1-1 DNA重組技術(shù)的基本工具

基因工程專題12021/12/211-1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)2021/12/221-1DNA重組技術(shù)的基本工具

自然界是否存在一種生物的DNA進(jìn)入另一生物的情況？噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。思考：2021/12/231-1DNA重組技術(shù)的基本工具基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。2021/12/241-1DNA重組技術(shù)的基本工具基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。2021/12/251-1DNA重組技術(shù)的基本工具基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制2021/12/261-1DNA重組技術(shù)的基本工具基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制2021/12/271-1DNA重組技術(shù)的基本工具科技探索之路基礎(chǔ)理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程2021/12/281-1DNA重組技術(shù)的基本工具科技探索之路1)1967年基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)1970年工具酶的發(fā)現(xiàn)3)1977年DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明4)1972年DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5)1973年重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6)1980年第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問(wèn)世7)1988年P(guān)CR技術(shù)的發(fā)明基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程2021/12/291-1DNA重組技術(shù)的基本工具第一節(jié)

DNA重組技術(shù)的基本工具一.準(zhǔn)確切割DNA的工具（“分子手術(shù)刀”）

——限制性核酸內(nèi)切酶二.DNA片段的連接工具（“分子縫合針”）

——DNA連接酶三.基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運(yùn)輸車”）

——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體2021/12/2101-1DNA重組技術(shù)的基本工具⒈主要來(lái)源：主要從原核生物中分離純化思考一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”根據(jù)你所掌握的知識(shí)你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。2021/12/2111-1DNA重組技術(shù)的基本工具⒉種類與命名：

現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)核酸切酶(限制酶)。

練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）SmaⅠ大腸桿菌（EscherichiacoliR）EcoRⅠ2021/12/2121-1DNA重組技術(shù)的基本工具3.作用特點(diǎn)（1）識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列例如：大腸桿菌的EcoRⅠ限制酶只能識(shí)別GAATTC序列，一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”（2）在特定的位點(diǎn)切割DNA分子。并在G和A之間切開?！禺愋?021/12/2131-1DNA重組技術(shù)的基本工具限制酶的識(shí)別序列：

能被限制性內(nèi)切酶特異性識(shí)別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致?！胺肿邮中g(shù)刀”---限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成,少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成2021/12/2141-1DNA重組技術(shù)的基本工具切割DNA分子實(shí)質(zhì)是斷開兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。2021/12/2151-1DNA重組技術(shù)的基本工具產(chǎn)生黏性末端或平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”4.作用結(jié)果：EcoRⅠ限制酶

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。2021/12/2161-1DNA重組技術(shù)的基本工具SmaⅠ平末端平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口是平整的，這樣的切口叫平末端。2021/12/2171-1DNA重組技術(shù)的基本工具⒈主要來(lái)源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)（特異性）4.限制酶識(shí)別序列5.作用結(jié)果：識(shí)別特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要從原核生物中分離純化產(chǎn)生黏性末端或平末端大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成“分子手術(shù)刀”---限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)2021/12/2181-1DNA重組技術(shù)的基本工具……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來(lái)源的DNA片段混合如何將不同種來(lái)源的DNA片段連接起來(lái)？生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

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G……酶切2021/12/2191-1DNA重組技術(shù)的基本工具1.作用:把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái)。2.作用原理：催化磷酸二酯鍵形成二、DNA連接酶——“分子縫合針”2021/12/2201-1DNA重組技術(shù)的基本工具3.種類：（1）E·coliDNA連接酶（2）T4DNA連接酶兩種酶的區(qū)別：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別二、DNA連接酶——“分子縫合針”2021/12/2211-1DNA重組技術(shù)的基本工具

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵2021/12/2221-1DNA重組技術(shù)的基本工具

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低T4DNA連接酶2021/12/2231-1DNA重組技術(shù)的基本工具DNA聚合酶DNA連接酶模板作用底物作用特點(diǎn)相同點(diǎn)DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?形成磷酸二酯鍵以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板需要不需要單個(gè)脫氧核苷酸DNA分子片段2021/12/2241-1DNA重組技術(shù)的基本工具⒈運(yùn)載體必備的條件：

⑴在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制并穩(wěn)定保存⑵有1個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)⑶有特殊的標(biāo)記基因，便于鑒定和選擇⑷對(duì)受體細(xì)胞的生存無(wú)決定性作用⒉常用運(yùn)載體：

⑴質(zhì)粒⑵λ噬菌體的衍生物⑶動(dòng)植物病毒三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”2021/12/2251-1DNA重組技術(shù)的基本工具常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別

常存在于原核細(xì)胞中，是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于擬核之外能自我復(fù)制的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。2021/12/2261-1DNA重組技術(shù)的基本工具2021/12/2271-1DNA重組技術(shù)的基本工具274836152021/12/2281-1DNA重組技術(shù)的基本工具思考與探究P7（2）2、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。2021/12/2291-1DNA重組技術(shù)的基本工具3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？不能，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P72021/12/2301-1DNA重組技術(shù)的基本工具1）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或可整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備