范圍F-IR(一)紫外-可見分光光度法1.特點與適用范圍

(1)方法簡便易行

(2)方法靈敏度高

(3)結(jié)果準確度較高

(4)方法專屬性較差

制劑含量測定與定量檢查2.儀器校正和檢定

(1)波長

(2)吸光度的準確度

(3)雜散光

3.測定法

對照品比較,吸收系數(shù)計算光譜,比色法基于對紫外光區(qū)(200~400nm)和可見光區(qū)(400~760nm)單色光吸收特性的分析方法原理:

UV-Vis(1)對照品比較法原料藥制劑溶液濃度

氟康唑片溶出度檢查:取本品(規(guī)格:100mg),鹽酸溶液(9→1000)1000ml為溶出介質(zhì),經(jīng)45分鐘時,取溶液濾過;取續(xù)濾液,在261nmm波長處測定吸光度;另取氟康唑?qū)φ掌愤m量,精密稱定,加溶出介質(zhì)溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.1mg的溶液,同法測定,計算每片的溶出量(2)吸收系數(shù)法原料藥制劑溶液濃度

鹽酸氯丙嗪注射液(規(guī)格：xxml:xxmg)的含量測定：精密量取適量(Vml,相當(dāng)于鹽酸氯丙嗪50mg),置200ml量瓶中,用鹽酸溶液(9

1000)稀釋至刻度,搖勻;精密量取2ml,置100ml量瓶中,用鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻,在254nm的波長處測定吸光度,按吸收系數(shù)()為915計算

(二)熒光分析法1.特點

(1)高靈敏度

(2)熒光自熄滅

(3)易受干擾

(4)線性范圍窄

(RX–RXb)/(Rr–Rrb)=0.5~2

2.消除干擾

(1)溶劑:空白對照

(2)溶液:稀,凈,充氮,pH

(3)器皿:潔凈,無機清潔液3.測定法:對照品比較物質(zhì)受UV或Vis照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長長的熒光;激發(fā)光停止照射,熒光隨之消失;

激發(fā)和發(fā)射光譜用于定性,熒光強度用于定量Fluor三、色譜分析法特點與應(yīng)用分類

依據(jù)分離原理：(1)高靈敏度:ng-μg/ml(2)高專屬性:選擇性檢測(3)高效能與高速度吸附;分配;離子交換;分子排阻色譜法

復(fù)方制劑含量測定的首選方法依據(jù)分離方式：紙色譜;薄層色譜;柱色譜;氣相色譜;高效液相色譜法

F-IR(一)高效液相色譜法1.儀器(RP-HPLC)(1)色譜柱:ODS最常用;粒徑一般在3-10

m;溫度≯40℃(2)檢測器:UV(DAD,PDA);Fluor,ELSD,RID,ECD,MS(3)流動相:

首選甲醇-水(末端波長檢測:乙腈-水),有機相≮5%;pH2-8

2.系統(tǒng)適用性試驗

(1)色譜柱的理論板數(shù)(n)

(2)色譜峰的分離度(R)(3)色譜系統(tǒng)的重復(fù)性(RSD%)(4)色譜峰的拖尾因子(T)3.測定法

(1)內(nèi)標法

(2)外標法不得改變：固定相種類,流動相組分,檢測器類型可以改變：色譜柱內(nèi)徑,長度,載體粒度流動相流速,混合流動相各組分的比例柱溫;進樣量;檢測器的靈敏度HPLC2.系統(tǒng)適用性試驗分離度(R):用于評價組分的分離程度;關(guān)鍵指標重復(fù)性:用于評價連續(xù)進樣系統(tǒng)響應(yīng)的重復(fù)性能

拖尾因子(T):用于評價色譜峰的對稱性理論板數(shù)(n):用于評價色譜柱的分離效能n=(tR/

)2=16(tR/W)2;n=5.54(tR/Wh/2)2;RSD≥1.53.測定法與計算(2)外標法(1)內(nèi)標法氨酚待因片(I)的含量測定取本品20片,精密稱定,研細,精密稱取適量,置250ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,濾過,取續(xù)濾液10μl進樣;另精密稱取磷酸可待因與對乙酰氨基酚對照品適量,加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含磷酸可待因0.03mg和對乙酰氨基酚2mg的溶液,同法測定(二)氣相色譜法檢測器——FID進樣方式

(1)溶液直接進樣:

不超過數(shù)微升(

l);毛細管柱分流

(2)頂空進樣:供試液于密閉小瓶中,加熱至待測組分達到液-氣平衡,進樣器自動吸取一定體積的頂空氣進樣2.系統(tǒng)適用性試驗

同HPLC3.測定法

(1),(2)同HPLC(3)標準溶液加入法對照品溶液適量,精密加入到供試品溶液中,測定含量,扣除加入的對照品溶液含量即得色譜柱：常用毛細管柱——熔融石英或玻璃內(nèi)徑一般為0.25mm,0.32mm或0.53mm;柱長5~60m

內(nèi)壁或載體經(jīng)交聯(lián)或涂漬固定液;固定液膜厚0.1~5.0

m

固定液:甲基聚硅氧烷,苯基甲基聚硅氧烷,聚乙二醇

GC第二節(jié)

樣品分析的前處理方法一、不經(jīng)有機破壞的前處理方法二、經(jīng)有機破壞的前處理方法(一)水解法;(二)還原法(一)干法破壞;(二)濕法破壞一、不經(jīng)有機破壞的方法

1.酸水解法水難溶性含金屬有機藥物與礦酸(鹽酸)共熱:

十一烯酸鋅測定

回流有機結(jié)合的待測元素原子離解,轉(zhuǎn)化為無機鹽(離子)2.堿水解法含鹵素有機藥物(脂肪碳鏈)與氫氧化鈉溶液回流:三氯叔丁醇測定

適用于:結(jié)合不牢固的含金屬或含鹵素有機藥物(一)水解法一、不經(jīng)有機破壞的方法碘他拉酸測定:氫氧化鈉試液與鋅粉回流后,用硝酸銀滴定回流堿性溶液中加鋅粉回流,使碳-碘鍵還原轉(zhuǎn)化為無機碘化物碘番酸膽影酸膽影葡胺注射液泛影酸泛影酸鈉泛影葡胺注射液

適用于:結(jié)合牢固的含碘有機藥物

(直接與芳環(huán)連接)

(二)還原法二、經(jīng)有機破壞的方法(一)濕法破壞

適用于含氮有機藥物分析的前處理

硫酸作為分解劑,氧化劑(硝酸,高氯酸)輔助分解劑

凱氏定氮法

(二)干法破壞高溫?zé)胱品ㄓ糜诤u素藥物的鑒別無水碳酸鈉,硝酸鎂,氫氧化鈣,氧化鋅等輔助灰化

2.氧瓶燃燒法適用于:

含金屬,鹵素,氮,硫,磷等有機藥物

(待測原子與碳原子結(jié)合牢固者)1.凱氏定氮法

(2)消解劑與助劑:硫酸-硫酸鉀-硫酸銅

(3)操作法(1)儀器裝置(4)應(yīng)用范圍:含有氨基或酰氨(胺)結(jié)構(gòu)

供試品:常量法含氮25~30mg;半微量法:1.0~2.0mg消解:溶液成澄明的綠色,繼續(xù)加熱30min蒸餾與接收:40%氫氧化鈉堿化,水蒸氣蒸餾,2%硼酸溶液吸收

滴定:甲基紅-溴甲酚綠指示液,硫酸滴定液(0.05mol/L),灰紫色

撲米酮的含量測定取本品約0.2g,精密稱定,照氮測定法測定;每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于10.91mg的撲米酮(C12H14N2O2)

關(guān)鍵步驟:消解試劑作用:硫酸-消解劑;硫酸鉀-提高沸點;

硫酸銅-催化劑;硼酸-固氮(NH3·H3BO3)(5)示例與討論C12H14N2O2=218.262.氧瓶燃燒法

儀器裝置

鉑絲:1mm;2/3

瓶:硬質(zhì)玻璃(石英玻璃) 10-20mg——500ml 200mg——1000-2000ml含待測元素的有機藥物在充滿氧氣的燃燒瓶中充分燃燒 有機結(jié)構(gòu):徹底分解為CO2和H2O

待測元素:轉(zhuǎn)化為不同價態(tài)的氧化物(或無氧酸)

被吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?多以酸根離子形式存在)

(2)燃燒產(chǎn)物與吸收液

氟——HF: 水 氯——HCl: 水-氫氧化鈉 溴——Br2+HBr: 水-氫氧化鈉-二氧化硫 碘——I2(+HIO): 水-氫氧化鈉(二氧化硫)

硫——SO3(+SO2): 水-過氧化氫

磷——P2O5→H4P2O7,(HPO3)n: 水-硝酸(煮沸)(3)碘苯酯的含量測定20mg,氫氧化鈉試液2ml與水10ml為吸收液吸收液,加溴-醋酸10ml,加甲酸1ml,并通空氣3min加碘化鉀2g,用硫代硫酸鈉滴定液(0.02mol/L)滴定摩爾比為1:6,T=416.34

(1/6)

0.02=1.388(mg)C19H29IO2=416.34需驗證的項目驗證的內(nèi)容準確度

定量限防腐劑溶出度,釋放度鑒別試驗雜質(zhì)檢查含量測定藥品質(zhì)量標準分析方法驗證

精密度專屬性檢測限

線性

范圍

耐用性重復(fù)性中間精密度重現(xiàn)性一、準確度(一)含量測定方法

(二)雜質(zhì)定量測定加入已知量雜質(zhì)進行測試

(三)數(shù)據(jù)要求9個測定結(jié)果

3個不同濃度

(80,100,120％)

每個濃度各3份準確度系指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度一般用回收率(%)表示定義二、精密度1.重復(fù)性同一分析人員連續(xù)測定所得結(jié)果的精密度;

也稱批內(nèi)精密度或日內(nèi)精密度2.中間精密度

不同時間不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度批/日間精密度

3.重現(xiàn)性

在不同實驗室不同人員測定結(jié)果之間的精密度

法定標準采用的分析方法進行

同一均勻供試品多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度標準偏差(s,SD);相對標準偏差(RSD)數(shù)據(jù)要求同“準確度”定義三、專屬性(一)鑒別反應(yīng)空白,結(jié)構(gòu)相似物或有關(guān)物質(zhì)呈負反應(yīng)(三)含量與雜質(zhì)測定含雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣中各峰能獲得分離在其他成分(雜質(zhì),降解產(chǎn)物,輔料等)可能存在下,方法能正確測定出被測物的特性鑒別,雜質(zhì)檢查和含量測定方法

定義與應(yīng)用四、檢測限檢測限(limitofdetection,LOD)是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量LOD是一種限度檢驗效能指標,反映方法靈敏度適用于可用目視法直接評價結(jié)果的分析方法,非儀器分析法鑒別的顯色法;雜質(zhì)檢查的TLC適用于能直觀顯示信號與基線噪聲水平的分析方法,如HPLC法

信噪比S/N=3(2)時的相應(yīng)濃度或量適用于不能直觀比較信噪比的儀器分析方法,如UV-Vis法

1.目視法

2.信噪比法

3.標準偏差法

五、定量限雜質(zhì)和降解產(chǎn)物用定量方法研究時,應(yīng)確定LOQLOQ的測定方法與LOD相同相應(yīng)的系數(shù)(倍數(shù))不同,如信噪比S/N=10定量限(limitofquantitation,LOQ

)是指試樣中被測物能被定量測定的最低量;反映方法的靈敏度測定結(jié)果應(yīng)具有一定準確度和精密度六、線性與范圍范圍系指方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間在試驗研究開始前確定驗證的范圍和方法在范圍內(nèi)應(yīng)能達到一定精密度,準確度和線性線性系指在設(shè)計的“范圍”內(nèi),響應(yīng)值(y)與被測物濃度(x)直接呈正比關(guān)系的程度y=ax+b系列(n≥5)