第七章 植物基因工程

第七章

植物基因工程轉(zhuǎn)基因植物世界上第一種基因移植作物是一種含有抗生素藥類抗體的煙草，1983年得以培植出來。

轉(zhuǎn)基因番茄

1994年，美國研制成功抗干旱、早熟、保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品化之后，我國也相繼成功培育出優(yōu)良品種的轉(zhuǎn)基因番茄，以滿足人們的需求。

轉(zhuǎn)基因甜椒

甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我國科學(xué)工作者，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出抗病毒的甜椒。轉(zhuǎn)基因油菜

油菜是人們食用油的主要來源之一。一般油菜籽的含油量約為40％左右。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出來的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的純度質(zhì)量更好。

玉米是主要糧食之一，又可以提煉油脂，也可以用作食品和工業(yè)的原料以及作飼料，渾身是寶。人們稱它是含金的植物。如今培育出轉(zhuǎn)基因玉米，品質(zhì)更好，產(chǎn)量更高。轉(zhuǎn)基因玉米

轉(zhuǎn)基因牽?；?/p>

我國科學(xué)工作者，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以轉(zhuǎn)變矮牽牛花的花色，使矮牽牛花的花色更加豐富多彩。轉(zhuǎn)基因小麥

從植物體中分離出合成賴氨酸的基因，把這基因轉(zhuǎn)入小麥植株中，培育出轉(zhuǎn)基因小麥。用這種轉(zhuǎn)基因小麥制造出來的面粉，更適合用來烤面包，而且面粉中賴氨酸含量高，這種面包的營養(yǎng)價(jià)值高。

本章主要內(nèi)容：第一節(jié)植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀第二節(jié)植物基因工程方法第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定與證明第五節(jié)植物基因工程研究的應(yīng)用和展望

植物基因工程的概念

植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作，即以分子生物學(xué)為理論基礎(chǔ)，采用基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化（根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法、基因槍法、原生質(zhì)體介導(dǎo)法等），以及細(xì)胞、組織培養(yǎng)技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以正確表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，從而使受體獲得新性狀的技術(shù)體系。第一節(jié)

植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀

轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用前景和理論意義通過將目的基因?qū)朕r(nóng)作物或園藝作物中，改變它們的遺傳特性，使植物免受病蟲的危害、獲得抗除草劑的特性、改變種子中淀粉、蛋白質(zhì)的含量和組成、改變花的形狀和顏色、改變植物的育性和不親合性以及改變植物的抗逆性等。轉(zhuǎn)基因植物可作為一種生物反應(yīng)器，生產(chǎn)藥用蛋白和植物次生代謝產(chǎn)物或者生產(chǎn)某些有機(jī)化合物。轉(zhuǎn)基因植物為人們研究某一基因功能及其再生長發(fā)育中的作用提供了強(qiáng)有力的工具。

國際轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀

從1996年到2004年間，全球轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)和利用超出了當(dāng)初預(yù)料，基因作物種植面積增長了近48倍，從1996年的170萬公頃增加到2004年的8100萬公頃。

國內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀在某些領(lǐng)域達(dá)到了國際先進(jìn)水平。2004年全國轉(zhuǎn)基因作物種植面積為370萬公頃，成為繼美國、阿根廷、加拿大、巴西之后的轉(zhuǎn)基因植物種植第五大國。第二節(jié)植物基因工程方法

原生質(zhì)體介導(dǎo)法基因槍法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

一、原生質(zhì)體介導(dǎo)法概念：以原生質(zhì)體為受體，借助于特定的化學(xué)或物理手段將外源ＤＮＡ直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。主要方法:

PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體（liposome)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化電激法激光導(dǎo)入法顯微注射法

PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化

原理：利用化學(xué)試劑，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(細(xì)胞促融劑)等，誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子，進(jìn)入原生質(zhì)體的外源DNA分子就有可能通過某種機(jī)制整合到基因組中，完成遺傳轉(zhuǎn)化過程。如：轉(zhuǎn)基因煙草

脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化

原理：利用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹外源DNA成球體,通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高;操作繁瑣;技術(shù)性高。

電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化

原理：利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激穿孔“，形成可逆的瞬間通道,從而促進(jìn)外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高；操作簡(jiǎn)便；容易造成原生質(zhì)體損傷。顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化

原理：利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高；純物理方法，適用于各種植物和材料，無局限性；對(duì)受體細(xì)胞無毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長發(fā)育；培養(yǎng)過程無需特殊選擇系統(tǒng)。

激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：將激光引入光學(xué)顯微鏡聚焦成微米級(jí)的微束照射培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入細(xì)胞培養(yǎng)基里的外源DNA流入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便；工作效率高；無宿主限制，適應(yīng)于各種動(dòng)植物；對(duì)受體細(xì)胞生命活動(dòng)影響小；受體的類型廣泛；用于細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)化．二、基因槍法（微彈轟擊法）工作原理：將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。動(dòng)力類型：火藥爆炸力；高壓氣體；高壓放電．

操作步驟

（1）制備DNA微彈；

（2）準(zhǔn)備靶外植體材料；

（3）DNA微彈轟擊；

（4）培養(yǎng)轟擊后的外植體．轉(zhuǎn)化率影響因素

金屬微粒金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良,但是價(jià)格昂貴.DNA沉淀輔助劑這些化合物對(duì)DNA在微粒上的黏附有重要作用,但對(duì)植物受體細(xì)胞也產(chǎn)生一定的傷害.DNA純度及濃度微彈速度植物材料內(nèi)在因素

三、根癌桿菌介導(dǎo)法根癌農(nóng)桿菌廣泛親染雙子葉植物和裸子植物。根據(jù)根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物形成的根瘤中冠癭堿的不同可將根癌農(nóng)桿菌分為章魚堿型、胭脂堿型和農(nóng)桿堿型3種類型。在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個(gè)大的致瘤質(zhì)粒，簡(jiǎn)稱Ti質(zhì)粒。

Ti質(zhì)粒的改造策略Ti質(zhì)粒是植物基因工程的一種天然載體，但野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體存在著學(xué)多障礙：（1）質(zhì)粒過大，操作困難（2）大型的Ti質(zhì)粒有多個(gè)酶切位點(diǎn)（3）植物激素類的影響（4）Ti質(zhì)粒中存在不起作用的序列（5）Ti質(zhì)粒的局限性為了使Ti質(zhì)粒變成操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化有效的外源基因轉(zhuǎn)移載體,必須對(duì)野生型的Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造.植物轉(zhuǎn)基因有一元載體系統(tǒng)和二元載體系統(tǒng),所以采取不同的改造策略.二元載體較一元載體的優(yōu)點(diǎn):構(gòu)建比較方便;二元載體不會(huì)帶入大量的無用的多余的DNA序列.因?yàn)橐辉d體的T-DNA區(qū)中含中間載體,他們會(huì)隨同外源基因一起被轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中.根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理六個(gè)步驟：（1）農(nóng)桿菌對(duì)受體（2）農(nóng)桿菌附著到植物受體細(xì)胞（3）誘導(dǎo)啟動(dòng)毒性區(qū)基因表達(dá)（4）類似接合孔復(fù)合體的合成和裝配（5）T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)（6）T-DNA的整合基因槍法與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的比較

基因槍法多拷貝整合概率高，外源基因易沉默表達(dá)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)低拷貝整合（多為單拷貝整合）轉(zhuǎn)化效率較高?；驑尫兾锢磙D(zhuǎn)化，不存在物種的限制。農(nóng)桿菌介導(dǎo)存在宿主范圍的局限性?；驑尫ㄟm于以細(xì)胞器為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因研究。第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選當(dāng)采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外植體后，通常外植體中僅僅只有幾個(gè)少數(shù)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化，只有采取有效的篩選方法，才能高效準(zhǔn)確的篩選到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般情況下，轉(zhuǎn)化載體上除了帶有目的基因外，大多還攜帶選擇基因，以供轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選使用。轉(zhuǎn)化篩選細(xì)胞的方法主要有兩種：一、根據(jù)選擇基因的特點(diǎn)在篩選選擇培養(yǎng)基中加入能抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的有毒物質(zhì)（如抗生素、除草劑等），選擇基因通常為一種解毒基因，可以解除培養(yǎng)基中有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用，這樣只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞才能生長繁殖；二、受體細(xì)胞為營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，在選擇性培養(yǎng)基中不能生殖，而選擇培養(yǎng)基可以補(bǔ)償這種缺陷，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上正常生長。一、植物基因工程中的選擇基因

植物基因工程中的基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。最常用的有新霉素抗性基因（neor）、慶大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）,以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）等。1、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離的，其對(duì)應(yīng)失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和G418。卡那霉素、新霉素可通過與核糖體小亞基結(jié)合抑制蛋白質(zhì)的合成，G418可通過抑制80S核糖體的功能而阻斷真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成。新霉素抗性基因可使選擇試劑磷酸化而失效。2.慶大霉素抗性基因（gentr）該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標(biāo)記基因，它通過對(duì)慶大霉素的乙酰化而使其失活。該選擇系統(tǒng)目前也有一定的應(yīng)用，例如矮牛、煙草和番茄。

3.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）

潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對(duì)許多植物都有很強(qiáng)的毒性。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可通過對(duì)潮霉素磷酸化而使其失活。4.膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）

該基因是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因，其對(duì)應(yīng)的選擇試劑為膦絲菌素（basta）,膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生氨的致