cd4、cd8、cd20、cd68及mhc-在強(qiáng)直性脊柱炎豎脊肌中的表達(dá)

cd4、cd8、cd20、cd68及mhc-在強(qiáng)直性脊柱炎豎脊肌中的表達(dá)

強(qiáng)直性脊柱炎（as）是一種以軸關(guān)節(jié)慢性炎癥為主的結(jié)構(gòu)疾病。在中國(guó)，發(fā)病率為0.3%，致殘率為43.4%。大約10%的患者出現(xiàn)嚴(yán)重障礙，嚴(yán)重影響了他們的生活質(zhì)量。由于AS以骶髂關(guān)節(jié)炎癥為早期表現(xiàn),長(zhǎng)期以來人們僅關(guān)注于AS患者骶髂關(guān)節(jié)及脊柱方面的研究,而忽略了該病椎旁肌的改變。然而,臨床醫(yī)生在檢查患者時(shí),常發(fā)現(xiàn)早期的AS患者有椎旁肌失去彈性、變硬、僵直等變化。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):AS的肌纖維中存在輕度單核細(xì)胞及脂肪浸潤(rùn)等病理改變,但他們均未涉及該病的肌肉免疫組織化學(xué)研究。在國(guó)內(nèi)還未見到對(duì)AS患者椎旁肌病理的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為此,本研究通過對(duì)AS患者豎脊肌進(jìn)行常規(guī)HE和各種炎性標(biāo)記物(CD4、CD8、CD20、CD68及MHC-Ⅰ)的免疫組化染色,來探討CD4、CD8、CD20、CD68及MHC-Ⅰ在AS(AS組)患者豎脊肌中的表達(dá)情況,以及AS豎脊肌中是否存在炎性改變。1材料和方法1.1性別、年齡及體外診斷選取2010年10月至2011年9月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院、中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院及廣州市正骨醫(yī)院門診和住院的不同疾病患者30例。其中AS10例,男8例,女2例,年齡20~28歲;多發(fā)性肌炎(PM,PM組)10例,男3例,女7例,年齡42~50歲;腰椎間盤突出癥(LIDP,LIDP組)10例,男7例,女3例,年齡51~60歲。前2組均符合AS和PM的診斷標(biāo)準(zhǔn);LIDP組均以CT、MRI檢查診斷為L(zhǎng)IDP者,并簽署肌肉活檢同意書。AS組患者行腰部豎脊肌進(jìn)行活檢,PM組患者行肱二頭肌進(jìn)行活檢,LIDP組患者在手術(shù)中取腰部豎脊肌進(jìn)行活檢。1.2pcr檢測(cè)兔抗人多克隆抗體mhc-鼠抗人單克隆抗體CD4、CD8、CD20和CD68均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,ABC復(fù)合物、DAB濃縮液(濃度為1∶20)為該公司統(tǒng)一試劑盒;兔抗人多克隆抗體MHC-Ⅰ購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司,濃度為1∶500。冰凍切片機(jī)(Germany,LeicaCM1850-1-1型);標(biāo)本貯存低溫冰箱(USAULT1786-4-V41型);攝影顯微鏡(NIKONPHASECONTRAST,北京中儀光科科技發(fā)展有限公司)。1.3抗cd4、cd8、cd20、cd65、mhc-將各組肌肉標(biāo)本行冰凍切片,每例標(biāo)本取1張切片行常規(guī)HE染色;5張行ABC法免疫組化染色,其處理方法是:冰丙酮固定5min,晾干后經(jīng)4%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶15min,正常山羊血清封閉30min后棄去血清,分別加入一抗CD4、CD8、CD20、CD68、MHC-Ⅰ,再放入4℃冰箱過夜。PBS液洗滌5min,滴加適量生物素化二抗工作液,常溫孵育30min,PBS洗滌5min;滴加ABC復(fù)合物30min,最后DAB顯色、蘇木精復(fù)染、封固。以LIDP組作為陰性對(duì)照組,以PM組作為陽性對(duì)照組。2位病理專家觀察所有染色切片,然后用圖像分析軟件和數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行比較。1.4陽性表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè)利用攝影顯微鏡,并固定光線強(qiáng)度,在每張免疫組化切片上隨機(jī)選取10個(gè)觀察視野,以10×20倍攝像,出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。CD4、CD8、MHC-Ⅰ陽性表達(dá)均位于細(xì)胞膜和炎性細(xì)胞表面,而CD68陽性表達(dá)則位于細(xì)胞漿中;陰性表達(dá)強(qiáng)度以LIDP組作標(biāo)準(zhǔn)。將每張切片的10個(gè)視野圖像運(yùn)用Imagepro-plus6.0圖像分析軟件處理:分別測(cè)量陽性表達(dá)區(qū)的Area(總面積)、MeanDensity(平均吸光度值),得到IOD值(總面積×平均吸光度值),因IOD指標(biāo)包含Density信息,故選取IOD值作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)代表陽性表達(dá)強(qiáng)度。然后計(jì)算每張切片的IOD值,最后綜合10張切片IOD結(jié)果,得出每種疾病對(duì)各抗體的IOD值。1.5cd8方差齊性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料用表示,對(duì)各組IOD值經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn):除CD8方差齊性,其余均不符合正態(tài)性分布。故利用非參數(shù)檢驗(yàn)-2Independent-SamplesTest,對(duì)AS和PM2組中CD4、CD8、CD68和MHC-Ⅰ的IOD值(陽性表達(dá)強(qiáng)度)進(jìn)行比較,以雙側(cè)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.13cd8、mhc-的iiid值與lidp、pm組比較3組中CD20均未見細(xì)胞著色(陰性),故對(duì)CD20染色不進(jìn)行比較分析。AS組CD4、CD8、MHC-Ⅰ的IOD值與LIDP組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);AS組CD8、MHC-Ⅰ的IOD與PM組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);PM組CD4、CD68的IOD均明顯高于AS組(均P<0.05)。見表1。2.2as對(duì)血管周圍蛋白表達(dá)的影響1)HE染色結(jié)果。AS組:AS肌肉中肌細(xì)胞大小不等,散在肌纖維內(nèi),細(xì)胞核增多內(nèi)移,在炎細(xì)胞浸潤(rùn)周圍出現(xiàn)局灶肌纖維壞死(封三圖1A);PM組:大面積炎細(xì)胞浸潤(rùn),多分布于血管周圍,肌細(xì)胞嚴(yán)重萎縮且大小不等(封三圖1B)。2)免疫組化結(jié)果。AS組:CD4、CD8呈弱陽性表達(dá),CD4強(qiáng)于CD8(封三圖1C—D)。CD4、CD68在局灶性炎性細(xì)胞及肌纖維化組織中有表達(dá),而周圍正常肌細(xì)胞未見陽性表達(dá)(封三圖1C、E)。CD68與MHC-Ⅰ呈強(qiáng)陽性表達(dá),MHC-Ⅰ在肌細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)陽性表達(dá);同時(shí)MHC-Ⅰ也在炎性細(xì)胞及其周圍血管內(nèi)膜出現(xiàn)陽性表達(dá)(封三圖1F);PM組:4種標(biāo)記物均有表達(dá)且呈強(qiáng)陽性表達(dá)(封三圖1G—J),對(duì)CD68染色陽性表達(dá)敏感較強(qiáng)(莘),見封三圖1I。3as肌肉中碳細(xì)胞的表達(dá)與單核細(xì)胞相關(guān)性研究AS是一種自身免疫性疾病,以骶髂關(guān)節(jié)、脊柱及椎間關(guān)節(jié)炎性改變?yōu)橹?臨床表現(xiàn)為患者腰痛和腰部活動(dòng)受限。對(duì)于早期椎旁肌出現(xiàn)變硬、失去彈性等改變,首先考慮到可能存在局部肌肉壞死的病理改變,R.G.Cooper等研究表明:AS患者椎旁肌存在脂肪浸潤(rùn),在AS進(jìn)展期,肌纖維內(nèi)出現(xiàn)核內(nèi)移改變。M.Waragai等研究發(fā)現(xiàn):AS患者的肱二頭肌存在輕度單核細(xì)胞浸潤(rùn),尤其在肌纖維膜附近的血管周圍。同時(shí)觀察到肌纖維大小不等、散在的再生肌纖維等一系列改變。兩位學(xué)者的研究結(jié)果并不相同,推測(cè)可能是由于AS的肌肉在病程的不同階段存在不同的病理改變所致。但均未見到對(duì)肌纖維壞死跡象的報(bào)道。本研究旨在對(duì)AS的豎脊肌進(jìn)行各種病理研究,觀察AS患者豎脊肌是否存在與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道相同的病理改變,觀察是否出現(xiàn)肌纖維壞死的改變,并探討哪些炎性細(xì)胞在病變中發(fā)揮作用。在肌肉炎性病理改變中,PM最為常見,它是橫紋肌非化膿性炎性肌病,屬于自身免疫性疾病,發(fā)病與病毒感染、免疫異常、遺傳及腫瘤等因素有關(guān),主要是因?yàn)榧∪獗涣馨图?xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致,AS和PM在肌肉炎癥方面有許多相似之處。J.Zamecnik等研究表明:PM的肌肉標(biāo)本中CD8+T細(xì)胞、CD68+單核細(xì)胞都有表達(dá),CD4+有散在的表達(dá),HLA-I在再生的肌細(xì)胞胞漿中有表達(dá)。同時(shí),HS.Barbasso等對(duì)非特異性肌炎病研究發(fā)現(xiàn):MHC-Ⅰ的表達(dá)與肌炎中單核細(xì)胞浸潤(rùn)有相關(guān)性。H.Appel等對(duì)AS相關(guān)的病理研究顯示:在AS活動(dòng)期,患者椎間關(guān)節(jié)中CD4、CD8細(xì)胞明顯高于非活動(dòng)期,而CD68表達(dá)水平則兩者相似,故在本研究中利用PM的肌肉作為陽性對(duì)照組。由于條件限制,對(duì)正常青年人體進(jìn)行肌肉活檢幾乎無法實(shí)現(xiàn),盡管LIDP患者年齡均較AS患者年齡偏大,但有研究表明:椎間盤突出癥患者的椎旁肌中未出現(xiàn)特征性的病理改變,故可利用LIDP患者的豎脊肌作為該試驗(yàn)的陰性對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn):AS肌肉中肌細(xì)胞大小不等,散在的肌纖維內(nèi)細(xì)胞核增多內(nèi)移(中心核),肌細(xì)胞纖維化;同時(shí),在炎細(xì)胞浸潤(rùn)周圍出現(xiàn)局灶肌纖維壞死——淡染細(xì)胞(封三圖1A),這些炎細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)和壞死灶附近的肌細(xì)胞膜、炎性細(xì)胞表面均對(duì)CD4、CD68和MHC-Ⅰ呈陽性表達(dá)(荻,與PM組對(duì)照,封三圖1C、E、F),而其他正常細(xì)胞區(qū)域未見陽性表達(dá)。提示AS的豎脊肌中的確存在局部壞死灶,并且壞死與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有密切關(guān)系。與LIDP組對(duì)比,這些壞死區(qū)域的CD8細(xì)胞表達(dá)呈弱陽性(+,封三圖1D);但與PM組相比,AS組CD8細(xì)胞的陽性表達(dá)強(qiáng)度差別不大。PM組HE染色顯示:肌纖維組織間炎性浸潤(rùn)明顯,肌束大小不等、部分肌纖維萎縮,結(jié)締組織明顯增生(封三圖1B),CD4、CD8、CD68、MHC-Ⅰ染色均為陽性,其強(qiáng)度分別為(莘)、(荻)、(莘)、(荻),見封三圖1G-J。雖然,AS組與PM組的總體MHC-Ⅰ陽性表達(dá)強(qiáng)度無差異(P>0.05),但AS肌肉的MHC-Ⅰ陽性表達(dá)位于炎性浸潤(rùn)區(qū)周圍的肌細(xì)胞胞漿內(nèi),且呈強(qiáng)陽性(莘,封三圖1F),這提示AS的豎脊肌中的炎性細(xì)胞與MHC-Ⅰ類有很大相關(guān)性。本研究結(jié)果證實(shí)了以前的觀點(diǎn):AS的肌肉中存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)締組織增生等,但同時(shí)也觀察到肌肉中存在散在的壞死灶。通常CD68和MHC-Ⅰ均在單核-巨噬細(xì)胞中表達(dá),本研究結(jié)果顯示:CD68、MHC-Ⅰ在AS豎脊肌中也呈陽性表達(dá),故推測(cè)AS的肌肉炎性浸潤(rùn)可能與單核細(xì)胞有關(guān)。同時(shí)CD68還可表達(dá)在破骨細(xì)胞表面,這提示AS后期的骨化形成可能也與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。HLA-B27分子是MHC-Ⅰ類分子,在有核細(xì)胞表面均有表達(dá),在免疫系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)細(xì)胞之間相互識(shí)別和誘導(dǎo)免疫反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能。而MHC-Ⅰ和CD4+Th1細(xì)胞在Ⅳ型超敏反應(yīng)中起到重要作用,同時(shí)少量的CD8+CTL也輔助參與,這與本研究的結(jié)果相吻合。提示:在急性期的AS中,豎脊肌可能存在Ⅳ型超敏反應(yīng)。綜合上述,AS與PM的肌肉炎性浸潤(rùn)兩者不同,在PM中主要以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主,