視網(wǎng)膜色素變性

視網(wǎng)膜色素變性-感音神經(jīng)性耳聾綜合征MYO7A基因致病突

變篩查摘要：目的探討一個中國視網(wǎng)膜色素變性-感音神經(jīng)性耳聾綜合征家系的致病基因及其突變位點。方法在簽署知情同意書后，對該家系先證者及父母進(jìn)行病史收集、常規(guī)查體、視野檢查及視網(wǎng)膜電圖檢查。采集家系成員靜脈血，提取基因組DNA、全外顯子組測序、生物信息數(shù)據(jù)分析和Sanger測序驗證突變位點。結(jié)果該家系有1例患者，表現(xiàn)為青少年時期發(fā)病，視野漸進(jìn)性變窄，周邊視力受損，聽力受損，耳聾，視網(wǎng)膜現(xiàn)色素沉著，mfERG顯示a波、b波振幅下降?；颊吒改妇?，為雜合突變攜帶者，符合常染色體隱性遺傳模式特征。外顯子組測序、數(shù)據(jù)過濾和Sanger測序驗證發(fā)現(xiàn)在MYO7A基因上存在兩個突變位點：NM_001127180，c.3695_3705del，p.R1232fs和NM_001127180，c.6234+5G>A。在1000例健康人對照中沒有發(fā)現(xiàn)該兩個突變。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)MYO7A致病基因上兩個新的突變位點，擴(kuò)大了MYO7A致病突變譜，為臨床診治提供了新靶點。關(guān)鍵詞：視網(wǎng)膜色素變性-感音神經(jīng)性耳聾綜合征；全外顯子組測序；常染色體隱性遺傳；MYO7A基因視網(wǎng)膜色素變性-感音神經(jīng)性耳聾綜合征1型(UsherI)是一類以漸進(jìn)性視網(wǎng)膜色素變性、視力受損、先天性耳聾為之一表現(xiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病，具較強(qiáng)遺傳異質(zhì)性，以其發(fā)現(xiàn)者英國眼科醫(yī)生CharlesUsher命名。Usher綜合征在美國和歐洲的發(fā)病率約為4.4/100，000［1］，中國的發(fā)病率約為0.03%［2］。眼科癥狀臨床上表現(xiàn)為夜盲，暗光線下視力障礙，行走困難，伴視力漸進(jìn)性喪失，視野縮小，直至管狀/隧道狀視野?；颊咄砥谝曞F細(xì)胞受累病變、死亡，中央視力喪失、失明［3］。耳科癥狀表現(xiàn)為先天性雙耳感音神經(jīng)性聾，步態(tài)不穩(wěn)。Usher綜合征為常染色體隱性遺傳單基因遺傳病。目前已克隆了發(fā)表率最高的亞型UsherIB疾病基因MYO7A和USH2A［4，5］。迄今為止Usher綜合征疾病尚無有效藥物或手術(shù)等治療干預(yù)方法，對病人服務(wù)仍以咨詢或?qū)ΠY治療為主。治療干預(yù)乏力的原因在于對該病的病因和病理機(jī)制缺乏深入系統(tǒng)的研究［6,7］。本研究通過全外顯子組測序，在一個2代3人的Usher綜合征家系中找到兩個MYO7A基因新的復(fù)合雜合突變位點，研究結(jié)果報告如下。1對象與方法1.1臨床資料收集一個中國漢族北方地區(qū)Usher綜合征家系，2代共3人，其中1人為患者。本研究經(jīng)四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，對患者進(jìn)行知情告知并簽署知情同意書。檢測項目及診斷標(biāo)準(zhǔn)：眼科檢查：眼底檢查。視網(wǎng)膜功能檢查：視野、多焦視網(wǎng)膜電圖(mfERG)?；颊攥F(xiàn)25歲，診斷為視網(wǎng)膜色素變性疾病，12歲表現(xiàn)有夜盲，現(xiàn)視野狹窄。眼底檢查發(fā)現(xiàn)視盤呈蠟黃色萎縮。視覺電生理ERG電位反應(yīng)低。1.2基因組DNA制備采集家系成員外周靜脈血5ml，QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。-20C分裝保存。1.3全外顯子組測序先證患者DNA樣本超聲斷裂，純化后兩端加上序列通用接頭構(gòu)建文庫，文庫加載到測序芯片F(xiàn)lowcell上，進(jìn)行外顯子測序分析。測序覆蓋20784個基因和201121個外顯子。原始數(shù)據(jù)由IlluminabasecallingSoftware1.7分析組裝。1.4測序數(shù)據(jù)分析將測序獲得的variants進(jìn)行過濾后，剩余的variants再經(jīng)dbSNP137數(shù)據(jù)庫、1000Genomeproject數(shù)據(jù)庫、YH數(shù)據(jù)庫、HapMapProject、BroadExac數(shù)據(jù)庫進(jìn)行進(jìn)一步過濾，去除非致病基因。得到的variants經(jīng)預(yù)測軟件SIFT和Polyphen2分析，評估突變位點引起的氨基酸改變對蛋白功能的影響，得到候選突變位點。1.5致病基因家系樣本測序驗證對上述可能的致病基因突變位點，設(shè)計引物，Sanger測序在3個家系成員中進(jìn)行測序驗證。2結(jié)果2.1患者臨床表現(xiàn)先證者先天耳聾。12歲表現(xiàn)有夜盲，現(xiàn)視野狹窄（圖1）。眼底檢查發(fā)現(xiàn)視視網(wǎng)膜游色素沉著，視覺電生理ERG電位反應(yīng)低（圖1）。mfERG顯示視網(wǎng)膜周邊區(qū)域a，b波降低（圖1）。該家系共有成員3名，父母2人，子女1名。其中，父母均正常，無視網(wǎng)膜色素變性疾病的臨床特征，兒子為先證者。遺傳模式為常染色體隱性遺傳。家系圖見圖2。圖2.家系圖和Sanger測序結(jié)果。方形表示男性，圓形表示女性，黑色表示為患者，M1：NM_001127180，c.6234+5G>A；M2：NM_001127180，c.3695_3705del。2.2外顯子測序數(shù)據(jù)分析對患者進(jìn)行全外顯子組測序，平均測序深度為58x。編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了20325個SNP位點及401和426個編碼Indelso重點對非同義突變位點、剪接位點突變，插入和缺失移碼突變位點進(jìn)行分析，并過濾dbSNP137數(shù)據(jù)庫、1000GenomeProject數(shù)據(jù)庫、HapMapproject數(shù)據(jù)庫、BroadExacdatabase數(shù)據(jù)庫、炎黃基因組數(shù)據(jù)庫中存在的突變位點。此家系為常染色體隱性遺傳模式，致病突變位點可為純合突變或復(fù)合雜合突變。上述篩選步驟后還剩下25個編碼區(qū)variants。此家系中候選基因MYO7A移碼突變NM_001127180，c.3695_3705del，p.R1232fs和變異性剪切位點NM_001127180，c.6234+5G>A符合此家系遺傳模式，是該家系候選致病基因。2.3MYO7A突變位點驗證為了驗證MYO7A移碼突變c.3695_3705del，p.R1232fs和變異性剪切位點NM_001127180,c.6234+5G>A是該家系的致病基因突變，我們設(shè)計了擴(kuò)增該突變位點的PCR引物，用于擴(kuò)增突變位點上下游300bp的靶序列。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳純化后Sangar測序，對DNA樣本進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果與人類基因組參考序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)患者攜帶復(fù)合雜合突變c.3695_3705del，p.R1232fs和變異性剪切位點NM_001127180，c.6234+5G>A，而其父攜帶有變異性剪切位點NM_001127180，chr11：76922982，其母攜帶移碼突變c.3695_3705del，p.R1232fs（見圖2）o驗證結(jié)果符合常染色體隱性遺傳模式。進(jìn)一步在1000例正常對照樣本中進(jìn)行此兩個突變位點驗證，未發(fā)現(xiàn)有任一突變位點。兩個突變均導(dǎo)致移碼突變，截斷的MYO7A蛋白，嚴(yán)重影響蛋白功能。因此，MYO7A基因復(fù)合雜合突變c.3695_3705del，p.R1232fs和變異性剪切位點NM_001127180，chr11：76922982是造成該家系Usher綜合征的遺傳學(xué)病因。3討論本研究通過全外顯子組測序技術(shù)分析了一個中國漢族Usher綜合征的家系，發(fā)現(xiàn)MYO7A基因復(fù)合雜合突變c.3695_3705del，p.R1232fs和變異性剪切位點NM_001127180，c.6234+5G>Ao此兩個突變均導(dǎo)致移碼突變，MYO7A蛋白被截短（圖3）o圖3.本研究鑒定的兩個突變在MYO7A基因上的位置示意圖。MYO7A基因編碼含49個外顯子的mRNA，已有多個已知突變位點被鑒定［8］。但使用Sanger測序法對49個外顯子進(jìn)行逐一測序篩選效率低下，花費(fèi)較大。我們選用高通量的二代測序技術(shù)（nextgenerationsequencing，NGS）對患者DNA樣本做全外顯子組測序，以篩選致病突變。二代測序技術(shù)能夠以較低的費(fèi)用快速分析人類基因組編碼區(qū)域，已經(jīng)廣泛用于遺傳性眼科疾病研究中［9］。二代測序技術(shù)用于視網(wǎng)膜色素變性疾病的研究目前在國內(nèi)外已經(jīng)比較多見，比如最近報道的SLC7A14［10］及10q22.1上的新RP致病基因［11］等，都是通過二代測序技術(shù)鑒定出來的新的視網(wǎng)膜色素變性致病基因或位點。相信通過此技術(shù)，越來越多的視網(wǎng)膜色素變性致病基因?qū)⒈昏b定出來，為臨床的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。本研究報道了一個中國漢族人Usher綜合征疾病家系，運(yùn)用全外顯子組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了MYO7A基因復(fù)合雜合突變NM_001127180，c.6234+5G>A和c.3695_3705del，p.R1232fs。此兩個位點在該家系中與疾病共分離，是該家系的遺傳學(xué)病因。本研究豐富了MYO7A的致病突變譜，為該病的遺傳篩查和分子診斷提供了依據(jù)。參考文獻(xiàn)：HaimM.EpidemiologyofretinitispigmentosainDenmark[J].ActaOphthalmolScandSuppl,2002，(233)：1-34.胡誕寧.幾種主要眼遺傳病在我國的發(fā)病情況與遺傳規(guī)律[J].遺傳學(xué)報，1988，15(3)：231-236.HartongDT，BersonEL，DryjaTP.Retinitispigmentosa[J].Lancet，2006，368(9549)：1795-1809.WeilD，BlanchardS，KaplanJ，etal.DefectivemyosinVIIAgeneresponsibleforUshersyndrometype1B.Nature，1995，374：60-61，.WeilD，KusselP，BlanchardS，etal.Theautosomalrecessiveisolateddeafness，DFNB2，andtheUsher1Bsyndromeareallelicdefectsofthemyosin-VIIAgene.NatureGenet，1997，16：191-193.LopesVS，WilliamsDS.GeneTherapyfortheRetinalDegenerationofUsherSyndromeCausedbyMutationsinMYO7A.ColdSpringHarbPerspectMed.2015；5(6).pii：a017319.YanD，LiuXZ.GeneticsandpathologicalmechanismsofUshersyndrome.JHumGenet.2010；55(6)：327-35.WestonMD，KelleyPM，OverbeckLD，etal.MyosinVIIAmutationscreeningin189Ushersyndrometype1patients.AmJHumGenet，1996，59：1074-1083.NielsenR，PaulJS，AlbrechtsenA，etal.GenotypeandSNPcallingfromnext-generationsequencingdata[J].NatRevGenet，2011，12(6)：443-451.JinZB，HuangXF，LvJN，etal.SLC7A14linkedt