RNA干擾技術(shù)-生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件

RNA干擾技術(shù)董瑩董翠玲陳崇波

1RNA干擾技術(shù)董瑩董翠玲陳崇波12006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)：美國斯坦福大學(xué)AndrewZ．Fire美國馬薩諸塞大學(xué)CraigC．Mello，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象22006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)：2什么是RNAi？一、RNAi的發(fā)現(xiàn)二、RNAi的分子機(jī)制三、RNAi的生物學(xué)功能與意義四、RNAi試驗(yàn)方法3什么是RNAi？一、RNAi的發(fā)現(xiàn)3一、RNAi的發(fā)現(xiàn)4一、RNAi的發(fā)現(xiàn)4WTPlantwithapigmenttransgenePostTranscriptionalGeneSilencinginPetuniaRNAi的發(fā)現(xiàn)5WTPlantwithapigmenttransge1995年，GuoS等試圖阻斷秀麗線蟲（C.elegans）中的par-1基因的表達(dá)設(shè)計(jì)：反義RNA特異性地阻斷par-1基因的表達(dá)正義RNA以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)結(jié)果:二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋不相符合。該研究小組一直沒能給這個(gè)意外以合理解釋61995年，GuoS等試圖阻斷秀麗線蟲（C.elegans直到1998年2月，F(xiàn)ireA和MelloC才首次揭開這個(gè)懸疑之謎。他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱；而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。他們證實(shí)，GuoS博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾（簡稱RNAi）。7直到1998年2月，F(xiàn)ireA和MelloC才首次揭開這RNAi概念

RNA干擾(RNAi)是指dsRNA在細(xì)胞內(nèi)特異性地誘導(dǎo)與之同源互補(bǔ)的mRNA的降解，使相應(yīng)基因的表達(dá)關(guān)閉，從而引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄后水平沉默的現(xiàn)象。8RNAi概念RNA干擾(RNAi)是指dRNAi

特點(diǎn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制較高的特異性抑制基因表達(dá)具有較高的效率有濃度、時(shí)間雙重依賴性基因表達(dá)的效應(yīng)可以突破細(xì)胞界限9RNAi特點(diǎn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制9二、RNAi的分子機(jī)制1.起始階段(theinitiationphase)2.效應(yīng)階段(thesubsequenteffectorphase)1010dsRNA通過外源導(dǎo)入、轉(zhuǎn)基因或者病毒感染等方式進(jìn)入細(xì)胞后，專一性的雙鏈RNA內(nèi)切酶Dicer識別dsRNA，在ATP的參與下逐步把dsRNA切割成長約21～23nt的片段。Dicer11dsRNA通過外源導(dǎo)入、轉(zhuǎn)基因或者病毒感染等方式進(jìn)入siRNA參與形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，ATP激活的RISC在雙鏈siRNA的反義鏈指導(dǎo)下，尋找與siRNA具有同源序列的內(nèi)源靶mRNA，并在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割靶mRNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默。12siRNA參與形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)1313三、RNAi的生物學(xué)功能與意義14三、RNAi的生物學(xué)功能與意義14RNAi的生物學(xué)功能抵抗病毒入侵抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)，保護(hù)基因組的完整性調(diào)控基因表達(dá)清除畸變的RNA參與基因組重排15RNAi的生物學(xué)功能抵抗病毒入侵15RNAi的生物學(xué)意義1.研究功能基因組學(xué)的新工具2.研究信號傳導(dǎo)通路的新途徑3.研究發(fā)育過程中起作用的基因4.開展基因治療的新策略16RNAi的生物學(xué)意義1.研究功能基因組學(xué)的新工具16四、RNAi試驗(yàn)方法17四、RNAi試驗(yàn)方法171.篩選RNAi探針2.制備siRNA

化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、用RNaseⅢ消化長片斷雙鏈RNA、siRNA表達(dá)載體、siRNA表達(dá)框架3.導(dǎo)入細(xì)胞

電穿孔法、磷酸鈣共沉淀、DEAE一葡聚糖、陽離子脂質(zhì)體試劑4.RNAi轉(zhuǎn)染效率熒光蛋白(如GFP)或熒光素酶等報(bào)告基因與其共表達(dá)法181.篩選RNAi探針181919Abstract：Invitro,RNAiisanalmost-standardmethodtoknockdownanytargetgene.Invivo,itseffcientdeliveryandspecificitytothetargetgenechallengeitstherapeuticapplication.Now,manyeffortshavemadetoenhancesiRNAdeliveryandtargetorganspecificity.20Abstract：Invitro,RNAiisInvitroseveraltransfectionreagentsallowthedeliveryofsiRNAsinmammaliancellsinthepresenceorabsenceofserumIn

vivorequirethedevelopmentofmoresophisticatedformulationsand/ortheidentificationofoptimalmodesofadministration21InvitroseveraltransfectTherapeuticsiRNAmolecules

Cancer:Targetmoleculesusuallyrepresentgenesthathavebeenshownpreviouslytoberelevantorrate-limitingfortumorgrowthAntiviraltreatment

:novelRNAi-basedapproachestobattleviralinfectionsrelyonthespecificsiRNA-mediatedknockdownofvirus-specificgenes22TherapeuticsiRNAmolecules

CaThisstudiesprovidevaluableinsightsintothedeliveryandefficacyoffortheinductionofRNAi.23ThisstudiesprovidevaluabClinicaltrials

ALN-RSV01:targetthehumanRSVafterviralinfection,whichisthefirstexampleofanantivirussiRNA-basedtherapeuticinaphaseⅠclinicalstudy.

Sirna-027:TotreatAMD,

after24-monthphaseIIstudy,IthasalreadyusedforrecruitingpatientswithAMD.Cand5:whichisnownamedBevasiranib,wasthefirstsiRNAtoenterbothphaseIandIIclinicaltrials.24Clinicaltrials

ALN-RSV01:tarStrategiesforinvivosiRNAdelivery

TheadvantagesofthedirectapplicationofsiRNAs:thelowerprobabilityonspecificsideeffectsthesafetyofsiRNAdeliveryisbasedonnonviraltransferstrategiessiRNAscannotintegrateintothegenome25StrategiesforinvivosiRNAd

SuccessfulsiRNAbasedgenetargetingreliesonseveralpreconditions:

ProtecttheinstablesiRNAmoleculesEfficientcellularuptakeandintracellularreleaseintothecytoplasmTheabsenceofintracellularimmuneresponses26

SuccessfulsiRNAbasedgenetTheformulationofsiRNAsincarriersystems：LiposomalformulationsNanoparticlespolyethylenimine(PEI)ItcanbeconsideredasexamplesofnonviralenvelopesthatprotectsiRNAs,thusincreasingserumstability,reducingrenalexcretionandmediatingsiRNAuptakeintothecellsthroughendocytosisnanoparticleswithpositivelychargedmacromolecules.Basedonelectrostaticinteractions,complexesareformedwithatelocollagenchitosanorPEIPEI/siRNAcomplexesaregoodforenhancingtissuespecificityandinvivobiocompatibility,reducingimmunogenicityandtoxicityandincreasingsiRNAdelivery27Itcanbeconsideredasexampl2828ConclusionandoutlookAveryefficientandspecificmethodfortheknockdownThesuccessofsiRNAswilldependontheirefficie