第19章-核酸和蛋白質(zhì)的生物合成-PPT幻燈片

遺傳信息傳遞的中心法則轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄RNA復(fù)制蛋白質(zhì)基因就是指DNA中能編碼蛋白質(zhì)和功能RNA的特定核苷酸序列。DNARNA*DNA通過基因表達(dá)，決定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能

*DNA通過復(fù)制，將基因信息代代相傳

*RNA參與DNA遺傳信息的表達(dá)*RNA也可作為某些病毒遺傳信息的載體第一節(jié)DNA的生物合成復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化DNA生物合成過程逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式DNA損傷（突變）與修復(fù)AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

2.半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)二2.半保留復(fù)制的意義1、使親代DNA所含的信息以極高的準(zhǔn)確度傳遞給子代DNA分子。2、DNA通過復(fù)制和基因表達(dá)這兩種主要功能，決定了生物的特性和類型并體現(xiàn)了遺傳過程的相對(duì)保守性。遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。（二）雙向復(fù)制1.雙向復(fù)制的定義復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)（origin）向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制（bidirectionalreplication）

。復(fù)制中的放射自顯影圖象3.真核生物的雙向復(fù)制真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子(replicon)

。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。（三）復(fù)制的半不連續(xù)性DNA合成的方向只能是5’→3’。在DNA復(fù)制時(shí)，1條鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制，叫作前導(dǎo)鏈（leadingstrand）；而另一條鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進(jìn)方向正好相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成幾個(gè)片段（岡崎片段）合成，稱之為滯后鏈（laggingstrand）。前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而滯后鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)復(fù)制。3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)（四）復(fù)制的高保真性DNA復(fù)制的精確度極高，誤差率很低，以保證物種在維持遺傳保守性的同時(shí)，還要通過變異不斷進(jìn)化。DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性至少要依賴三種機(jī)制：1、遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；2、DNA聚合酶在復(fù)制延長中對(duì)堿基的選擇功能；3、復(fù)制出錯(cuò)時(shí)，DNA聚合酶的即時(shí)校讀功能。復(fù)制的保真性和堿基選擇?DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。二、復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化（一）復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)1.復(fù)制的反應(yīng)體系（1）底物：四種dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP（2）聚合酶：依賴DNA的DNA聚合酶，DNA-pol；（3）模板：指解開成單鏈的DNA母鏈；（4）引物：提供3’－OH末端，使dNP可以依次聚合；（5）其他酶和蛋白質(zhì)因子。2復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)在聚合酶的作用下，一個(gè)核苷酸5′-P和相鄰的核苷酸上核糖的3′-OH生成磷酸二酯鍵而逐一聚合的形成多核苷酸鏈。（dNMP）n＋dNTP→（dNMP）n+l＋ppiDNA鏈生成過程，DNA新鏈生成需引物和模板；只能從5′-端向3＇-端延長。(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

（二）參與復(fù)制的主要酶類DNA聚合酶解鏈解旋酶引物酶DNA連接酶1.DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶（DDDP）縮寫：DNA－pol活性：1.5

3

的聚合活性

2.核酸外切酶活性5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能切除RNA引物和突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。核酸外切酶活性（1）原核生物的DNA聚合酶DNA-polIDNA-polIIDNA-polⅢDNA聚合酶Ⅰ①結(jié)構(gòu)特點(diǎn)單一多肽鏈，從N端到C端有3個(gè)酶促活性結(jié)構(gòu)域依次排列：5′→3′外切酶、3′→5′外切酶和DNA聚合酶。DNAPolI在蛋白酶的作用下，可分為大、小兩個(gè)片段。小片段具有5＇→3＇外切酶活性。大片段（又稱為Klenow片段）具有聚合酶活性及3′→5′外切酶活性，它對(duì)核酸技術(shù)十分有用。323個(gè)氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

1）5′→3′聚合酶的活性：對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。2）3′→5′外切酶活性：對(duì)復(fù)制中錯(cuò)誤進(jìn)行即時(shí)校讀，保證復(fù)制的準(zhǔn)確性。3）5′→3′外切酶活性：可去除RNA引物和突變堿基。②DNA-polI在活細(xì)胞內(nèi)的功能DNA-polII5′→3’聚合酶活性3’→5′外切酶活性無5’→3’外切酶活性它只是在無polI及polⅢ的情況下才起作用，其真正的功能也未完全清楚，可能在損傷修復(fù)中有特殊作用。DNApol-Ⅲ①結(jié)構(gòu)特點(diǎn)由10種亞基（αβγδδ′εθτχψ）組成不對(duì)稱異源二聚體。核心酶（αεθ）α亞基：5′→3′聚合酶活性

ε亞基：3′→5′外切酶活性和堿基選擇功能，是復(fù)制保真性所必需

θ亞基:可能起組裝作用β亞基：夾穩(wěn)模板鏈并使酶沿模板鏈滑動(dòng)γ－復(fù)合物：促進(jìn)全酶組裝至模板及增強(qiáng)核心酶活性DNA-polⅢ(250kD)5′→3′聚合酶的活性：是在復(fù)制延長中真正催化新鏈核苷酸聚合的酶。3′→5′外切酶活性：對(duì)復(fù)制中錯(cuò)誤進(jìn)行即時(shí)校讀，保證復(fù)制的準(zhǔn)確性。②DNA-polⅢ

在活細(xì)胞內(nèi)的功能催化DNA聚合參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補(bǔ)空隙功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞1011亞基數(shù)－－+5

外切酶活性+++

5

外切酶活性+++5

聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶（2）．真核生物的DNA聚合酶DNA－polα，β，γ，δ，ε。DNA－po1δ：延長領(lǐng)頭鏈和隨從鏈；DNA—poIα：合成RNA引物；DNA－polε：校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口。DNA—polβ：在沒有其他DNA－pol時(shí)發(fā)揮催化功能。DNA—po1γ：催化線粒體DNA真核生物的DNA聚合酶

真核生物的DNA聚合酶2.與復(fù)制起始及解鏈解旋相關(guān)的酶類在復(fù)制起始時(shí)需要多種酶和蛋白因子，共同起解開、理順DNA鏈，維持DNA在一段時(shí)間內(nèi)處于單鏈狀態(tài)的作用。DnaA蛋白DnaA蛋白是由相同亞基組成的四聚體。復(fù)制起始時(shí)，DnaA蛋白辨認(rèn)并結(jié)合E.coli上復(fù)制起始點(diǎn)oriC，10~20個(gè)DnaA蛋白相互靠近形成DNA蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，促使oriC局部解鏈（2）DnaB蛋白解螺旋酶、復(fù)制蛋白rep，利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。DnaBDnaC解鏈方向DnaC蛋白DnaC蛋白的作用是將具有解鏈酶活性的DnaB蛋白運(yùn)送到復(fù)制模板，并協(xié)同DnaB蛋白的作用GATCTNTTNTTTTTATCCACA解鏈過程中，DNA分子會(huì)過度擰緊、打結(jié)、纏繞、連環(huán)等現(xiàn)象。（2

）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoisomerase）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，改變DNA分子構(gòu)象，理順DNA鏈，使復(fù)制能順利進(jìn)行。分類：拓?fù)涿涪窈屯負(fù)涿涪蜃饔锰攸c(diǎn)：對(duì)DNA分子的作用是既能水解，又能連接磷酸二酯鍵。DNA分子一邊解鏈，一邊復(fù)制，拓?fù)涿甘窃趶?fù)制全過程中都是有作用的。作用機(jī)制

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。2．單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）

的作用是在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。模板的DNA總要處于單鏈狀態(tài)，而DNA分子只要符合堿墓配對(duì)，又總會(huì)有形成雙鏈的傾向，以使分子達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)和免受胞內(nèi)廣泛存在的核酸酶降解。3引物酶DNA聚合酶不能從頭合成DNA鏈，只能延長已有的DNA或RNA引物鏈。引物酶（primase）在復(fù)制起始時(shí)催化引物（primer）合成，提供3

-OH末端，使DNA-pol能夠催化dNTP聚合。引物酶屬DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，但不同于催化轉(zhuǎn)錄過程的RNA聚合酶。在E.coli，引物酶是dnaG基因的產(chǎn)物DnaG。4DNA連接酶（DNAligase）

連接DNA鏈3′-OH末端和相鄰DNA鏈的5′－P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連成完整的鏈。特點(diǎn)：連接酶連接堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上的雙鏈中的單鏈缺口，它并沒有連接單獨(dú)存在的DNA單鏈或RNA單鏈的作用。功能：在復(fù)制中起最后接合缺口的作用，在DNA修復(fù)、重組、剪接中也起縫合缺口作用，也是基因工程的重要工具酶之一。三種酶催化生成磷酸二酯鍵的比較三DNA生物合成過程（一）、原核生物DNA生物合成復(fù)制的起始復(fù)制的延長復(fù)制的終止1.復(fù)制的起始DNA解鏈引發(fā)體的形成并合成引物超螺旋的轉(zhuǎn)型DnaA蛋白辨認(rèn)起始點(diǎn),形成起始復(fù)合物DnaB蛋白解螺旋DnaC蛋白協(xié)助DnaB在多種蛋白質(zhì)參與下，DNA解開成單鏈HU蛋白促進(jìn)起始SSB維持單鏈穩(wěn)定引物的合成DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶OHSSB3

5

3

5

引物酶OH含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

引發(fā)體的蛋白質(zhì)部分在DNA鏈上可以移動(dòng)，并需由ATP供給能量。引發(fā)體到達(dá)適當(dāng)位置就可按照模板的配對(duì)序列，催化NTP（不是dNTP）的聚合，生成引物。DNA復(fù)制是半不連續(xù)，一股鏈?zhǔn)强梢赃B續(xù)進(jìn)行的，另一股鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)復(fù)制的，在不連續(xù)復(fù)制的鏈上，引發(fā)體需多次生成。3超螺旋的轉(zhuǎn)型解鏈將導(dǎo)致下游發(fā)生打結(jié)現(xiàn)象或DNA超螺旋的其他部分過度擰轉(zhuǎn)。拓?fù)涿竿ㄟ^切斷、旋轉(zhuǎn)和再連結(jié)的作用，實(shí)現(xiàn)DNA超螺旋的轉(zhuǎn)型，即把正超螺旋變?yōu)樨?fù)螺旋。實(shí)驗(yàn)證明，負(fù)超螺旋比正超螺旋有更好的模板作用。復(fù)制起始的過程1．DnaA蛋白辨認(rèn)結(jié)合oriC的重復(fù)序列，并與DNA形成復(fù)合物，引起解鏈；2．DnaB在DnaC的輔助下結(jié)合于初步打開的雙鏈，并用其解螺旋酶活性開鏈；3．拓?fù)涿竿ㄟ^切斷、旋轉(zhuǎn)和再連結(jié)的作用，實(shí)現(xiàn)DNA超螺旋的轉(zhuǎn)型；4．SSB結(jié)合在已開鏈的DNA模板上，使DNA在一定的范圍內(nèi)保持開鏈狀態(tài)。5．引物酶介入，形成的引發(fā)體，可按照模板的配對(duì)序列，催化NTP的聚合，生成引物。脫氧單核苷酸逐個(gè)加入而延長DNA新鏈，其化學(xué)反應(yīng)本質(zhì)是生成磷酸二酯鍵。催化此反應(yīng)的酶：原核生物：DNA-polⅢ真核生物：DNA-polα—只合成引物

DNA-polδ—催化連續(xù)復(fù)制2復(fù)制的延長復(fù)制延長的生化過程復(fù)制起始時(shí)，母鏈即已解開，兩股單鏈都是模板，其作用是按堿基配對(duì)規(guī)律指引核苷酸加入到新鏈。每次加入的單個(gè)核苷酸，都是以dNTP為原料，復(fù)制時(shí)子鏈從5’向3’延長。復(fù)制延長速度相當(dāng)快。E.coli每秒鐘能加入的核苷酸數(shù)達(dá)2500個(gè)。2.復(fù)制的半不連續(xù)性和岡崎片段復(fù)制方向與解鏈方向不一致可以理解不連續(xù)復(fù)制的成因領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制順著解鏈方向而生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為前導(dǎo)鏈（leadingstrand)。隨從鏈不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的方向與解鏈方向相反生成的子鏈稱為隨從鏈（

laggingstrand）。隨從鏈的復(fù)制必須等待模板鏈解開至足夠長度，才能從5′→3‘方向生成引物然后復(fù)制。隨從鏈在延長時(shí)，又要等到下一段暴露出足夠長而度的模板，再次生成引物而延長。這就是不連續(xù)復(fù)制。岡崎片段隨從鏈不連續(xù)復(fù)制的片段稱為岡崎片段，其大小在1000～2000個(gè)核苷酸。每一個(gè)不連續(xù)復(fù)制的片段5’-端都帶有一個(gè)RNA引物。片段的復(fù)制完成后，RNA引物會(huì)被除去而代之以DNA片段，因此復(fù)制至最后，兩股子鏈都是DNA鏈。5

3

解鏈方向5’3’5’岡崎片段在同一個(gè)復(fù)制叉上，前導(dǎo)鏈的復(fù)制先于后隨鏈，但兩鏈?zhǔn)窃谕籇NApolⅢ催化下進(jìn)行。即隨從鏈的模板可折疊或環(huán)繞成環(huán)狀，與前導(dǎo)鏈正在延長的區(qū)域?qū)R，使領(lǐng)頭鏈和隨從鏈的生長點(diǎn)都處在DNApolⅢ催化位點(diǎn)上。解鏈方向就是酶的前進(jìn)方向，也是復(fù)制叉延伸方向。復(fù)制延長簡圖1.DNA聚合酶把新生鏈的第一個(gè)脫氧核苷酸加到引物的3′-OH上，開始新生鏈的合成過程。AG

T

AC

TA

A

T

DNA聚合酶ACGACGTT引物TAG

T

AC

TA

A

T

AGCGACGGTTTT

組成

DNA的脫氧核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來3′,5′-磷酸二酯鍵引物AG

T

AC

TA

A

T

GCGACGGTTTTA引物AG

T

AC

TA

A

T

GCGACGTTGTTA引物AG

T

AC

TA

A

T

GCGACTGTTAA引物AG

T

AC

TA

A

T

GCGACGGTTAAT引物AG

T

AC

TA

A

T

GCGACGGTTAATA引物AG

T

AC

TA

A

T

GCGCGGTTAATAT引物AG

T

AC

TA

A

T

GGCGGTTAATATC引物AG

T

AC

TA

A

T

GGCGGTTAATATCDNA模板鏈DNA新鏈引物（三）復(fù)制的終止原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。復(fù)制的起始點(diǎn)和終止點(diǎn)剛好把環(huán)狀DNA分為兩個(gè)半圓，兩個(gè)方向各進(jìn)行180，同時(shí)在終止點(diǎn)匯合。為了定位方便，習(xí)慣把E.coli的DNA分為100等分。E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC在82位點(diǎn)，復(fù)制終點(diǎn)ter（termination）在32位點(diǎn)。

E．coli基因圖oriter

E.coli8232oriC5

5

DNA-polⅠ5

OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

P5

5

ATP

ADP+PiDNA連接酶隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接真核生物的DNA生物合成DNA合成(synthesis)期人為分成起始、延長、終止三個(gè)階段哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期G1G2SM（一）復(fù)制的起始真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。（二）復(fù)制的延長3

5

5

3

前導(dǎo)鏈3

5

親代DNA滯后鏈引物核小體（三）復(fù)制的終止染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?維持DNA復(fù)制的完整性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。?末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶(telomerase)的組成端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

端粒和端粒酶的生物學(xué)意義端粒特別是端粒酶的活性與細(xì)胞的生長、繁殖、衰老凋亡以及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。端粒的平均長度隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長而逐漸變短至消失，可導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致細(xì)胞衰老凋亡。體細(xì)胞幾乎沒有端粒酶活性，隨多次細(xì)胞分裂端粒逐漸縮短，細(xì)胞失去增殖能力。而端粒酶活性較高的胚原細(xì)胞，端粒長度未縮短。腫瘤細(xì)胞端粒酶重新獲得活性，以維持端粒結(jié)構(gòu)致使染色體穩(wěn)定而成為永生細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞的端粒比正常人同類細(xì)胞顯著縮短。DNA損傷（突變）與修復(fù)（一）突變的定義（二）突變的意義（三）引發(fā)突變的因素（四）突變的分子改變類型（五）

DNA損傷的修復(fù)（一）突變的定義個(gè)別脫氧核糖核苷酸殘基甚至片段DNA在構(gòu)成、復(fù)制或表型功能上的異常變化，稱為突變（Mutation），也稱為DNA損傷（DNAdamage）。遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變引起遺傳信息的改變（二）突變的意義（－）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)自發(fā)突變或自然突變（二）突變導(dǎo)致基因型改變多態(tài)性：個(gè)體之間的基因型差別。（三）突變導(dǎo)致死亡突變發(fā)生在對(duì)生命過程至關(guān)重要的基因上，可導(dǎo)致個(gè)體、細(xì)胞的死亡。（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)有害的突變（三）引發(fā)突變的因素（一）自發(fā)突變（二）誘發(fā)突變1．物理因素：主要指紫外線和各種輻射，如紫外線可引起DNA鏈上相鄰的兩個(gè)嘧啶堿基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，生成嘧啶二聚體。2．化學(xué)因素：化工原料、化工產(chǎn)品和副產(chǎn)品，各種工業(yè)的排放物、農(nóng)藥、食品防腐劑或添加劑，以至汽車排放的廢氣。嘧啶二聚體的形成與解聚（四）突變的分子改變類型錯(cuò)配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

錯(cuò)配（mismatch）DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變(pointmutation)。點(diǎn)突變發(fā)生在基因的編碼區(qū)域，可導(dǎo)致氨基酸的改變。

1.轉(zhuǎn)換：發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。2.顛換：發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。缺失、插入和框移突變?nèi)笔В阂粋€(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間?？蛞仆蛔儯喝?lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變，其后果是翻譯出的蛋白質(zhì)可能完全不同。谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變重排（rearrangementDNA分子內(nèi)發(fā)生較大片段的交換，稱為重組或重排。移位的DNA可以在新位點(diǎn)上顛倒方向反置（倒位），也可以在染色體之間發(fā)生交換重組。（五）DNA損傷的修復(fù)（DNArepairing修復(fù)是指針對(duì)已發(fā)生了的缺陷而施行的補(bǔ)救機(jī)制。修復(fù)的主要類型：光修復(fù)(lightrepairing)切除修復(fù)(excisionrepairing)重組修復(fù)(recombinationrepairing)SOS修復(fù)光修復(fù)光修復(fù)過程是通過光修復(fù)酶（photolyase）催化而完成的，僅需300～600nm波長照射即可活化，普遍存在于各種生物，人體細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。通過此酶作用，可使嘧啶二聚體分解為原來的非聚合狀態(tài)，DNA完全恢復(fù)正常光修復(fù)酶(photolyase)

UV切除修復(fù)（excisionrepairing）細(xì)胞內(nèi)最重要的修復(fù)機(jī)制，包括去除損傷DNA，填補(bǔ)空隙和連接。1、原核生物DNA損傷修復(fù)：UvrA，UvrB辨認(rèn)及結(jié)合DNA損傷部位；UvrC在解螺旋酶的協(xié)助下切除損傷部位。DNA-polⅠ和連接酶填補(bǔ)空隙和連接。2、真核生物DNA損傷修復(fù)：XP類蛋白辨認(rèn)和切除損傷DNA部位，切除后留下的空隙，則由DNA-polδ及ε加以修復(fù)。

E.coli的切除修復(fù)方式UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHPDNA連接酶ATP重組修復(fù)（recombinationrepairing）當(dāng)DNA分子的損傷面較大，還來不及修復(fù)完善就進(jìn)行復(fù)制時(shí)，損傷部位因無模板指引，復(fù)制出來的新子鏈會(huì)出現(xiàn)缺口，這時(shí)，就靠重組蛋白R(shí)ecA的核酸酶活性將另一股健康的母鏈與缺口部分進(jìn)行交換，以填補(bǔ)缺口。損傷鏈移到己完成復(fù)制的鏈上，如果損傷又只發(fā)生在雙鏈DNA中的一股單鏈，則下一輪的復(fù)制損傷鏈就只占DNA的1／4，不斷復(fù)制后，其比例就越來越低，稱為把損傷鏈“稀釋”掉。SOS修復(fù)是一類應(yīng)急性的修復(fù)方式。由于DNA損傷廣泛至難以繼續(xù)復(fù)制，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。在E.coli，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組成一個(gè)稱為調(diào)節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。特點(diǎn)：反應(yīng)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選擇能力差。通過SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而，DNA保留的錯(cuò)誤會(huì)較多，引起較廣泛、長期的突變。第二節(jié)RNA的生物合成（轉(zhuǎn)錄）一、DNA指導(dǎo)下的RNA的合成二、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工三、在RNA指導(dǎo)下RNA和DNA的合成一、DNA指導(dǎo)下的RNA的合成定義：RNA的生物合成就是轉(zhuǎn)錄，即以DNA為模板，在依賴于DNA的RNA聚合酶的催化下，以4種NTP（ATP、CTP、GTP和UTP為原料，合成RNA的過程。合成部位：細(xì)胞核合成原料：四種NTP（一）DNA指導(dǎo)RNA聚合酶定義：以DNA為模板，催化三磷酸核苷（NTP）聚合形成RNA的酶。作用特點(diǎn)：DNA為模板不需引物，兩游離NTP或一游離NTP與RNA鏈聚合.3'-OH與5'-P聚合形成磷酸二酯鍵。方向：5'→3'。核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)

核心酶:轉(zhuǎn)錄延長;全酶：轉(zhuǎn)錄起始。σ70是辨認(rèn)典型轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的蛋白質(zhì)。σ32是辨認(rèn)熱休克蛋白(Hsp)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的蛋白質(zhì)。RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合（啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子）啟動(dòng)子(promoter):RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。轉(zhuǎn)錄因子：RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄需要的輔助因子。RNA聚合酶保護(hù)法開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物啟動(dòng)子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因3

3

原核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：一致性序列(concensus保守序列)：堿基序列相對(duì)穩(wěn)定，不易發(fā)生突變。TTGACA：-35區(qū)，RNA聚合酶的辨認(rèn)位點(diǎn)，σ亞基結(jié)合位點(diǎn)。TATAAT：-10區(qū)，Pribrow盒，RNA聚合酶的穩(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)。β'亞基的結(jié)合位點(diǎn)。（三）終止子和終止因子終止子：提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的DNA序列終止因子：協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子（nusA）通讀：抗終止因子：終止信號(hào)位于：莖環(huán)結(jié)構(gòu)終止轉(zhuǎn)錄的機(jī)理使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；末端polyU

使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5′pppG53

35RNA-pol1.非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止

DNA模板近終止處，有特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)終止轉(zhuǎn)錄。發(fā)夾結(jié)構(gòu)：反向堿基互補(bǔ)序列末端PolyU：U:A不穩(wěn)定.ATP2.依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止：具有控制轉(zhuǎn)錄終止作用的蛋白質(zhì)因子。

機(jī)制：Rho因子與RNA3’-OH的polyC結(jié)合，抑制聚合酶活性，激活解螺旋活性。45S-rRNA，5S-rRNA：核糖體RNA成分。

hnRNA：mRNA的前體。

snRNA：參與mRNA剪切。真核生物的RNA聚合酶

CAAT盒

GC盒增強(qiáng)子順式作用元件結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列461(四)轉(zhuǎn)錄過程

TheProcessofTranscriptionRNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延長階段5

3

RNA啟動(dòng)子終止子RNA聚合酶

5

3

5

5

3

離開轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問題：RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。轉(zhuǎn)錄起始過程：

辨認(rèn)起始位點(diǎn)：

亞基辨認(rèn)啟動(dòng)子的-35區(qū)，RNA聚合酶全酶(2)與模板疏松結(jié)合。酶滑行到-10區(qū)，通過亞基與模板牢固結(jié)合。

2.DNA雙鏈解開:

RNA聚合酶擠入DNA雙鏈中，解鏈長度約20個(gè)核苷酸，拓?fù)洚悩?gòu)酶參與。

3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。RNApol(

2

)-DNA-5'pppGpN-OH3

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:

RNA聚合酶-DNA模板-四磷酸二核苷酸5

-pppG-OH+NTP

5

-pppGpN-OH3

+ppi轉(zhuǎn)錄延長1.

亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。(NMP)n+NTP

(NMP)n+1

+PPi3.轉(zhuǎn)錄空泡的形成：

DNA解開的兩條單鏈與RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。3′3′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動(dòng)方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長部位模板鏈(templatestrand)反義鏈

DNA雙鏈中，能按堿基配對(duì)規(guī)律指引轉(zhuǎn)錄，生成RNA的一股單鏈。編碼鏈(codingstrand)有義鏈

DNA雙鏈中堿基序列與RNA一致的一股鏈。反義核酸：以編碼鏈為模板合成的核酸，稱為反義核酸（反義RNA、反義DNA）。

序列與模板鏈一致，能抑制mRNA表達(dá)。5

3

模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄。模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體5

3

DNARNARNA聚合酶依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止RNA聚合酶在DNA模板上停止前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落。

轉(zhuǎn)錄終止1、轉(zhuǎn)錄單位：啟動(dòng)子終止子2、不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄：兩條DNA鏈不同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象。編碼鏈或反意義鏈；模板鏈或有意義鏈3、RNA聚合酶：轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)：全酶：有αα‘ββ’σ5個(gè)亞基組成作用識(shí)別啟動(dòng)子，引發(fā)RNA的合成。核心酶：不含σ亞基，延長RNA鏈二、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工原核生物中rRNA前體的加工甲基化作用專一核酸內(nèi)切酶30S前體17StRNA25S專一核酸外切酶16SrRNA23SrRNA5SrRNA專一核酸外切酶二、tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA前體RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNARNAaseP、內(nèi)切酶5’前導(dǎo)序列：RNAaseP

中部內(nèi)含子：內(nèi)切酶tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、連接酶ATPADP堿基修飾（2）還原反應(yīng)如：UDHU（3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)如：Uψ（4）脫氨反應(yīng)如：A

I如：AAm（1）甲基化真核細(xì)胞mRNA的加工

5′端接上一個(gè)“帽子”(CAP)結(jié)構(gòu)

3′端添加PolyA“尾巴”,由RNA末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化

剪接：剪去內(nèi)含子(intron)，拼接外顯子(extron斷裂基因(splitegene)：真核生物基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔,又連續(xù)鑲嵌而成，這些基因稱為斷裂基因。CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)三、在RNA指導(dǎo)下RNA和DNA的合成（一）RNA的復(fù)制（二）RNA的逆轉(zhuǎn)錄（二）

逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式1逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過程。此過程中，核酸合成與轉(zhuǎn)錄（DNA→RNA）過程遺傳信息的流動(dòng)方向相反（RNA→DNA），故稱為逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription)。逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA病毒的基因組是RNA而不是DNA，其復(fù)制方式是逆轉(zhuǎn)錄，故稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）。病毒基因的整合可能是病毒致癌的重要方式。逆轉(zhuǎn)錄酶

能催化以單鏈RNA為模板合成雙鏈DNA的反應(yīng)的酶稱為逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase)。它兼有三種酶的活性：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶和RNaseH活性。逆轉(zhuǎn)錄酶和其他DNA聚合酶一樣，合成DNA的方向?yàn)?′→3＇，并且不能從頭合成DNA，也需要引物，是病毒本身的一種tRNA。RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA2逆轉(zhuǎn)錄過程逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNA3逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象的生物學(xué)意義（1）逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。（2）對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了病毒致癌理論。（3）分子生物學(xué)研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶（cDNA法)，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一。四、基因工程簡介

基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術(shù)的方法，把DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外源基因DNA在宿主細(xì)胞中，隨細(xì)胞的繁殖而增殖（cloning，克?。?，或最后得到表達(dá)，最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfection

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、體外基因重組

目的基因的制備

載體的構(gòu)建：質(zhì)粒或噬菌體

目的基因與載體重組2、重組體DNA的轉(zhuǎn)化增殖和表達(dá)

轉(zhuǎn)化

篩選

增殖和基因表達(dá)五、PCR技術(shù)原理示意圖靶序列變性和引物復(fù)性循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3變性和引物復(fù)性鏈延伸Tag酶鏈延伸第三節(jié)蛋白質(zhì)的生物合成一、蛋白質(zhì)生物合成體系二、蛋白質(zhì)生物合成過程三、蛋白質(zhì)合成后加工和輸送一、蛋白質(zhì)生物合成體系參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)翻譯模板mRNA及遺傳密碼核蛋白體是肽鏈合成的裝置tRNA與氨基酸的活化（一）參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)包括：三種RNA20種氨基酸（AA）作為原料酶及眾多蛋白因子，如IF、eIF

ATP、GTP、無機(jī)離子（二）翻譯模板mRNA及遺傳密碼

遺傳學(xué)將編碼一個(gè)多肽的遺傳單位稱為順反子(cistron)。

原核生物的一段mRNA常常編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，這種mRNA被稱為多順反子（polycistron）。

真核生物的一段mRNA常常只能編碼一條多肽鏈，這種mRNA被稱為單順反子（singlecistron）。mRNA分子上從5

至3

方向，由AUG開始，每3個(gè)核苷酸為一組，決定肽鏈上某一個(gè)氨基酸或蛋白質(zhì)合成的起始、終止信號(hào)，稱為三聯(lián)體密碼（tripletcode）

起始密碼（initiationcoden）:AUG

終止密碼（terminationcoden）:UAA，UAG，UGAUCAGUCAGUCAGUCAG遺傳密碼的特點(diǎn)：1、連續(xù)性（Commaless）移碼突變（框移突變）2、簡并性（Degeneracy）色氨酸和甲硫氨酸3、擺動(dòng)性

（Wobble）密碼子與反密碼子配對(duì)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不遵從堿基配對(duì)規(guī)律的情況，稱為遺傳密碼的擺動(dòng)現(xiàn)象4、通用性（Universal）反密碼子第一位堿基密碼子第三位堿基IUGA,C,UA,GU,CAUC123從mRNA5

端起始密碼子AUG到3

端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈，稱為開放閱讀框架(openreadingframe,ORF)。三、核蛋白體是肽鏈合成的裝置原核生物真核生物核蛋白體小亞基大亞基核蛋白體小亞基大亞基S70S30S50S80S40S60SrRNA16S-rRNA5S-rRNA23S-rRNA18S-rRNA28SrRNA5SrRNA5.8SrRNA蛋白質(zhì)21種34種33種49種不同細(xì)胞核蛋白體的組成原核生物翻譯過程中核蛋白體結(jié)構(gòu)模式:A位：氨基酰位(aminoacylsite)P位：肽酰位(peptidylsite)E位：排出位(exitsite)三、核蛋白體是肽鏈合成的裝置（1）P位：即肽位(peptidylsite)，或給位，在延長成肽之后，3′端連接肽鏈的肽酰tRNA占據(jù)的位置，肽鏈轉(zhuǎn)位至此，延長繼續(xù)。

（2）A位：即氨基酰位(aminoacylsite)，或稱受位，每次延長，氨基酰tRNA就加入到A位上，延長成肽中，此位因接受肽?；湥拭芪?。

（3）E位：排出位(exitsite)（四）tRNA與氨基酸的活化氨基酸+tRNA氨基酰-tRNAATP

AMP＋PPi氨基酰-tRNA合成酶氨基酸＋ATP-E—→氨基酰-AMP-E＋PPi

氨基酰-AMP-E＋tRNA氨基酰-tRNA＋AMP＋E氨基酰tRNA的表示方法氨基酰-tRNA書寫規(guī)則：aa-tRNAaa；Arg-tRNAArg原核生物：起始密碼（AUG）

——編碼N-甲酰甲硫氨酸

fMet、tRNAifMet，

fMet-tRNAifMet；真核生物：起始密碼（AUG）——編碼甲硫氨酸Met、Met-tRNAiMet；翻譯過程：密碼（AUG）

——編碼甲硫氨酸Met、Met-tRNAMet。二、蛋白質(zhì)生物合成過程翻譯的起始翻譯的延伸翻譯的終止（一）肽鏈合成起始

1.原核生物翻譯起始復(fù)合物形成核蛋白體大小亞基分離；mRNA在小亞基定位結(jié)合；起始氨基酰-tRNA的結(jié)合；核蛋白體大亞基結(jié)合。（1）核蛋白體亞基分離大小亞基解離核糖體70S+IF3+IF130S小亞基.IF3.IF1+50S大亞基（促解離）（促IF3作用）（2）mRNA在小亞基定位結(jié)合S-D序列：在翻譯起始密碼子AUG的上游，相距約8—13個(gè)核苷酸處，有一段由4-9個(gè)核苷酸組成的富含嘌呤的序列。這一序列以AGGA為核心，因其發(fā)現(xiàn)者是Shine-Dalgarno而得名。mRNA上的S-D序列又稱為核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)。原核生物核蛋白體小亞基上的16S-rRNA近3’-末端處，有一段短序列…UCCU…是與S-D序列互補(bǔ)的。進(jìn)入起始密碼位置

fMet-tRNA+IF2+GTP小亞基上就位（IF1協(xié)助）（嚴(yán)格）（3）fMet-tRNA的結(jié)合（4）核蛋白體大亞基結(jié)合+50S大亞基mRNA+fMet-tRN