1-1 DNA重組技術的基本工具

基因工程專題12021/12/211-1DNA重組技術的基本工具基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程DNA重組技術生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導入→表達2021/12/221-1DNA重組技術的基本工具

自然界是否存在一種生物的DNA進入另一生物的情況？噬菌體侵染細菌的實驗。思考：2021/12/231-1DNA重組技術的基本工具基礎理論和技術發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質，DNA可從一種生物個體轉移到另一種生物個體。2021/12/241-1DNA重組技術的基本工具基礎理論和技術發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結構模型。2021/12/251-1DNA重組技術的基本工具基礎理論和技術發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復制2021/12/261-1DNA重組技術的基本工具基礎理論和技術發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質轉錄翻譯逆轉錄復制2021/12/271-1DNA重組技術的基本工具科技探索之路基礎理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實驗加以證明。基礎理論和技術發(fā)展催生了基因工程2021/12/281-1DNA重組技術的基本工具科技探索之路1)1967年基因轉移載體的發(fā)現2)1970年工具酶的發(fā)現3)1977年DNA合成和測序技術的發(fā)明4)1972年DNA體外重組的實現5)1973年重組DNA表達實驗的成功6)1980年第一例轉基因動物問世7)1988年PCR技術的發(fā)明基礎理論和技術發(fā)展催生了基因工程2021/12/291-1DNA重組技術的基本工具第一節(jié)

DNA重組技術的基本工具一.準確切割DNA的工具（“分子手術刀”）

——限制性核酸內切酶二.DNA片段的連接工具（“分子縫合針”）

——DNA連接酶三.基因轉移工具（“分子運輸車”）

——基因進入受體細胞的載體2021/12/2101-1DNA重組技術的基本工具⒈主要來源：主要從原核生物中分離純化思考一、限制性核酸內切酶——“分子手術刀”根據你所掌握的知識你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，從而達到保護自身的目的。2021/12/2111-1DNA重組技術的基本工具⒉種類與命名：

現在已經從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內核酸切酶(限制酶)。

練習：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ一、限制性核酸內切酶——“分子手術刀”粘質沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）SmaⅠ大腸桿菌（EscherichiacoliR）EcoRⅠ2021/12/2121-1DNA重組技術的基本工具3.作用特點（1）識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列例如：大腸桿菌的EcoRⅠ限制酶只能識別GAATTC序列，一、限制性核酸內切酶——“分子手術刀”（2）在特定的位點切割DNA分子。并在G和A之間切開。——特異性2021/12/2131-1DNA重組技術的基本工具限制酶的識別序列：

能被限制性內切酶特異性識別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致?！胺肿邮中g刀”---限制性核酸內切酶(限制酶)大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成,少數的識別序列由4、5或8個核苷酸組成2021/12/2141-1DNA重組技術的基本工具切割DNA分子實質是斷開兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。2021/12/2151-1DNA重組技術的基本工具產生黏性末端或平末端一、限制性核酸內切酶——“分子手術刀”4.作用結果：EcoRⅠ限制酶

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。2021/12/2161-1DNA重組技術的基本工具SmaⅠ平末端平末端一、限制性核酸內切酶——“分子手術刀”被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口是平整的，這樣的切口叫平末端。2021/12/2171-1DNA重組技術的基本工具⒈主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點（特異性）4.限制酶識別序列5.作用結果：識別特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要從原核生物中分離純化產生黏性末端或平末端大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數的識別序列由4、5或8個核苷酸組成“分子手術刀”---限制性核酸內切酶(限制酶)2021/12/2181-1DNA重組技術的基本工具……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合如何將不同種來源的DNA片段連接起來？生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切2021/12/2191-1DNA重組技術的基本工具1.作用:把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來。2.作用原理：催化磷酸二酯鍵形成二、DNA連接酶——“分子縫合針”2021/12/2201-1DNA重組技術的基本工具3.種類：（1）E·coliDNA連接酶（2）T4DNA連接酶兩種酶的區(qū)別：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別二、DNA連接酶——“分子縫合針”2021/12/2211-1DNA重組技術的基本工具

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵2021/12/2221-1DNA重組技術的基本工具

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶2021/12/2231-1DNA重組技術的基本工具DNA聚合酶DNA連接酶模板作用底物作用特點相同點DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?形成磷酸二酯鍵以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸連接成一條互補的DNA鏈將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板需要不需要單個脫氧核苷酸DNA分子片段2021/12/2241-1DNA重組技術的基本工具⒈運載體必備的條件：

⑴在受體細胞中能自我復制并穩(wěn)定保存⑵有1個至多個限制酶切割位點⑶有特殊的標記基因，便于鑒定和選擇⑷對受體細胞的生存無決定性作用⒉常用運載體：

⑴質粒⑵λ噬菌體的衍生物⑶動植物病毒三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”2021/12/2251-1DNA重組技術的基本工具常用的載體：質粒能復制并帶著插入的目的基因一起復制有切割位點有標記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別

常存在于原核細胞中，是一種裸露的、結構簡單、獨立于擬核之外能自我復制的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。2021/12/2261-1DNA重組技術的基本工具2021/12/2271-1DNA重組技術的基本工具274836152021/12/2281-1DNA重組技術的基本工具思考與探究P7（2）2、為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？

通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。2021/12/2291-1DNA重組技術的基本工具3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？不能，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P72021/12/2301-1DNA重組技術的基本工具1）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復制的能力，或可整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。3）載體DNA必需帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。5）載體DNA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質粒DNA分子并不完全具備