利用微生物集成技術(shù)生產(chǎn)生物菌肥

利用微生物集成技術(shù)生產(chǎn)生物菌肥

生物廢水處理系統(tǒng)中的生物和有機(jī)物質(zhì)集合是自然形成的。目前,我國大多數(shù)污水處理廠都采用生物法處理污水?；钚晕勰嘀形⑸镌趦艋鬯耐瑫r(shí)自身也在繁殖增長,必須定期少量排出,以維持污水處理系統(tǒng)中氧的供給。排出的這些剩余活性污泥必須加以治理。目前的處理方法無法滿足環(huán)保和連續(xù)處理的需要,剩余活性污泥的資源化利用勢在必行。1974年,Wallen首先從活性污泥中獲得了聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate,PHA),為利用活性污泥生產(chǎn)PHA奠定了基礎(chǔ)。PHA是許多微生物在不平衡生長環(huán)境條件下(如氮、磷等缺乏時(shí))合成的胞內(nèi)碳源或能源儲存物質(zhì),具有良好的生物降解性、生物相容性等,可廣泛應(yīng)用于包裝、藥物緩釋、組織工程材料等領(lǐng)域?；钚晕勰嗌a(chǎn)PHA包括3個步驟,即馴化、發(fā)酵和產(chǎn)物抽提。馴化是對活性污泥中PHA合成菌選擇性的富集階段,使用營養(yǎng)過剩與饑餓(Feast/Famine)交替進(jìn)行的馴化方式,其選擇壓力來自于微生物對饑餓的耐受程度。經(jīng)過一定時(shí)間的馴化之后,便以活性污泥作為混合發(fā)酵菌種進(jìn)行PHA的發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束,進(jìn)行產(chǎn)物抽提以獲得PHA。PHA的抽提方法主要包括兩類:有機(jī)溶劑直接溶出PHA,化學(xué)藥劑溶解菌體非PHA部分以得到PHA。另一方面,生產(chǎn)PHA后的污泥必須妥善處理。目前,多采用土地利用的處置方法。污泥中高含量的有機(jī)物能夠?yàn)檗r(nóng)作物提供營養(yǎng)。然而,污泥中高含量的有毒重金屬大大限制了剩余污泥的土地應(yīng)用。去除剩余活性污泥中的重金屬已成為污泥處置技術(shù)中的瓶頸問題。目前,通常使用化學(xué)法去除污泥中的重金屬,如氯化、離子交換、絡(luò)合和酸化等。但是化學(xué)法具有成本高、操作困難、耗能量高等缺點(diǎn)。相比之下,生物淋濾法具有低成本、操作簡單、耗能低、金屬去除率高且副產(chǎn)物無毒等優(yōu)點(diǎn)。生物淋濾法(Bioleaching)是指利用自然界中一些微生物的直接作用或其代謝產(chǎn)物的間接作用,氧化、還原、絡(luò)合、吸附或溶解,將固相中某些不溶性成分(如重金屬、硫及其它金屬)分離浸提出來的技術(shù)。在生物淋濾中,嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans,A.f)和嗜酸性氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillusthiooxidans,A.t)被用作有效的淋濾載體。這2種嗜酸性的化能自養(yǎng)型細(xì)菌以大氣中的CO2為碳源,以無機(jī)物鐵或硫?yàn)槟茉磥砭S持生長。另外,由于pH值很低,抑制了其它細(xì)菌的生長,所以在實(shí)際的操作過程中不需要嚴(yán)格的無菌條件,適宜于污水處理廠的開放處理系統(tǒng)。生物淋濾后的活性污泥中含有較豐富的氮、磷、鉀等多種微量元素和有機(jī)質(zhì),適宜農(nóng)田施放。但以植酸態(tài)等有機(jī)形式存在的磷元素和以硅酸鹽礦物存在的鉀元素都不能直接被植物吸收利用。因此,需要細(xì)菌的解磷解鉀作用。解磷菌在生長繁殖過程中可以產(chǎn)生一些有機(jī)酸和酶類,促進(jìn)難溶性磷酸鹽降解,常見屬種為芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacterspp.)等。解鉀菌主要為膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)和環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans),能分解硅酸鹽類礦物并釋放出可溶性鉀等元素。綜合以上理論,筆者設(shè)計(jì)了一套剩余活性污泥完全資源化利用的方案,首先針對取自天津2個污水處理廠反應(yīng)池中的活性污泥,使用厭氧-好氧和好氧-沉淀馴化方式生產(chǎn)PHA,研究了土著PHA合成菌回注法對PHA產(chǎn)量的影響。然后使用生產(chǎn)PHA所剩余的污泥進(jìn)行生物淋濾以去除污泥中重金屬,并對淋濾后污泥的致病性進(jìn)行了檢測。最后利用解磷菌和解鉀菌以混菌方式對污泥進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物菌肥。1材料和設(shè)備1.1好氧池污泥樣品采用了3種剩余活性污泥樣品:樣品A取自天津泰達(dá)污水處理廠好氧池污泥,樣品B取自天津東麗區(qū)污水處理廠二沉池污泥,樣品C取自天津大港污水處理廠厭氧消解后剩余污泥。1.2nk-16和嗜酸性氧化硫硫桿菌nk-06土著PHA合成菌為本實(shí)驗(yàn)室采用尼爾紅熒光染色法從污泥樣品中分離得到的NK-T1、NK-J1和NK-D1。生物淋濾所用菌株為本實(shí)驗(yàn)室從污泥樣品中富集并分離得到的嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans,A.f)NK-16和嗜酸性氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillusthiooxidans,A.t)NK-06。固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物菌肥所用菌株為本實(shí)驗(yàn)室從農(nóng)田土壤中富集并分離得到的具有解磷作用的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XF-8和具有解鉀作用的膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)NK102(中國典型培養(yǎng)物保藏中心編號分別為CCTCCM2010182和CCTCCM2010268)。1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備活性污泥馴化裝置采用有效體積為1000L的SBR反應(yīng)裝置。2實(shí)驗(yàn)方法2.1通過合成山羊pha苗生產(chǎn)500mlpha2.1.1好氧-沉淀發(fā)酵pha馴化液成分(g/L):葡萄糖0.263,MgSO40.089,(NH4)2SO40.072,CaCl20.017,KCl0.070,K2HPO40.060,蛋白胨0.100,酵母0.033,pH7.0,不滅菌直接使用。在500L馴化液中加入離心濕泥25g/L,進(jìn)行厭氧-好氧馴化?？刂品绞綖?厭氧2h,好氧4h,沉淀1.5h,排出50%體積上清和加入等量馴化液0.5h。每個循環(huán)8h,馴化10d,好氧階段通氣量1.5L/min。馴化結(jié)束后,加入發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行好氧發(fā)酵48h。發(fā)酵培養(yǎng)液成分(g/L):葡萄糖8.33,MgSO40.20,CaCl20.04,K2HPO40.06,微量元素1.0mL/L,不滅菌直接使用。8000×g離心收集固形物,進(jìn)行PHA的提取。2.1.2好氧-沉淀馴化及發(fā)酵試驗(yàn):馴化液成分(g/L):CH3COONa4.00,MgSO40.600,NH4Cl0.160,EDTA0.100,CaCl20.053,K2HPO40.121,KH2PO40.045,不滅菌直接使用。在500L馴化液中加入離心濕泥25g/L,進(jìn)行好氧-沉淀馴化?？刂品绞綖?好氧10.5h,沉淀1h,排出50%體積上清和加入等量體積馴化液0.5h,每個循環(huán)12h,馴化10d,好氧階段通氣量1.5L/min。馴化結(jié)束后,加入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行好氧發(fā)酵,16h。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L):CH3COONa8.00,MgSO40.600,NH4Cl0.113,EDTA0.100,CaCl20.053,K2HPO40.121,KH2PO40.045,微量元素1.0mL/L,不滅菌直接使用。8000×g離心收集固形物,進(jìn)行PHA的提取。2.1.3pha的提取將-70°C保藏的土著PHA合成菌在LB固體平板上活化培養(yǎng),單菌落接種于含LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,150r/min振蕩培養(yǎng)12h,離心收集菌體。按0.10-0.25g/L濕菌體于馴化開始前加入至相應(yīng)的污泥馴化裝置中,進(jìn)行上述的馴化、發(fā)酵和PHA抽提。2.1.4PHA的提取:發(fā)酵液8000×g離心15min,收集沉淀,干燥,加至350mL氯仿中,室溫?cái)嚢?8h,過濾,濃縮,加入40倍體積的甲醇中,所得白色沉淀即為PHA。收集PHA,以甲醇沖洗,重溶于氯仿中,重復(fù)上述操作。最后真空干燥至恒重,所得PHA重量與揮發(fā)性懸浮固體量(VSS)之比即為PHA的產(chǎn)率。2.1.5pha合成菌對馴化液進(jìn)行梯度稀釋,采用培養(yǎng)皿菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行總菌數(shù)計(jì)數(shù);采用Nile-Red熒光染色法計(jì)數(shù)PHA合成菌;按照標(biāo)準(zhǔn)檢測方法(APHA,2001)檢測馴化液總懸浮固體量(TSS)和揮發(fā)性懸浮固體量(VSS);采用核磁共振(1HNMR和13CNMR)及傅麗葉紅外光譜(FT-IR)對PHA成分與結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測分析。2.2生物濾過2.2.1a.f和a.t混合菌液的接種見表3500mL三角瓶中含有200mL淋濾初始液,其成分為(g/L):(NH4)2SO43.0,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O2.5,KCl0.1,Ca(NO3)2·4H2O0.006,S10.0,FeSO4·7H2O44.0。另外,A.f和A.t混合菌液按5%+5%(V/V)接種于含有5%(W/V)脫水污泥的200mL淋濾液中。對照組中不加菌液,只含有5%(W/V)脫水污泥和200mL蒸餾水。3個試驗(yàn)組和1個對照組各重復(fù)3次。30°C、150r/min進(jìn)行6d。2.2.2屬去除率的測定重金屬含量測定采用原子吸收分光光度法(AAS)。重金屬去除率計(jì)算公式:重金屬去除率=(淋濾前重金屬含量-淋濾后重金屬含量)/淋濾前重金屬含量。資源化處理后污泥的安全性分析,參照《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)(GB18918-2002)》中穩(wěn)定化處理后的指標(biāo),對蠕蟲卵死亡率和糞大腸菌群菌值進(jìn)行了檢測。2.3芽孢桿菌的培養(yǎng)解磷菌XF-8接種于LB培養(yǎng)基,解鉀菌NK102接種于活化培養(yǎng)基解磷菌,30°C、150r/min培養(yǎng)24-48h?；罨囵B(yǎng)基成分(g/L):蔗糖10.0,K2HPO42.0,NaCl0.2,MgSO4·7H2O0.5,(NH4)2SO41.0,酵母粉1.0,FeCl30.005,CaCO30.1,pH7.0-7.5。取本實(shí)驗(yàn)室以生物淋濾去除重金屬的活性污泥,8000r/min離心10min,去上清,取1000g污泥,1×105Pa滅菌20min。加入30%的麥麩,混勻,分別接入5%枯草芽孢桿菌XF-8和5%的膠質(zhì)芽孢桿菌NK102,30°C發(fā)酵3d。發(fā)酵過程中,定時(shí)補(bǔ)充水分,既保持其水分,又不影響其透氣性。每隔一段時(shí)間取1g發(fā)酵物,置于9mL無菌水中,振蕩均勻,稀釋合適梯度,涂布平板計(jì)數(shù)。3結(jié)果與討論3.1pha的合成3.1.1回注組的水平經(jīng)過10d的馴化,活性污泥已適合PHA的發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)過產(chǎn)物抽提,2種污泥樣品的PHA產(chǎn)量如表1所示。2種馴化方法得到的PHA產(chǎn)率分別為17.56%和20.31%,好氧-沉淀工藝明顯優(yōu)于厭氧-好氧工藝,是更適合剩余活性污泥生產(chǎn)PHA的工藝。同時(shí),中試的回注試驗(yàn)結(jié)果基本達(dá)到之前本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模回注試驗(yàn)的水平,且比對照組提高了25.6%和30.2%。回注組產(chǎn)率大于非回注組,表明回注少量土著PHA合成菌,能加強(qiáng)污泥中的PHA合成菌群,使它們爭奪到更多底物;在提高底物利用率的同時(shí),也使其它非PHA合成菌更快地被選擇壓力所淘汰。如圖1所示,污泥A和B中的總菌數(shù)維持在穩(wěn)定的水平,而PHA合成菌隨著馴化的進(jìn)行而增多,結(jié)束馴化時(shí)PHA合成菌分別增多了11.22%和6.95%。3.1.2活性污泥合成的PHA的結(jié)構(gòu)分析:綜合分析FT-IR、1H-NMR和13C-NMR的結(jié)果,推斷此PHA的主要成分為3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物[Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyralerate,P(3HB-co-3HV)],其結(jié)構(gòu)見圖2。但還有少量的其它類型PHA存在,因?yàn)榛钚晕勰酁橐粋€混合的PHA合成菌群,其中還有一些合成其它類型PHA的合成菌,但由于數(shù)量較少,合成產(chǎn)物含量較低,因此未形成明顯的特征峰,圖譜中幾個較小的雜峰可能是由此產(chǎn)生的。3.2生物濾過3.2.1回汁添加量選擇3種剩余活性污泥經(jīng)過6d的生物淋濾,各種重金屬的去除效果見表2。污泥中Cu、Zn、Pb、Cd、Cr、Ni和As都有較高的去除率,且淋濾后污泥中重金屬含量均符合國家《食用農(nóng)產(chǎn)品土壤環(huán)境質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(2006)》,適合土地施放。3.2.2監(jiān)測指標(biāo)檢測資源化處理后污泥的安全性分析,參照國標(biāo)《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)(GB18918-2002)》中穩(wěn)定化處理后的指標(biāo),對蠕蟲卵死亡率和糞大腸菌群菌值進(jìn)行了檢測。其蠕蟲卵死亡率和糞大腸菌群菌值達(dá)到國家城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)。3.3活菌和芽孢的計(jì)數(shù)結(jié)果接種去除重金屬的活性污泥后,置于30°C固態(tài)發(fā)酵。每隔一段時(shí)間取樣,通過稀釋梯度平板法計(jì)算活菌和芽孢的數(shù)量。由圖3可以看出,當(dāng)發(fā)酵達(dá)到72h時(shí),細(xì)胞數(shù)和芽孢的數(shù)量均達(dá)到最大,細(xì)胞數(shù)最大可以達(dá)到9.9×109個/g,芽孢數(shù)達(dá)到0.38×108個/g。符合《復(fù)合微生物肥料(NY/T798-2004)》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn),適合農(nóng)田施放。4生物淋濾和生物菌肥發(fā)酵利用利用活性污泥進(jìn)行PHA的生產(chǎn),經(jīng)短期馴化兩種剩余活性污泥樣品500L的中試結(jié)果為,PHA的產(chǎn)率基本達(dá)到本實(shí)驗(yàn)室之前小試的水平,且回注組高于對照組,好氧-沉淀的馴化方式優(yōu)于厭氧-好氧方式。經(jīng)過A.f和A.t混合菌群的生物淋濾,3種污泥樣品中Cu、Zn、Pb、Cd、Cr、Ni和As等重金屬