蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析課件

第五章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析1學(xué)習(xí)交流PPT人體基因數(shù)目?jī)H比低等生物線蟲多兩倍。如此少的基因是如何創(chuàng)造出人體如此復(fù)雜的生命活動(dòng)？人體基因的主要功能是通過(guò)蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，蛋白質(zhì)扮演著構(gòu)筑生命大廈的主要角色。人體中大約有10萬(wàn)種蛋白質(zhì)。測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的意義2學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析方法X-射線晶體衍射法：85.3%核磁共振波譜：14.7%電鏡三維重構(gòu)、各種光譜技術(shù)、顯微技術(shù)和計(jì)算機(jī)模擬

3學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析過(guò)程4學(xué)習(xí)交流PPT5學(xué)習(xí)交流PPT1895年11月8日,德國(guó)物理學(xué)家，50歲的倫琴在自己的實(shí)驗(yàn)室中偶然發(fā)現(xiàn)一種從陰極射線管中輻射出的新型射線，由于對(duì)管子發(fā)出的“東西”性質(zhì)不確定，倫琴就把這種射線命名為“X射線”。圖片出處:倫琴實(shí)驗(yàn)室第一節(jié)X-射線衍射測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)6學(xué)習(xí)交流PPT人類第一張X光照片圖片出處:

倫琴妻子之手

7學(xué)習(xí)交流PPT1896年1月23日倫琴將這一重大發(fā)現(xiàn)在維爾茲堡物理醫(yī)學(xué)會(huì)上報(bào)告。Kolliker教授提議將該射線命名為“倫琴射線”,但倫琴卻說(shuō)：“我還沒有徹底解釋這種射線的發(fā)生現(xiàn)象，還是稱它為X射線最恰當(dāng)?！蓖た道隆惽?/p>

WilhelmConradR?ntgen8學(xué)習(xí)交流PPT1901年第一屆諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)評(píng)選時(shí)，29封推薦信中就有17封集中推薦他。倫琴最終獲得了第一次諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)金圖片出處

諾貝爾物理獎(jiǎng)獎(jiǎng)?wù)?學(xué)習(xí)交流PPTX射線本質(zhì)

X射線是一種短波長(zhǎng)(0.005～10nm)、高能量(2.5×105～1.2×102eV)的電磁波。它是原子內(nèi)層電子在高速運(yùn)動(dòng)電子流沖擊下，產(chǎn)生躍遷而發(fā)射的電磁輻射。10學(xué)習(xí)交流PPT一般由高速電子撞擊金屬產(chǎn)生。如圖所示，是一種產(chǎn)生X射線的真空管，K是發(fā)射電子的熱陰極，A是由鉬、鎢或銅等金屬制成的陽(yáng)極。兩極之間加有數(shù)萬(wàn)伏特的高電壓，使電子流加速，向陽(yáng)極A撞擊而產(chǎn)生X射線。A11學(xué)習(xí)交流PPTX射線衍射1912年MaxvonLaue發(fā)現(xiàn)X射線具有衍射的現(xiàn)象。（1914年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)）圖片出處:

12學(xué)習(xí)交流PPT勞厄的實(shí)驗(yàn)裝置

圖片出處:13學(xué)習(xí)交流PPTX-射線晶體結(jié)構(gòu)分析基本原理

X射線衍射分析所依賴的基本原理是X射線衍射現(xiàn)象

X射線衍射現(xiàn)象利用X射線的波長(zhǎng)和晶體中原子的大小及原子間距同數(shù)量級(jí)的特性來(lái)分析晶體結(jié)構(gòu)。當(dāng)X射線入射到樣品晶體分子上時(shí)，分子上的每個(gè)原子使X射線發(fā)生散射，這些散射波之間相互疊加形成衍射圖形。衍射圖形能給出樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的許多資料，如原子間的距離、鍵角，分子的立體結(jié)構(gòu)、絕對(duì)構(gòu)型、原子和分子的堆積、有序或無(wú)序的排列等。

14學(xué)習(xí)交流PPTX射線通過(guò)紅寶石晶體(a)和硅單晶體(b)所拍攝的勞厄斑圖片出處:

15學(xué)習(xí)交流PPT勞倫斯·布拉格(LawrenceBragg)亨利·布拉格(HenryBragg)因在用X射線研究晶體結(jié)構(gòu)方面所作出的杰出貢獻(xiàn),亨利·布拉格（WilliamHenryBragg）和勞倫斯·布拉格（WilliamLawrenceBragg）父子分享了1915年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。

圖片出處

圖片出處

16學(xué)習(xí)交流PPT20世紀(jì)60年代解析一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以獲得諾貝爾獎(jiǎng)；20世紀(jì)70年代解析一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則可成為轟動(dòng)世界的新聞；

20世紀(jì)80年代解析一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則可申請(qǐng)到教授的職位；20世紀(jì)90年代解析一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)通?？梢垣@得博士學(xué)位；今天，一個(gè)博士研究生也許就可解析多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但如果沒有深入研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，往往不能畢業(yè)。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的發(fā)展饒子和院士HIV基質(zhì)蛋白

SARS17學(xué)習(xí)交流PPTＸ射線衍射用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定1954年伯納爾(Bernal)獲得第一張胃蛋白酶晶體Ｘ衍射圖片。18學(xué)習(xí)交流PPT1957年肯特羅(Kendrew)完成肌紅蛋白的0.6nm分辨率的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)圖片出處:

圖片出處:

19學(xué)習(xí)交流PPT肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)

肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型圖片出處:圖片出處:

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archive/Kendrew62.html

20學(xué)習(xí)交流PPT1959年佩魯茨(Perute)完成血紅蛋白0.55分辨率的晶體結(jié)構(gòu)圖片出處:(1962)

21學(xué)習(xí)交流PPT血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)模型圖片出處

血紅蛋白分子就是由二個(gè)由141個(gè)氨基酸殘基組成的α亞基和二個(gè)由146個(gè)氨基酸殘基組成的β亞基按特定的接觸和排列組成的一個(gè)球狀蛋白質(zhì)分子，每個(gè)亞基中各有一個(gè)含亞鐵離子的血紅素輔基。四個(gè)亞基間靠氫鍵和八個(gè)鹽鍵維系著血紅蛋白分子嚴(yán)密的空間構(gòu)象。

22學(xué)習(xí)交流PPT由于測(cè)定出蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu),兩位英國(guó)科學(xué)家M.F.佩魯茨和J.C.肯德魯獲得1962年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。圖片出處：

23學(xué)習(xí)交流PPT1997年,核小體八組蛋白結(jié)構(gòu)2004年,菠菜捕光復(fù)合物L(fēng)HC-II24學(xué)習(xí)交流PPT2005年，線粒體膜蛋白復(fù)合物2精細(xì)結(jié)構(gòu)25學(xué)習(xí)交流PPTX射線衍射測(cè)定蛋白和核酸精細(xì)結(jié)構(gòu)，為新藥設(shè)計(jì)提供了全新方向中國(guó)科學(xué)家研制抗癌新藥首獲瑞典愛明諾夫獎(jiǎng)26學(xué)習(xí)交流PPT施一公抗癌抗乙肝病毒新藥Birinapant，進(jìn)入臨床二期27學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定程序

1、樣品制備

2、蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng)3、衍射數(shù)據(jù)收集和處理4、位相求解5、模型建立和修正28學(xué)習(xí)交流PPT1、樣品制備

大量表達(dá)、分離和純化目標(biāo)蛋白一般要求純度大于97%，濃度達(dá)到5mg/ml以上。29學(xué)習(xí)交流PPT2、蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng)蛋白質(zhì)結(jié)晶原理與小分子結(jié)晶一樣，蛋白質(zhì)在溶液中處于過(guò)飽和狀態(tài)時(shí)，分子間可以規(guī)則的方式堆積起來(lái)形成晶體析出30學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的影響因素物理因素：溫度、重力、壓力、震動(dòng)、時(shí)間、電場(chǎng)磁場(chǎng)、介質(zhì)的電解質(zhì)性質(zhì)和粘度、均相或非均相成核等化學(xué)因素：pH值、沉淀劑類型和濃度、添加劑、離子種類、離子強(qiáng)度、過(guò)飽和度、氧化還原環(huán)境、蛋白質(zhì)濃度等

生化因素：蛋白質(zhì)純度、配合體、抑制劑、化學(xué)修飾、遺傳修飾、蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)、蛋白質(zhì)水解、蛋白質(zhì)自身的對(duì)稱性、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和等電點(diǎn)等31學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)結(jié)晶方法（1）批量結(jié)晶法（Batchcrystallization）（2）透析法(Dialysis)（3）液相擴(kuò)散法(Liquiddiffusion)（4）氣相擴(kuò)散法（Vapourdiffusion）（5）蛋白質(zhì)結(jié)晶新方法32學(xué)習(xí)交流PPT（1）批量結(jié)晶法（Batchcrystallization）通過(guò)在待測(cè)結(jié)晶蛋白質(zhì)溶液的體積、濃度和組成固定的條件下，直接將不同量的飽和沉淀劑加入未飽和的蛋白質(zhì)溶液以產(chǎn)生一個(gè)濃度梯度而使蛋白質(zhì)在不同的過(guò)飽和溶液中結(jié)晶。33學(xué)習(xí)交流PPT34學(xué)習(xí)交流PPT（2）透析法(Dialysis)利用半透膜允許小分子透過(guò)而大分子不能透過(guò)的性質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的沉淀劑濃度、pH或離子強(qiáng)度，從而使蛋白質(zhì)溶液緩慢形成過(guò)飽和狀態(tài)以形成晶核。該法是培養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體的常用方法。35學(xué)習(xí)交流PPT36學(xué)習(xí)交流PPT（3）液相擴(kuò)散法(Liquiddiffusion)利用液相平衡原理而設(shè)計(jì)的。由于蛋白質(zhì)在不同溶液中的溶解度不同，把待結(jié)晶蛋白質(zhì)溶液緩慢加入溶解性差異大的溶劑中，在界面處形成沉淀劑濃度梯度在局部達(dá)到瞬間過(guò)飽和，從而促使晶核形成。37學(xué)習(xí)交流PPT（4）氣相擴(kuò)散法（Vapourdiffusion）把待結(jié)晶蛋白質(zhì)、高于此蛋白質(zhì)結(jié)晶所需鹽濃度的溶液和低于這種濃度的鹽溶液放在一個(gè)密閉體系內(nèi)，兩種濃度不同的溶液由于發(fā)生蒸汽擴(kuò)散最后達(dá)到平衡，隨著溶液中沉淀劑濃度的增加蛋白質(zhì)溶解性降低，從而蛋白質(zhì)達(dá)到過(guò)飽和而析出晶體。38學(xué)習(xí)交流PPT39學(xué)習(xí)交流PPT（5）結(jié)晶新方法Nucleant生物玻璃40學(xué)習(xí)交流PPT晶體初步鑒定

偏光顯微鏡觀察、染色、電泳等41學(xué)習(xí)交流PPT3、衍射數(shù)據(jù)收集和處理第三代同步輻射光源的應(yīng)用使得用20-40um大小的晶體解析高分辨率結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)目前世界上比較著名的同步輻射工作站有多個(gè)：APS（USA）;ESRF（France）;SPring-8（Japan）42學(xué)習(xí)交流PPT上海同步輻射中心同步輻射光源43學(xué)習(xí)交流PPT晶體收集和儲(chǔ)存液氮?dú)饫浼夹g(shù)44學(xué)習(xí)交流PPT4、位相求解1.分子置換法(MR)2.多對(duì)同晶型置換法(MIR)3.多波長(zhǎng)反常散射法(MAD)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常聯(lián)合使用45學(xué)習(xí)交流PPT分子置換法(MR)

分子置換法就是把已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子放到待測(cè)蛋白質(zhì)晶體的晶胞中建立起初始結(jié)構(gòu)模型并借助此模型計(jì)算待測(cè)蛋白質(zhì)晶體各個(gè)衍射點(diǎn)的相角的方法。

46學(xué)習(xí)交流PPT多對(duì)同晶型置換法(MIR)

在蛋白質(zhì)晶體中引入散射能力強(qiáng)的重金屬原子如Pb和Hg等作為標(biāo)志原子，制備出重原子的衍生物，然后求出這些重原子在晶胞中的坐標(biāo)，根據(jù)坐標(biāo)計(jì)算出重原子散射波在各個(gè)衍射點(diǎn)的相角，最后推測(cè)出蛋白質(zhì)分子在各個(gè)衍射中的位相。

47學(xué)習(xí)交流PPT多波長(zhǎng)反常散射法(MAD)

利用同步輻射波長(zhǎng)連續(xù)可變的特點(diǎn)，使用一個(gè)重原子衍生物作為母體，用一個(gè)晶體就可以收集到重原子反常散射吸收邊兩側(cè)的多套數(shù)據(jù)，并解出結(jié)構(gòu)。

48學(xué)習(xí)交流PPT5、模型建立和修正晶體學(xué)R因子一般要求達(dá)到0.2以下鍵長(zhǎng)偏差大約為0.015?鍵角偏差約為3°二面角構(gòu)象分布要求除了甘氨酸的二面角構(gòu)象是隨機(jī)的外，其他殘基的二面角構(gòu)象分布受到立體化學(xué)的限制49學(xué)習(xí)交流PPTX-Ray晶體衍射目前仍然是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要方法優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，能精確確定生物大分子中各原子的坐標(biāo)、鍵長(zhǎng)、鍵角,給出生物大分子的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型,確定活性中心的位置和結(jié)構(gòu)

缺點(diǎn)：只能測(cè)定單晶，反映靜態(tài)結(jié)構(gòu)信息，無(wú)法測(cè)定溶液中的信息50學(xué)習(xí)交流PPT成為推廣速度和發(fā)展速度都居首位的一種結(jié)構(gòu)分析方法。核磁共振可以方便地在溶液中研究分子結(jié)構(gòu)并且是唯一可以使試樣不經(jīng)受任何破壞的結(jié)構(gòu)分析方法。目前核磁共振成象技術(shù)已能以活人為觀察對(duì)象，掃描身體中任何器官或組織的任何一個(gè)斷面的核磁共振參數(shù)，成為一種引人注目的癌癥早期診斷技術(shù)。第二節(jié)NMR測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)51學(xué)習(xí)交流PPT核磁共振技術(shù)（NMR）1946年美國(guó)斯坦福大學(xué)的F.Bloch和哈佛大學(xué)的E.M.Purcell兩個(gè)研究小組首次獨(dú)立觀察到核磁共振現(xiàn)象，為此他們兩人獲1952年諾貝爾物理獎(jiǎng)。1983年，瑞士科學(xué)家KurtWüthrich教授實(shí)驗(yàn)室首次運(yùn)用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液構(gòu)象.發(fā)明了利用核磁共振(NMR)技術(shù)測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的方法獲得了2002年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)74歲的美國(guó)科學(xué)家保羅·勞特布爾和70歲的英國(guó)科學(xué)家彼得·曼斯菲爾德為2003諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的得主52學(xué)習(xí)交流PPT53學(xué)習(xí)交流PPTNMR基本原理核磁共振(NuclearMagneticResonance)，就是處于某個(gè)靜磁場(chǎng)中的自旋核系統(tǒng)受到相應(yīng)頻率的射頻磁場(chǎng)作用時(shí),共振吸收某一特定頻率的射頻輻射的物理過(guò)程。核磁共振波譜儀核磁共振波譜是測(cè)量原子核對(duì)射頻輻射(約4

600MHz)的吸收，這種吸收只有在高磁場(chǎng)中才能產(chǎn)生。54學(xué)習(xí)交流PPT1555學(xué)習(xí)交流PPT56學(xué)習(xí)交流PPT57學(xué)習(xí)交流PPT核磁共振波譜儀58學(xué)習(xí)交流PPT

核磁共振波譜儀

1．永久磁鐵：提供外磁場(chǎng)，要求穩(wěn)定性好，均勻，不均勻性小于六千萬(wàn)分之一。掃場(chǎng)線圈。2．射頻振蕩器：線圈垂直于外磁場(chǎng)，發(fā)射一定頻率的電磁輻射信號(hào)。60MHz或100MHz。59學(xué)習(xí)交流PPT3．射頻信號(hào)接受器（檢測(cè)器）：當(dāng)質(zhì)子的進(jìn)動(dòng)頻率與輻射頻率相匹配時(shí)，發(fā)生能級(jí)躍遷，吸收能量，在感應(yīng)線圈中產(chǎn)生毫伏級(jí)信號(hào)。4．樣品管：外徑5mm的玻璃管,測(cè)量過(guò)程中旋轉(zhuǎn),磁場(chǎng)作用均勻。60學(xué)習(xí)交流PPT如果一個(gè)人知道了一間房子的所有尺寸，就可以畫出房子的三維圖形。同樣，如圖所示，通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)中的大量的短距離，就可以畫出其結(jié)構(gòu)的三維圖像。瑞士科學(xué)家?guī)鞝柼亍ぞS特里希則發(fā)明了“利用核磁共振技術(shù)測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)法”。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可對(duì)溶液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,進(jìn)而可對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,能獲得“活”蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),其意義非常重大。這種方法的原理可以用測(cè)繪房屋的結(jié)構(gòu)來(lái)比喻首先選定一座房屋的所有拐角作為測(cè)量對(duì)象,然后測(cè)量所有相鄰拐角間的距離和方位,據(jù)此就可以推知房屋的結(jié)構(gòu)。維特里希選擇生物大分子中的質(zhì)子(氫原子核)作為測(cè)量對(duì)象,連續(xù)測(cè)定所有相鄰的2個(gè)質(zhì)子之間的距離和方位,這些數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后就可形成生物大分子的三維結(jié)構(gòu)圖。61學(xué)習(xí)交流PPT核磁共振法中幾個(gè)常用的參數(shù)化學(xué)位移耦合常數(shù)NOE（核歐沃豪斯效應(yīng)）信號(hào)強(qiáng)度譜峰面積弛豫時(shí)間62學(xué)習(xí)交流PPT1.化學(xué)位移

δ值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出現(xiàn)在低場(chǎng)；δ值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出現(xiàn)在高場(chǎng)。63學(xué)習(xí)交流PPT2.耦合常數(shù)核與核之間以價(jià)電子為媒介相互耦合引起譜線分裂的現(xiàn)象稱為自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相鄰兩峰之間的距離被稱為自旋－自旋耦合常數(shù),用J表示。耦合常數(shù)用來(lái)表征兩核之間耦合作用的大小。J耦合常數(shù)大小主要與連接兩個(gè)核的化學(xué)鍵數(shù)目有關(guān)，與影響標(biāo)量耦合核之間電子云分布的因素有關(guān)。64學(xué)習(xí)交流PPT

3.NOE信號(hào)強(qiáng)度當(dāng)分子內(nèi)有兩個(gè)空間距離小于0.5nm的原子核時(shí)，如果用雙共振法照射其中一個(gè)核，使干擾場(chǎng)的強(qiáng)度增加到剛使被干擾的譜線達(dá)到飽和，則另一個(gè)靠近的原子核的共振信號(hào)就會(huì)增加，這種現(xiàn)象稱核歐沃豪斯效應(yīng)（NOE）。65學(xué)習(xí)交流PPT4.譜峰面積譜峰面積和分子中同一化學(xué)環(huán)境的原子核數(shù)目的多少成正比，因此峰面積的積分值可用來(lái)做定量分析的基礎(chǔ)。66學(xué)習(xí)交流PPT5.弛豫時(shí)間原子核從激化的狀態(tài)回復(fù)到平衡排列狀態(tài)的過(guò)程叫弛豫過(guò)程。它所需的時(shí)間叫弛豫時(shí)間。自旋晶格弛豫：處于高能態(tài)的氫核，把能量轉(zhuǎn)給周圍的分子，回到低能態(tài)。

自旋-自旋弛豫：兩個(gè)進(jìn)動(dòng)頻率相同，進(jìn)動(dòng)取向不同的磁性核，在一定距離內(nèi)時(shí)，它們相互交換能量，改變進(jìn)動(dòng)方向。

67學(xué)習(xí)交流PPT

二維核磁共振(2DNMR）NMR可獲得分子內(nèi)各核的化學(xué)環(huán)境、核間的耦合關(guān)系、空間構(gòu)象等信息，但是當(dāng)分子較大的時(shí)候，由于裂分譜線間的重疊，因此在測(cè)定了同一種核的一維譜之后，需要了解兩種或三種不同核之間的聯(lián)系關(guān)系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2個(gè)頻率變量的函數(shù)，吸收峰對(duì)2個(gè)頻率變量作圖。1H-1HCOSY、

1H-15NHSQC68學(xué)習(xí)交流PPT

多維核磁共振1H，13C，15N核之間的化學(xué)鍵連接來(lái)得到核磁共振相關(guān)信號(hào)。CBCANH、HNCO、HCCH-COSY核磁共振本身不能展示樣體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。要得到內(nèi)部的圖像，就要將不同梯度的磁場(chǎng)加以結(jié)合，即改變穿過(guò)樣本的磁場(chǎng)強(qiáng)度。這樣就有無(wú)數(shù)二維的圖像，彼此重疊后就得到樣本內(nèi)部空間的三維圖像

69學(xué)習(xí)交流PPT核磁共振技術(shù)的應(yīng)用早期核磁共振主要用于對(duì)核結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究，如測(cè)量核磁矩、電四極距、及核自旋等后來(lái)廣泛應(yīng)用于分子組成和結(jié)構(gòu)分析，生物組織與活體組織分析，病理分析、醫(yī)療診斷、產(chǎn)品無(wú)損監(jiān)測(cè)等方面70學(xué)習(xí)交流PPT1985年,維特里希等人公布了第一次利用NMR法測(cè)定的溶液中蛋白質(zhì)———蛋白酶抑制劑IIA(proteinaseinhibitorIIA)的結(jié)構(gòu)71學(xué)習(xí)交流PPTNMR圖譜得到的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)from：廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院72學(xué)習(xí)交流PPTNMR的非破壞性使得NMR譜圖可以確定完整生物大分子中某成分的存在和濃度從而與X-Ray晶體衍射互為補(bǔ)充.73學(xué)習(xí)交流PPT核磁共振成像基本原理：是將人體置于特殊的磁場(chǎng)中，用無(wú)線電射頻脈沖激發(fā)人體內(nèi)氫原子核，引起氫原子核共振，并吸收能量。在停止射頻脈沖后，氫原子核按特定頻率發(fā)出射電信號(hào)，并將吸收的能量釋放出來(lái)，被體外的接受器收錄，經(jīng)電子計(jì)算機(jī)處理獲得圖像.74學(xué)習(xí)交流PPT核磁共振測(cè)深

核磁共振測(cè)深是MRI技術(shù)在地質(zhì)勘探領(lǐng)域的延伸，通過(guò)對(duì)地層中水分布信息的探測(cè)，可以確定某一地層下是否有地下水存在，地下水位的高度、含水層的含水量和孔隙率等地層結(jié)構(gòu)信息。

75學(xué)習(xí)交流PPT

優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：可以在水溶液或有機(jī)相中研究生物大分子結(jié)構(gòu)，研究溶液條件的改變對(duì)生物大分子三維結(jié)構(gòu)的影響以及生物大分子內(nèi)部動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)缺點(diǎn)：分辨率不高。目前，NMR只能用于測(cè)定小分子和中型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)from：廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院76學(xué)習(xí)交流PPTNMR法測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本實(shí)驗(yàn)步驟:1、樣品制備，一般應(yīng)采用液態(tài)樣品，CCl4溶解2、一維NMR實(shí)驗(yàn)3、二維NMR實(shí)驗(yàn)4、三維NMR實(shí)驗(yàn)5、有的還要做四維NMR實(shí)驗(yàn)77學(xué)習(xí)交流PPT78學(xué)習(xí)交流PPTX-射線晶體衍射法、核磁共振波譜的關(guān)系NMR法一般只能解析相對(duì)較小的蛋白質(zhì)，X-射線晶體衍射法適用于研究各種大小的蛋白質(zhì)。有些蛋白質(zhì)水溶性很差，卻很容易培養(yǎng)成晶體，另一些蛋白質(zhì)則水溶性很好，培養(yǎng)成晶體很困難。

79學(xué)習(xí)交流PPT第三節(jié)

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的其他方法X射線晶體衍射技術(shù)和核磁共振技術(shù)是當(dāng)前蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要方法，但它們都存在一些不足。X射線晶體衍射技術(shù)要求蛋白質(zhì)是晶體存在狀態(tài)，而對(duì)一些柔性的、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，比較難以得到所需的晶體結(jié)構(gòu)。核磁共振技術(shù)能測(cè)出溶液狀態(tài)下分子量較小蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)處理顯得比較復(fù)雜。80學(xué)習(xí)交流PPT因此，下面介紹一些其他測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法：現(xiàn)代光譜技術(shù)三維電鏡衍射技術(shù)動(dòng)力學(xué)全精研究技術(shù)81學(xué)習(xí)交流PPT一、現(xiàn)代光譜技術(shù)除傳統(tǒng)的紫外-可見差光譜法和熒光光譜法外，圓二色譜、激光拉曼光譜以及質(zhì)譜也在測(cè)定蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象方面發(fā)揮著重要的作用。82學(xué)習(xí)交流PPT圓二色譜

（CircularDichroism，CD）圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種簡(jiǎn)單、快速而又較準(zhǔn)確的方法。圓二色譜是利用不對(duì)稱分子對(duì)左、右圓偏振光吸光率的不同來(lái)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。1969年，Greenfield用圓二色光譜數(shù)據(jù)估計(jì)了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。此后，關(guān)于利用圓二色譜研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的報(bào)道逐漸增多。83學(xué)習(xí)交流PPT平面偏振光、圓偏振光和橢圓偏振光平面偏振光：指振動(dòng)方向在同一平面內(nèi)的電磁波。圓偏振光：當(dāng)兩束振幅相等、互相垂直的偏振光位相相差1/4波長(zhǎng)(90°)時(shí)，其合成矢量繞光傳播方向旋轉(zhuǎn)前進(jìn)，朝著光源方向觀察時(shí)，電場(chǎng)矢量E末端軌跡為圓形，所以稱之為圓偏振光。電場(chǎng)矢量方向順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的稱為右圓偏振光，逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的則稱左圓偏振光。橢圓偏振光：振幅不等的左、右圓偏振光合成84學(xué)習(xí)交流PPT圓二色性和圓二色譜圓二色性：當(dāng)左、右圓偏振光進(jìn)入物質(zhì)時(shí)，光學(xué)活性物質(zhì)分子對(duì)它們的吸收不一樣，它們的差值就是圓二色性光學(xué)活性物質(zhì)分子對(duì)左、右圓偏振光的吸收不一樣，這種吸收差造成矢量振幅差，從介質(zhì)出來(lái)的光成為橢圓偏振光，用橢圓度或吸收差表示圓二色譜：指橢圓度(或比橢圓度等)與波長(zhǎng)的關(guān)系，它在本質(zhì)上與旋光色散譜是一樣的。85學(xué)習(xí)交流PPT圓二色譜的應(yīng)用在分子生物學(xué)中，圓二色儀主要應(yīng)用于測(cè)定生物大分子的空間結(jié)構(gòu)。生物大分子很多是不對(duì)稱的，即光學(xué)活性分子，通過(guò)圓二色譜測(cè)定和計(jì)算能夠了解生物大分子在溶液狀態(tài)下的二級(jí)結(jié)構(gòu)。86學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)或多肽是由氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成的具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子，主要的光學(xué)活性生色基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵，另外，有的蛋白質(zhì)輔基對(duì)蛋白質(zhì)的圓二色性有影響。肽鍵的不對(duì)稱性使得它總有光活性87學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)的圓二色性主要由活性生色基團(tuán)及折疊結(jié)構(gòu)兩方面圓二色性的總和。根據(jù)電子躍遷能級(jí)能量的大小，蛋白質(zhì)的CD光譜分為三個(gè)波長(zhǎng)范圍:1）250nm以下的遠(yuǎn)紫外光譜區(qū)，圓二色性主要由肽鍵的n→π*電子躍遷引起；遠(yuǎn)紫外CD主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的解析

2）250～300nm的近紫外光譜區(qū)，主要由側(cè)鏈芳香基團(tuán)的π→π*電子躍遷引起；近紫外CD主要揭示蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)信息

3）300～700nm的紫外-可見光光譜區(qū)，主要由蛋白質(zhì)輔基等外在生色基團(tuán)引起。紫外-可見光CD主要用于輔基的偶合分析。

88學(xué)習(xí)交流PPT肽鍵是高度有規(guī)律排列的，其排列的方向性決定了肽鍵能級(jí)躍遷的分裂情況。具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生CD譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同。因此，根據(jù)所測(cè)得蛋白質(zhì)或多肽的遠(yuǎn)紫外CD譜，能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，從而揭示蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。89學(xué)習(xí)交流PPT

α-螺旋結(jié)構(gòu)在靠近192nm有一正的譜帶，在222和208nm處表現(xiàn)出兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶；β-折疊的CD光譜在216nm有一負(fù)譜帶，在185～200nm有一正譜帶；β-轉(zhuǎn)角在206nm附近有一正CD譜帶，而左手螺旋P2結(jié)構(gòu)在相應(yīng)的位置有負(fù)的CD譜帶，如上圖和表所示。

-band(nm)+band(nm)α-螺旋222，208192β-折疊216195β-轉(zhuǎn)角220-230(弱)，180-190（強(qiáng)）205左手螺旋P2結(jié)構(gòu)190210-230（弱）無(wú)規(guī)則卷曲20021290學(xué)習(xí)交流PPT91學(xué)習(xí)交流PPT

CD數(shù)據(jù)擬合計(jì)算蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法基本原理是假設(shè)蛋白質(zhì)在波長(zhǎng)λ處的CD信號(hào)θ(λ)是蛋白質(zhì)中或多肽各種二級(jí)結(jié)構(gòu)組分及由芳香基團(tuán)引起的噪音的線性加，θ(λ)=Σfiθ(λ)i+noise。θ(λ)i是第i個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的CD信號(hào)值，fi為第i個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的含量分?jǐn)?shù)，Σfi規(guī)定值為1；通過(guò)已知蛋白（或稱參考蛋白）二級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色數(shù)據(jù)庫(kù)，曲線擬合未知蛋白或多肽的圓二色數(shù)據(jù)，估算未知蛋白或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。92學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)擬合計(jì)算方法中，主要采用多聚氨基酸為參考多肽。Greenfield等采用多聚L-lys作參考多肽，建立α-螺旋、β-折疊及無(wú)規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)參考CD光譜曲線，采用單一波長(zhǎng)法（208nm）計(jì)算出α-螺旋含量后，然后假設(shè)不同的β-折疊含量（Xβ）值，并假設(shè)CD值是α-螺旋含量(XH)、β-折疊含量(Xβ)無(wú)規(guī)卷曲(XR)三者貢獻(xiàn)值的加和，即：XH+Xβ+XR=1

93學(xué)習(xí)交流PPT通過(guò)計(jì)算得到不同波長(zhǎng)的θ(λ)，得出計(jì)算曲線。假設(shè)一些不同的Xβ值，分別求出它們相應(yīng)的計(jì)算曲線，找出與實(shí)驗(yàn)曲線最接近的曲線，相應(yīng)于該最接近曲線的Xβ及XR即認(rèn)為是該蛋白質(zhì)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)含量。94學(xué)習(xí)交流PPTExamplefit:myoglobin(肌紅蛋白)Inthiscase:qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwith xa=80%, xb=0% xc=20%

agreeswellwithstructure 78%helix,22%coil95學(xué)習(xí)交流PPT激光拉曼光譜激光拉曼光譜法是研究生物大分子結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)及功能的重要手段，它在物理、化學(xué)、醫(yī)學(xué)及生物學(xué)等領(lǐng)域都有著十分重要的應(yīng)用價(jià)值。在蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)研究方面，拉曼光譜分析可以提供大量的信息，促進(jìn)蛋白質(zhì)等生物大分子研究進(jìn)展。96學(xué)習(xí)交流PPT1928年，印度物理學(xué)家拉曼(Raman)發(fā)現(xiàn)了拉曼光譜，同時(shí)期的蘇聯(lián)物理學(xué)家蘭斯伯格(G.Landsberg)也獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。從那時(shí)起，拉曼光譜逐漸發(fā)展成為一個(gè)分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的有力工具。然而由于拉曼光譜技術(shù)強(qiáng)度很弱，時(shí)間較長(zhǎng)，測(cè)定有色物質(zhì)和發(fā)光樣品存在困難等缺陷,給其應(yīng)用帶來(lái)了很大困難,故在后來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)發(fā)展比較緩慢，曾一度有被紅外光譜取代的趨勢(shì)。直到1960年激光出現(xiàn)以后，由于激光具有高亮度、單色性和方向性好以及高偏振度等特點(diǎn)，非常適合作為拉曼光譜的激發(fā)光源，因而迅速為科研工作者所利用。97學(xué)習(xí)交流PPT質(zhì)譜(massspectrometry，MS)自美國(guó)科學(xué)家JohnB.Fenn和日本學(xué)者田中耕一(Koichi.Tanaka)發(fā)明了對(duì)生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的質(zhì)譜分析法以來(lái)，隨著生命科學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物質(zhì)譜目前已成為有機(jī)質(zhì)譜中最活躍、最富生命力的前沿研究領(lǐng)域之一。生物質(zhì)譜的發(fā)展使人類基因組計(jì)劃及其后基因組計(jì)劃得以提前完成，對(duì)其實(shí)施也起著重要的推動(dòng)作用。質(zhì)譜分析法在研究生物大分子特別是蛋白質(zhì)方面已發(fā)展成為主要的技術(shù)手段之一，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中占據(jù)著十分重要的地位。98學(xué)習(xí)交流PPT質(zhì)譜分析基本原理質(zhì)譜分析是將樣品轉(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)的氣態(tài)帶電離子，于磁場(chǎng)中按質(zhì)荷比(m/z)大小分離并記錄的分析方法。其過(guò)程可簡(jiǎn)單描述為：

離子源轟擊樣品→帶電荷的碎片離子→電場(chǎng)加速(zeU)→獲得動(dòng)能(mv2)→磁場(chǎng)分離→檢測(cè)器記錄其中，z為電荷數(shù)，e為電子電荷，U為加速電壓，m為碎片質(zhì)量，v為電子運(yùn)動(dòng)速度。99學(xué)習(xí)交流PPT質(zhì)譜分析(MS)的特點(diǎn)MS用于生物大分子的研究具有以下優(yōu)點(diǎn):高靈敏度易操作性準(zhǔn)確性快速性很好的普適性高靈敏度能為亞微克級(jí)試樣提供信息，可以有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測(cè)定。100學(xué)習(xí)交流PPT質(zhì)譜分析的方法近年來(lái)出現(xiàn)的較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：電噴霧電離質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜快原子轟擊質(zhì)譜離子噴霧電離質(zhì)譜大氣壓電離質(zhì)譜在這些技術(shù)中，以前面三種近年來(lái)研究得最多，應(yīng)用得也最廣泛。101學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析目前主要測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)，包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置。肽和蛋白的質(zhì)譜測(cè)序具有速度快、用量少、易操作等優(yōu)點(diǎn)，使它非常適合現(xiàn)代科研工作的要求。蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析原理為：通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子,然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開來(lái),經(jīng)過(guò)離子檢測(cè)器收集分離的離子,確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。102學(xué)習(xí)交流PPT蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方法MS用于多肽和蛋白質(zhì)測(cè)序可分為三種方法：第一種方法稱為蛋白圖譜(proteinmapping),它是使用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測(cè)各產(chǎn)物肽的分子量,將所得肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù),搜索與之相對(duì)應(yīng)的已知蛋白,從而獲取待測(cè)蛋白序列；103學(xué)習(xí)交流PPT第二種方法是利用待測(cè)分子在電離及飛行過(guò)程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過(guò)分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識(shí)別相應(yīng)的氨基酸殘基；第三種方法稱為梯狀測(cè)序(laddersequencing)，是用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從Ｎ端或Ｃ端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，再經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，由相鄰峰的質(zhì)量差可知相應(yīng)氨基酸殘基。104學(xué)習(xí)交流PPT質(zhì)譜中主要出現(xiàn)的離子有四種，即分子離子、碎片離子、同位素離子和亞穩(wěn)離子分子離子分子在離子源中失去一個(gè)電子形成的離子，在質(zhì)譜圖中，分子離子對(duì)應(yīng)的峰稱分子離子峰。

特點(diǎn)：分子離子含奇數(shù)個(gè)電子，分子離子峰出現(xiàn)在質(zhì)譜圖的最右側(cè)。

作用：根據(jù)分子離子的質(zhì)荷比可確定分子量及分子式。105學(xué)習(xí)交流PPT碎片離子：分子離子中的某個(gè)化學(xué)鍵斷裂而形成的離子，有些碎片離子獲得能量，會(huì)進(jìn)一步裂解成更小的碎片離子。

特點(diǎn)：m/z較分子離子小