艾滋病、梅毒和乙肝檢測(cè)方法介紹及選擇

艾滋病、梅毒、乙肝檢測(cè)方法介紹及選擇湖北省疾病預(yù)防控制中心彭庭海2014年5月艾滋病、梅毒、乙肝--概況

艾滋病梅毒乙肝病原體HIV病毒梅毒螺旋體HBV病毒傳染源HIV感染者/AIDS梅毒患者急慢性乙肝患者和攜帶者傳播途徑血液/性/母嬰傳播性/母嬰傳播/接觸/血液血液/母嬰傳播/性預(yù)防獻(xiàn)血員篩查/高危行為改變/孕婦篩查獻(xiàn)血員篩查/高危行為改變/孕婦篩查主動(dòng)免疫與被動(dòng)免疫/孕婦篩查母嬰傳播艾滋?。杭s15～35%

HIV陽(yáng)性孕婦會(huì)發(fā)生母嬰傳播。90%以上兒童HIV感染者是由母親垂直傳播而感染。梅毒：流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或馬鞍鼻、先天性耳聾等。乙肝：在我國(guó)，人群中40-50%是由母嬰傳播積累而成。

主要內(nèi)容一.艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV抗體檢測(cè)核酸檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)二.梅毒檢測(cè)技術(shù)顯微鏡檢查法血清學(xué)檢查法三.乙肝檢測(cè)技術(shù)HBV免疫標(biāo)志物檢測(cè)HBV-DNA

一、艾滋病檢測(cè)技術(shù)HIV抗體檢測(cè)核酸檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)HIV抗體檢測(cè)篩查試驗(yàn)（包括初篩和復(fù)檢）確證試驗(yàn)（WB）HIV抗體篩查樣品

血清/血漿/全血濾紙干血斑唾液尿液篩查試劑

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)有效期內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑應(yīng)批批檢合格選擇敏感性和特異性高的試劑篩查方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)：采用發(fā)光或熒光底物，用發(fā)光或熒光儀測(cè)定結(jié)果。快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)

(1)明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)(2)免疫滲濾試驗(yàn)

(3)免疫層析試驗(yàn)(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）HIV抗體檢測(cè)試劑：檢測(cè)HIV-1/2抗體HIV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑：可同時(shí)檢測(cè)血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗體用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果四代艾滋病酶聯(lián)免疫試劑比較solidphasespecificdetectionofconjugate第一代病毒裂解液HIV-1IgG抗體HIV-1-IgG抗體第二代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2IgG抗體HIV-1/-2IgG抗體第三代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-OIgM/IgG抗體HIV-1/-2/-O病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-O第四代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24AbIgM/IgG抗體HIV-1/-2/-Op24抗原病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗體ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassayHIV抗原包被平板病人抗體酶顯色劑+ve-ve陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陰性陽(yáng)性質(zhì)控酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)客觀、結(jié)果便于記錄和保存用途：流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及臨床大量標(biāo)本的檢測(cè)(2)化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)采用發(fā)光或熒光底物既可檢測(cè)抗體，也可聯(lián)合檢測(cè)抗原抗體酶或熒光標(biāo)記的HIV抗原或抗體，加發(fā)光或熒光底物用發(fā)光儀或熒光儀測(cè)定結(jié)果全血樣品加50ul樣品于樣品墊中手指血方法靜脈血方法加一滴緩沖液15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果（3）快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn):試驗(yàn)簡(jiǎn)便快速，適用于應(yīng)急檢測(cè)、門診急診檢測(cè)。不需專門設(shè)備和人員培訓(xùn),一般可在10～30分鐘內(nèi)得出結(jié)果。缺點(diǎn):肉眼判斷較主觀、價(jià)格較貴、結(jié)果不易保存。樣品初篩試驗(yàn)一陰一陽(yáng)均陽(yáng)性反應(yīng)報(bào)告陰性確證試驗(yàn)復(fù)檢試驗(yàn)報(bào)告陰性均陰性反應(yīng)陽(yáng)性反應(yīng)原有試劑＋另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑選用篩查試劑陰性反應(yīng)HIV抗體篩查檢測(cè)流程圖HIV抗體確證試驗(yàn)確證試驗(yàn)的試劑：必須是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑。確證樣品：可采用血清、血漿、濾紙干血斑確證試驗(yàn)方法：免疫印跡試驗(yàn)(WB)、條帶免疫試驗(yàn)(LIATEKHIVⅢ)、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)及免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。國(guó)內(nèi)常用的確證試驗(yàn)方法是WB。HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果a強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照（HIV-1和HIV-2）b弱陽(yáng)性對(duì)照（HIV-1）c陰性對(duì)照d典型的HIV-2血清陽(yáng)性反應(yīng)abcdgp160gp120p66p55p51gp41p39p31P24p17

血清對(duì)照HIV-2特異帶初篩檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本兩種篩查試劑報(bào)告陰性陰性反應(yīng)一陰一陽(yáng)陽(yáng)性反應(yīng)確證試劑復(fù)檢試驗(yàn)根據(jù)具體情況進(jìn)一步檢測(cè)HIV-2報(bào)告陰性出現(xiàn)HIV-2指示條帶陰性反應(yīng)不確定反應(yīng)報(bào)告HIV-1陽(yáng)性HIV-1陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)資料，可以在4周后隨訪檢測(cè)，如帶型沒(méi)有進(jìn)展或呈陰性反應(yīng)，則報(bào)告陰性；如隨訪期間出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則報(bào)告陽(yáng)性；如隨訪期間帶型有進(jìn)展，但不滿足陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)繼續(xù)隨訪到8周。如帶型沒(méi)有進(jìn)展或呈陰性反應(yīng)則報(bào)告陰性；滿足HIV抗體陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)則報(bào)告陽(yáng)性，不滿足陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)可視情況決定是否繼續(xù)隨訪。HIV抗體確證檢測(cè)流程圖產(chǎn)時(shí)艾滋病抗體檢測(cè)及服務(wù)流程實(shí)驗(yàn)室需備有：1～2種HIV-1/2抗體ELISA（化學(xué)發(fā)光）試劑2種HIV-1/2抗體快速試劑百度“HIV抗體試劑臨床評(píng)估”HIV抗體母親HIV抗體經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒，出生時(shí)新生兒和嬰兒早期抗體陽(yáng)性，不一定是感染出生時(shí)母親的抗體，80~90%在生后9~12個(gè)月消失，出生后18個(gè)月基本上全部消失18個(gè)月后兒童HIV抗體仍然陽(yáng)性，視為自身感染產(chǎn)生的抗體18個(gè)月以下嬰幼兒的HIV診斷嬰幼兒HIV感染的抗體檢測(cè)適用于：HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒；母親HIV感染狀態(tài)不詳，兒童出現(xiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床懷疑HIV感染的兒童。嬰兒12個(gè)月時(shí)進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)

陰性排除感染，納入正常兒童保健；

陽(yáng)性者繼續(xù)追蹤隨訪，至18個(gè)月再次進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)，結(jié)果陰性排除感染。艾滋病病毒感染產(chǎn)婦所生兒童陽(yáng)陰用另一種不同原理或不同廠家生產(chǎn)的篩查試劑再次檢測(cè)12個(gè)月進(jìn)行HIV抗體篩查試驗(yàn)確證試驗(yàn)18個(gè)月時(shí)再進(jìn)行HIV抗體篩查試驗(yàn)報(bào)告HIV抗體檢測(cè)結(jié)果陰性艾滋病感染產(chǎn)婦所生兒童HIV抗體檢測(cè)流程陽(yáng)性陰性陰性陽(yáng)性用另一種不同原理或不同廠家生產(chǎn)的篩查試劑再次檢測(cè)陰性陰性陽(yáng)性報(bào)告HIV抗體檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性提供咨詢，繼續(xù)隨訪，4周后再次進(jìn)行確證試驗(yàn)不確定陽(yáng)性18個(gè)月以下嬰幼兒的HIV診斷核酸檢測(cè)HIV前病毒DNA（HIVDNA）檢測(cè)已整合到外周血液中血細(xì)胞基因組上的HIVDNA基于PCR技術(shù)高特異度(98%)和高靈敏度(>99%)18個(gè)月以下嬰幼兒的HIV診斷HIV病毒載量（HIVRNA）用來(lái)監(jiān)測(cè)已知的HIV感染病人的病毒載量試驗(yàn)；真陽(yáng)性的結(jié)果通常>100,000拷貝/毫升,而假陽(yáng)性結(jié)果<1,000拷貝/毫升RT-PCR、NASBA、CDNA、熒光定量PCR嬰幼兒HIV感染的核酸檢測(cè)可檢測(cè)HIVRNA也可檢測(cè)HIVDNA首選檢測(cè)HIVDNAHIVDNA檢測(cè)不受母親圍產(chǎn)期抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療和人乳汁中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物以及嬰幼兒預(yù)防性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的干擾考慮母親血液污染因素，不推薦使用臍帶血進(jìn)行HIV核酸檢測(cè)。嬰兒的早期診斷

HIV感染母親所生小于18個(gè)月齡的嬰兒，不同時(shí)間的兩次HIV核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性即可作出診斷。18個(gè)月齡以上兒童診斷與成人相同：有急性HIV感染綜合癥或流行病學(xué)史，且不同時(shí)間的兩次HIV核酸檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，即可診斷。HIV感染產(chǎn)婦所生嬰兒嬰兒滿3個(gè)月，再次采集血標(biāo)本，送檢盡快采集第二份血標(biāo)本，送檢出生后6周采集第一份血標(biāo)本（可制備成濾紙片干血斑（DBS），或EDTA抗凝全血），送檢繼續(xù)隨訪報(bào)告陽(yáng)性艾滋病感染產(chǎn)婦所生兒童HIV感染早期診斷檢測(cè)流程呈陰性反應(yīng)呈陽(yáng)性反應(yīng)呈陽(yáng)性反應(yīng)呈陰性反應(yīng)呈陽(yáng)性反應(yīng)盡快再次采集血樣，送檢報(bào)告陰性呈陽(yáng)性反應(yīng)呈陰性反應(yīng)呈陰性反應(yīng)嬰幼兒HIV感染的核酸檢測(cè)需要注意：不同時(shí)間“嬰兒HIV感染早期診斷”檢測(cè)均呈陰性反應(yīng)的喂哺母乳的兒童，應(yīng)在完全停止喂哺母乳后的6周和3個(gè)月（若6周時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性可盡快）再次采血進(jìn)行核酸定性檢測(cè)。兒童滿18個(gè)月后則可直接進(jìn)行抗體檢測(cè)。嬰幼兒HIV感染的核酸檢測(cè)方法

HIV-DNA1）RocheAmplicorHIV-1DNAPCR,version1.5試劑盒2）IN-HOUSE（國(guó)內(nèi)開(kāi)展，2009年檢測(cè)技術(shù)規(guī)范）AmplicorHIV-1DNA簡(jiǎn)介樣本：濾紙片干血斑、EDTA抗凝全血方法學(xué)：PCR-ELISA結(jié)果類型：定性靶物質(zhì)：感染宿主細(xì)胞中的pro-viralHIV-1DNA濾紙片干血斑將全血滴在特定的濾紙片上制備。它主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中新生兒先天性缺陷疾病的早期篩查。如：苯丙酮尿癥，先天性甲狀腺機(jī)能低下，維生素缺乏和一些感染性疾病的檢測(cè)。

濾紙片干血斑用于嬰兒HIV診斷樣本量非常小，

(20lto200l)特別適宜采集嬰兒樣本。容易收集: 指尖血、后跟血。能提取全血，血漿、血清。短期運(yùn)輸可在常溫下長(zhǎng)期可貯存在–20C樣本可在常溫下運(yùn)輸:不需要干冰DBS可作為一種無(wú)感染性材料運(yùn)輸（在美國(guó)）濾紙片的選擇

Whatman903濾紙片（可用于HIV抗體、HIV前病毒DNA和HIVRNA檢測(cè)）FTA標(biāo)準(zhǔn)卡濾紙片（可用于HIV前病毒DNA檢測(cè)）采集樣本所需要的材料血樣本采集卡片(濾紙片)；可密封的塑料袋；濕度指示卡；干燥劑（1-2g/袋）；怎樣采集末梢血DBS應(yīng)用通用的安全防護(hù)措施；清晰準(zhǔn)確地在卡片上標(biāo)記識(shí)別碼；完成針刺指尖程序；均一地使每個(gè)印圈飽和地吸附血液；

兩個(gè)充分吸附血液的印圈比五個(gè)不完全吸附的印圈要好怎樣采集抗凝靜脈血DBS靜脈血充分與EDTA混合；最好采集后立即制備干血斑；血漿與血細(xì)胞分層的全血在制備干血斑前，應(yīng)輕柔地上下顛倒采血管（避免血細(xì)胞破裂），使血液混勻后制備；用移液槍加代濾芯槍頭移取75-80ul血液；槍頭對(duì)準(zhǔn)印圈的中心緩慢將血液滴于濾紙上；避免有氣泡；怎樣干燥DBS避免觸摸或涂抹血斑；室溫空氣中水平干燥（至少4個(gè)小時(shí)）；避免陽(yáng)光直曬；在干燥過(guò)程中不允許加熱，疊加或?qū)BS接觸其他表面；在包裝前充分干燥DBS濾紙片干血斑的包裝與運(yùn)輸將完全干燥的濾紙片干血斑樣本用塑料袋進(jìn)行獨(dú)立包裝，或者用秤量紙隔開(kāi)，以避免樣本之間的污染。已獨(dú)立包裝好的樣本一起放入密封塑料袋中，加入幾包干燥劑,加入濕度指示卡。將包裝好的濾紙片干血斑，連同相應(yīng)的文件（如采樣/送樣單等）放入大信封中。密封后可郵寄運(yùn)輸。放入密封袋加入干燥劑加入濕度指示卡標(biāo)記袋中內(nèi)容物核酸檢測(cè)2次檢測(cè)陽(yáng)性可早期診斷HIV感染，如果不具備條件，也可用HIV病毒載量法來(lái)代替，2次檢測(cè)陽(yáng)性也可診斷HIV感染，18個(gè)月齡以后再做抗體檢測(cè)確認(rèn)。

HIV核酸定量檢測(cè)

通過(guò)SFDA審批的試劑盒、方法

NASBAEasyQAmplicorTaqmanbDNA340440M2000PGCD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)廣泛應(yīng)用于HIV感染者的臨床管理中，協(xié)助判斷感染者的預(yù)后、指導(dǎo)實(shí)施抗病毒治療和療效觀察以及藥物預(yù)防機(jī)會(huì)性感染等方面。CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)對(duì)于免疫功能相對(duì)較好，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)>350/mm3的艾滋病感染孕產(chǎn)婦，采用預(yù)防性抗病毒用藥方案；對(duì)于CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≤350/mm3的艾滋病感染孕產(chǎn)婦，采用治療性抗病毒用藥方案。常規(guī)CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)的方法和程序

流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法雙平臺(tái)方法單平臺(tái)方法樣品：EDTA、枸櫞酸（ACD）或肝素抗凝全血運(yùn)送條件：室溫（18～25℃）保存和運(yùn)輸樣品避免極端溫度（結(jié)冰或大于37℃）高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝樣品，并將其置于有冰袋和吸熱物質(zhì)的容器中。常規(guī)CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)的方法和程序48小時(shí)內(nèi)染色，染色后6小時(shí)內(nèi)分析；如采血后24小時(shí)內(nèi)染色，可在染色后24小時(shí)內(nèi)分析；利用CD45單克隆抗體設(shè)淋巴細(xì)胞門，可檢測(cè)放置72小時(shí)的樣品；在