新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第二版)

94型冠狀病毒感染的肺炎試驗室檢測技術指南〔其次版〕為指導各級疾控部門和其他相關機構開展型冠狀病毒感目前已經(jīng)比較成熟、易于實施的核酸檢測方法。一、標本采集〔一聚攏性病例患者，其他需要進展型冠狀病毒感染診斷或鑒別〔如溯源分析。(二)標本采集要求。從事型冠狀病毒檢測標本采集的技術人員應經(jīng)過生物〔培訓合格護裝備〔personalprotectiveequipment，PPE〕要求：N95口體液、分泌物或排泄物時，戴雙層乳膠手套。住院病例的標本由所在醫(yī)院醫(yī)護人員在當?shù)丶部貦C構專業(yè)人員指導下采集。親熱接觸者標本由當?shù)丶部貦C構負責采集。依據(jù)試驗室檢測工作的需要，可結合病程屢次采樣?！踩總€病例必需采集急性期呼吸道標本〔如支氣管或肺泡灌洗液等其他爭論材料依據(jù)設計需求采集。標本種類：上呼吸道標本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。下呼吸道標本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本。7集量5ml，以空腹血為佳，建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液。清應盡早〔最好在發(fā)病后7天內〕釆集，其次份血清應在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，以空腹血為佳，建議使用真空釆血管。〔四〕標本采集方法。2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部3ml采樣液沖洗收集器1〔亦可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集器。3ml采樣液的50ml螺口塑料管中。支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入〔約30cm深處5ml頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次〔亦可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集。6．肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經(jīng)過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管30~50ml，總量100~250ml，不應超過300ml。血液標本：建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2023rpm離心10集血漿和血液中細胞于無菌螺口塑料管中。血清標本：用真空負壓采血管采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2023rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。其他材料：依據(jù)設計需求標準采集?！参鍢吮静杉笤谏锇踩壴囼炇疑锇踩駜确盅b。全部標本應放在大小適合的帶螺旋蓋內有墊圈、耐冷凍樣日期。將密閉后的標本放入大小適宜的塑料袋內密封，每袋裝一份標本?！擦糜诓《痉謩e和核酸檢測的標本應盡快進展檢測，能在24小時內檢測的標本可置于4℃保存；24小時內無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存〔如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存。血清可在4℃存放3天，-20℃以下可長期復凍融?！财唛L途運輸標本，建議承受干冰等制冷方式進展保藏?！彩桌龣z測結果陽性、疑似聚攏性病例及聚攏性病例的標本，上送中國疾病預防把握中心病毒病預防把握所進展檢測復核，并附樣本送檢表〔見附件。病原體及標本運輸國內運輸型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應的聯(lián)合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284PI602分類包裝要求；環(huán)境樣本屬于B類，對應的聯(lián)合國編號為UN3373，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危急品航空安全運輸技術細則》的PI650分類包裝要求；通過其他交通工具運輸?shù)目蓞⒄找陨蠘藴拾b。型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性材料運輸應依據(jù)《可〔毒種或樣本運輸治理規(guī)定》〔原衛(wèi)生部令第45號〕國際運輸相關國家和國際相關要求。二、型冠狀病毒的試驗室檢測RT-PCR鑒定。任何型冠狀病毒的檢測都必需在具備適當條件的試驗室由經(jīng)過相關技術安全培訓的人員進展操作。本指南中的核酸檢測方法主要針對型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1a/b〔openreadingframe1ab，ORF1ab〕〔nucleocapsidprotein，。在試驗室要確認一個病例為陽性，滿足以下條件：同一份標本中型冠狀病毒2〔ORF1abN〕特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。陰性結果也不能排解型冠狀病毒感染，需要排解可能產(chǎn)本；技術本身存在的緣由，如病毒變異、PCR抑制等。三、實時熒光RT-PCR方法檢測型冠狀病毒核酸〔一標準實時熒光RT-PCR方法檢測型冠狀病毒核酸的工作程序，保證明驗結果的正確牢靠?！捕m用于實時熒光RT-PCR方法檢測型冠狀病毒核酸?！踩陈氊?。檢測人員：負責依據(jù)本檢測細則對被檢樣本進展檢測。復核人員：負責對檢測操作是否標準以及檢測結果是否準確進展復核。部門負責人：負責對科室綜合治理和檢測報告的審核?！菜臉颖窘邮蘸皖A備。本應存放于-70℃冰箱保存。〔五〕檢測工程。型冠狀病毒核酸測定〔實時熒光RT-PCR方法〕推舉選用針對型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區(qū)域的引物和探針。靶標一〔ORF1ab：正向引物〔F：反向引物〔R：ACGATTGTGCATCAGCTGA熒光探針PHQ1-3”靶標二〔N：正向引物〔F：反向引物〔R：熒光探針〔P：5”-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3”核酸提取和實時熒光RT-PCR反響體系參考相關廠家試劑盒說明。結果推斷陰性：無Ct值或Ct值>40。陽性：Ct值<37，可報告為陽性?？梢桑篊t值在37-40Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本推斷為陽性，否則為陰性。四、病原生物安全試驗活動要求危害程度分類中其次類病原微生物進展治理，具體要求如下：〔一〕指病毒的分別、培育、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組試驗等操作。利用活病毒或其感染細胞〔或細胞提取物，不經(jīng)滅活進展上述操作應在具有開展相應活動資質的生物安全三級〔BiologicalSafetyLevel3,BSL-3〕試驗室進展。使用病毒培育物提取核酸時，裂解劑或滅活劑的參與必需在與病毒培育同等級別試驗室和防護條件下進展，牢靠方法滅活后的病毒培育物，可在BSL-2或BSL-1級試驗室操作?！捕虚_展相應活動資質的動物〔animal〕BSL-3〔ABSL-3〕試驗室進展操作?！踩唇?jīng)培育的感染性材料在承受牢靠的方法滅活前進展的病毒抗原檢測、血清學檢測、個人防護裝備參照生物安全三級試驗室的防護要求。未經(jīng)牢靠滅活或固定的人和動物組織標本因含病毒量較高，其操作的防護級別應比照病毒培育?！菜母腥拘圆牧匣蚧畈《驹诔惺芾慰康姆椒缁詈罂稍贐SL-1試驗室操作?！参逯羔槍Υ_認無感染性的材料的各種操作，包括但不限于無感染性的病毒DNA或cDNA操作，應在BSL-1試驗室進展。附件：型冠狀病毒檢測標本送檢表附件型冠狀病毒檢測