臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療自身免疫性肝病的

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療自身免疫性肝病的療效和安全性觀察*/1前言自身免疫性肝病(autoimmuneliverdiseases,AILD)不同于病毒感染、酒精、藥物等引起的肝病，是一組由異常自身免疫介導(dǎo)的非傳染性的以肝功能試驗(yàn)異常和肝臟病理損害為主要表現(xiàn)的肝、膽損傷，依據(jù)其臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)、血清學(xué)及病理組織學(xué)特征，可分為以肝細(xì)胞損傷為主的自身免疫性肝炎［1］(autoimmunehepatitis,AIH)和以膽道系統(tǒng)損傷為主和膽汁淤積為主的原發(fā)性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis,PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎［?(primarysclerosingcholangitis,PBC),上述3種疾病中任意兩種的重疊綜合征(overlapsyndromes,OLS)。以上病變均可引起嚴(yán)重的肝臟損傷，并可進(jìn)展為肝硬化。以往認(rèn)為自身免疫性肝病比較少見,發(fā)病率較低,隨著實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)的發(fā)展和國內(nèi)肝病學(xué)術(shù)界對AILD臨床經(jīng)驗(yàn)的積累，近年來在我國人群中發(fā)現(xiàn)此類患者迅速增多。在治療上，多以糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑為主，輔以熊去氧膽酸治療,可以緩解病情，控制癥狀，改善肝功能，延緩肝硬化進(jìn)程，延長生存期，但是此類藥物易引起骨質(zhì)疏松、機(jī)會感染、惡性腫瘤等［3］，患者依從性差，病情反復(fù)發(fā)作，治療上缺乏有效的治療靶點(diǎn)，仍然不能治愈，而肝移植是藥物等治療無效、病情進(jìn)展為肝硬化后的一種有效治療手段。目前，原位肝移植存在的問題是供肝來源缺乏、創(chuàng)傷大，且存在排斥反應(yīng)和后續(xù)免疫抑制治療等問題，不能廣泛開展［4］。因此，自身免疫性肝病的治療仍然任重而道遠(yuǎn)，需要探索新的治療方法。MSCs是一類主要來源于成人骨髓、脂肪及胎盤、臍帶等組織，具有遺傳背景穩(wěn)定和強(qiáng)大的增殖能力、多向分化潛能，可在體外擴(kuò)增的非造血組織干細(xì)胞［5-7］，并且具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能［8］。在體內(nèi)外均可抑制T淋巴細(xì)胞的活化、增殖［9］并用于多種疾病的治療如MSCs移植治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡［io】、糖尿?。踚n及多種肝?。?2,13］，均取得了較好的治療效果。因此，本I-II期臨床試驗(yàn)通過外周靜脈輸注方式對7例自身免疫性肝病患者進(jìn)行UC-MSCs治療，觀察移植治療過程中及治療后的安全性，并隨訪移植后的治療效果，為臨床AILD的免疫調(diào)控治療提供依據(jù)。對象與方法1、一般資料2009年6月至2011年5月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝病科接受UC-MSCs移植治療的7例AILD患者，男性2例，女性5例，中位年齡57（53-68）歲。其中AIH2例，PBC1例，PSC3例，OLS1例。AIH的診斷參照美國肝病學(xué)會（AASLD）推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)⑴。PBS和PSC的診斷參照AASLD推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)Ml。所有7例AILD患者均為慢性起病，有不同程度的乏力、食欲不振、皮膚瘙癢、尿色深黃及肝區(qū)不適等臨床表現(xiàn)。診斷至UC-MSCs移植中位時(shí)間8.6（2-65）月，7例患者行UC-MSCs移植治療次數(shù)均為2次。兩次治療間隔平均為1個(gè)月。本治療方案獲得蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，在進(jìn)行本研究前，所有患者均簽署知情同意書，50天內(nèi)沒有使用過血制品。2、方法（1） 主要試劑uc-mscs的制作過程（參見英文文獻(xiàn)，主要是1mprovementofliverfunctioninlivercirrhosispatientsafterautologousmesenchymalstemcellinjection?phasel-llclinicaltrial。人AFP、IFN-y、IL-4和IL-10ELISA試劑盒購自美國RB公司。全自動生化分析儀為美國雅培Aeroset。腹部彩色多普勒超聲檢查儀為荷蘭飛利浦iu22。（2） 治療方法治療前準(zhǔn)備包括患者血清肝功能、腎功能及AFP、PT等常規(guī)檢查；腹部彩色多普勒及AFP排除原發(fā)性肝癌。進(jìn)行細(xì)胞移植治療前靜脈推注5mg地塞米松預(yù)防過敏反應(yīng)。所有7例患者均采用外周靜脈輸注UC-MSCs，數(shù)量為8X107個(gè)/次，滴速為100d/min。UC-MSCs移植治療后患者其他治療藥物基本一致。（3） 觀察與隨訪觀察患者細(xì)胞移植時(shí)有無畏寒、惡心嘔吐、發(fā)熱、皮疹及有無其他過敏癥狀；觀察治療后患者食欲、乏力、皮膚瘙癢、肝區(qū)不適、腹脹腹痛情況有無好轉(zhuǎn)；每3月檢查肝功能、腎功能、血常規(guī)、腹部超聲和AFP、IFN-y和IL-4檢查。所有患者隨訪至UC-MSCs移植后24個(gè)月。（4） 治療緩解標(biāo)準(zhǔn)1）癥狀減輕或消失；2）TBIL、血清球蛋白水平正常；3）ALT正?；蛐∮谡Ｖ瞪舷?倍。具有上述2項(xiàng)可作為住院期間緩解的標(biāo)準(zhǔn)。（5） 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件作統(tǒng)計(jì)分析及GraphPadPrism5繪圖。結(jié)果用中位數(shù)、百分比（％）或7±SD表示，兩組比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，PV0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果（1） UC-MSCs移植過程的安全性7例患者經(jīng)周圍靜脈移植UC-MSCs均獲得成功，成功率為100%。術(shù)中未發(fā)生輸液管道阻塞，所有患者在細(xì)胞移植過程中無栓塞癥狀。術(shù)中患者均無畏寒發(fā)熱、惡心嘔吐、皮疹及其他過敏癥狀等不良反應(yīng)。術(shù)后隨訪未見血常規(guī)、腎功能明顯異常，未發(fā)生與UC-MSCs移植相關(guān)的嚴(yán)重并發(fā)癥。（2） UC-MSCs移植后患者一般情況截止隨訪24個(gè)月，所有7例患者中，有1例于隨訪10個(gè)月時(shí)失訪，予以剔除，其余6例均達(dá)到緩解標(biāo)準(zhǔn)，所有完成隨訪的6例患者臨床特征見表1?；颊吲R床癥狀好轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為乏力、黃疸、腹脹、皮膚瘙癢等減輕，食欲增加。與治療前相比，UC-MSCs治療后ALB增加，ALT和AST明顯降低（PV0.05）；但在治療前TBIL、ALP和GGT與治療后相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。表1完成隨訪6例患者臨床資料PatientCharacteristics123456SexFemaleMaleFemaleFemaleMaleFemaleAge(years)655357636855EtiologyAIHPSCAIHPSCPBCOLSJaundiceYesYesYesYesYesYesAbdominalpainNoYesNoYesNoNoAscitesNoNoNoNoYesYesCirrhosisNoYesYesNoYesYesSplenomegalyNoYesYesNoYesYesHistoryofencephalopathyNoNoNoNoYesYesAFPNormalNormalNormalNormalNormalNormal表2AILD患者治療前后肝功能變化時(shí)間ALB(g/L)ALT(U/L)AST(U/L)TBIL(“mol/LALP(U/L)GGT(U/L)治療前33.51±5.3269.95±47.9665.71±43.6451.81±57.01204.36±96.66369.76±518.18治療后38.85±6.98*39.65±18.87*35.52±17.24*32.62±19.42189.78±87.90705.87±243.98與治療前相比，*P<0.05（3） 安全性評估6例患者隨訪至24個(gè)月，監(jiān)測AFP、腹部彩色多普勒、腎功能及血常規(guī)，治療前后相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。所有6例患者均耐受了UC-MSCs移植治療，密切監(jiān)測患者高血壓、發(fā)熱及其他一切與移植有關(guān)的副作用，未見有不良反應(yīng)。彩色多普勒未發(fā)現(xiàn)患者肝臟有腫瘤跡象，患者血清AFP監(jiān)測未發(fā)現(xiàn)有異常升高。UC-MSCs移植治療后也未發(fā)現(xiàn)任一患者有肝性腦病等癥狀出現(xiàn)。（4） 血清細(xì)胞因子水平變化治療前6例患者的基線IFN-Y分別為219.34pg/ml、192.73pg/ml、172.67pg/ml、200.72pg/ml、163.72pg/ml和139.30pg/ml；治療24個(gè)月后IFN-Y分別為159.32pg/ml、167.65pg/ml、158.25pg/ml、148.89pg/ml、139.61pg/ml和116.82pg/ml，治療前后患者IFN-Y呈下降趨勢，治療前后相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0368）（圖1）；治療前6例患者的基線IL-4分別為；29.31pg/ml、37.79pg/ml、42.29pg/ml、52.65pg/ml、33.28pg/ml和55.23pg/ml；治療24個(gè)月后IL-4分別為43.89pg/ml、55.56pg/ml、50.42pg/ml、69.99pg/ml、48.48pg/ml和65.78pg/ml，治療前后患者IL-4呈升高趨勢，治療前后相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）P=0.0418）（圖2）。250nl)mp=0.0368150-100PretreatmentAt24monthsPretreatmentAt24PretreatmentAt24months圖1UC-MSCs移植治療前后患者血清IFN-Y變化圖2UC-MSCs移植治療前后患者血清IL-4變化討論目前，對于AILD的治療仍局限于藥物，但藥物治療存在療效差，副作用大及病情容易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。對于進(jìn)展至肝硬化等終末期病變，原位肝移植是標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，其1年生存率為85-90%[15]。由于原位肝移植存在供肝來源缺乏、長期的后續(xù)治療、費(fèi)用大等問題，因此，必須尋找不具有上述缺點(diǎn)的新的治療方案。近年來，細(xì)胞替代治療研究成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。MSCs的臨床應(yīng)用越來越

受到重視，但對于如何尋找理想的MSCs仍是困擾醫(yī)學(xué)家的一個(gè)難題。臍帶是胎兒的附屬物，具有提取方便，相對純凈，來源廣泛，致瘤性及病毒、微生物污染的可能性低的特點(diǎn)，從中分離出的基質(zhì)細(xì)胞具有一般MSCs的生物學(xué)特性，且在臨床應(yīng)用上避免了胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)問題，有望成為臨床治療中的理想種子細(xì)胞。UC-MSCs是來源于臍帶的一類具有自我更新、多向分化的潛能以及免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞群體a】，與骨髓MSCs相比具有更強(qiáng)的增殖分化潛能；較為幼稚，是一群更原始的MSCs群；多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性。因此，UC-MSCs具有更廣闊的應(yīng)用前景。我們在取得患者及其家屬知情同意后，對7例AILD患者通過外周靜脈輸注的方式進(jìn)行了UC-MSCs的移植治療。截止24個(gè)月隨訪結(jié)束，UC-MSCs移植治療能有效改善患者的癥狀，其臨床表現(xiàn)得到明顯好轉(zhuǎn)，包括精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)、食欲增加、睡眠改善、肝區(qū)不適及疲勞感減輕，無明顯腹痛、腹脹減輕。通過治療前后患者肝功能比較發(fā)現(xiàn)，ALT、AST降低，而ALB明顯上升，表明患者的肝功能得到改善。而UC-MSCs移植治療前后患者TBIL、ALP和GGT數(shù)值雖然有變化，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能因?yàn)锳ILD患者存在不同程度的膽汁淤積，毛細(xì)膽管淤膽，膽汁排泄有部分障礙，從另一個(gè)角度看，也不排除由于樣本量太少，存在統(tǒng)計(jì)效率不高問題。分析UC-MSCs移植治療有效的原因可能在于UC-MSCs分泌如肝細(xì)胞生長因子、HLA-G5等［17］促進(jìn)了肝細(xì)胞的再生，更重要的是人類UC-MSCs分泌的SHLA-G5，并可抑制T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞活化、增殖，并可上調(diào)CD4+CD25highFOXP3+T細(xì)胞水平，MSCs可通過多種機(jī)制參與免疫耐受的誘導(dǎo)和維持。由于AILD患者體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞的過度活化、增殖，推測是UC-MSCs所分泌的這類細(xì)胞因子發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用，部分抑制了T細(xì)胞的功能，從而產(chǎn)生了較理想治療效果。從患者接受UC-MSCs移植治療過程中及治療前后血常規(guī)、腎功能、AFP及腹部超聲多普勒檢測情況看，隨訪24個(gè)月未見惡性腫瘤發(fā)生，提示UC-MSCs移植治療對人體各項(xiàng)指標(biāo)無不良影響，無明顯致癌作用。無論在治療過程中還是治療后都是安全的。本研究中，有1位患者失訪，已剔除。該患者細(xì)胞移植治療過程順利，在隨訪期間AFP指標(biāo)及腹部超聲多普勒也未見異常，考慮患者失訪與UC-MSCs移植無關(guān)。大量研究表明［18-22,MSCs可使T淋巴細(xì)胞內(nèi)各亞群比例發(fā)生變化：由Thl極化狀態(tài)向Th2漂移，Thl亞群數(shù)量明顯減少，其分泌的IL-2,IFN-等細(xì)胞因子含量明顯降低；而Th2亞群數(shù)量增多，其分泌的IL-4,IL-10等細(xì)胞因子含量明顯增加，從而可以消減免疫反應(yīng)的放大，抑制Thl細(xì)胞應(yīng)答，降低免疫活性T淋巴細(xì)胞的增殖，抑制許多炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還可以下調(diào)抗原及B7分子的表達(dá)，促使T細(xì)胞無能，誘導(dǎo)免疫耐受的形成。我們比較6例患者UC-MSCs移植治療前后血清IFN-Y和IL-4水平變化情況，發(fā)現(xiàn)在治療后24個(gè)月，所有患者均有不同程度的IFN-Y降低和IL-4升高，提示UC-MSCs可能誘導(dǎo)了體內(nèi)T淋巴細(xì)胞由Thl向Th2方向轉(zhuǎn)化，使得Th1/Th2細(xì)胞得以趨于平衡，糾正免疫紊亂，從而發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)控作用。綜上所述，通過外周靜脈輸注UC-MSCs移植治療AILD，可改善患者的癥狀，有效促進(jìn)患者肝功能的好轉(zhuǎn)，移植后無明顯的不良反應(yīng)，使患者體內(nèi)免疫紊亂得到部分糾正，而且這一治療過程操作簡便，安全可行。雖然UC-MSCs移植治療有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是尚存在許多問題需要進(jìn)一步探討，如細(xì)胞移植的數(shù)量、移植的時(shí)機(jī)及移植治療的次數(shù)、時(shí)機(jī)間隔等，這些問題尚需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步過程分析。參考文獻(xiàn)MannsMP,CzajaAJ,GorhamJD,etal.Diagnosisandmanagementofautoimmunehepatitis.Hepatology2010;51(6):1193-2213.VogelA,WedemeyerHP,MannsM,etal.Autoimmunehepatitisandoverlapsyndromes.JGastroenterolHepatol2002;17(31):389-398.CzajaAJ.Safetyissuesinthemanagementofautoimmunehepatitis.ExpertOpinDrugSaf2008;7(3):319-333.BatallerR,BrennerDA.Liverfibrosis.JClinInvest2005;115(2):209-218.YooJU，BarthelTS，NishimuraK，SolchagaL，CaplanAI，GoldbergVM，JohnstoneB.Thechondrogenicpotentialofhumanbone-marrow-derivedmesenehymalprogenitorcells.JBoneJointSurgAm1998;80(12):1745-1757.HaynesworthSE,GoshimaJ,GoldbergVM,CaplanAI.Characterizationofcellswithosteogenicpotentialfromhumanmarrow.Bone1992;13(1):81-88.JaiswalN,HaynesworthSE,CaplanAI,BruderSP.Osteogenicdifferentiationofpurified，culture-expandedhumanmesenchymalstemcellsinvitro.JCellBiochem1997;64(2):295-312.RingdenO,LeBlancK.Mesenchymalstemcellsfortreatmentofacuteandchronicgraft-versus-hostdisease,tissuetoxicityandhemorrhages.BestPractResClinHaematol2011;24(1):65-72.DiNicolaM,Carlo-StellaC,MagniM,etal.HumanbonemarrowstromalcellssuppressT-lymphocyteproliferationinducedbycellularornonspecificstimuli.Blood2002;99(10):3838-3843.SunL,WangD,LiangJ,etal.Umbilicalcordmesenchymalstemcelltransplantationinsevereandrefractorysystemiclupuserythematosus.ArthritisRheu2010;62(8):2467-75.VolarevicV,ArsenijevicN,LukicML,etal.Concisereview:Mesenchymalstemcelltreatmentofthecomplicationsofdiabetesmellitus.StemCells2011;29(1):5-10.ParekkadanB,vanPollD,SuganumaK,CarterEA,BerthiaumeF,etal.Mesenchymalstemcell-derivedmoleculesreversefulminanthepaticfailure.PLoSONE2007;2(9):e941.KharazihaP,HellstromPM,NoorinayerB,FarzanehF,etal.Improvementofliverfunctioninlivercirrhosispatientsafterautologousmesenchymalstemcellinjection:aphaseI-IIclinicaltrail.EurJGastroenterolHepatol2009;21(10):1199-1205.ChazouilleresO,WendumD,SerfatyL,eta1.Primarybilliarycirrhosis-autoimmunehepatitisovedapsyndrome:clinicalfeaturesandresponsetotherapy.Hepatology1998;28(2):296-301.LeeLA.Advancesinhepatocytetransplantation:amythbecomesreality.JClinInvest2001;108:367-369.LuLL,LiuYJ,YangSG,ZhaoQJ,etal.Isolationandcharacterizationofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellswithhematopoiesis-supportivefunctionandotherpotentials.Haematologica2006;91(8):1017-1026.SelmaniZ,NajiA,ZidiI,FavierB,etal.Humanleukocyteantigen-G5secretionbyhumanmesenchymalstemcellsisrequiredtosuppressTlymphocyteandNaturalKillerfunctionandtoinduceCD4+CD25highFOXP3+RegulatoryTcells.StemCells2008;26(1):212-222.