腦室注射神經(jīng)生長因子對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)再生的影響及其與頸曲應(yīng)途徑的關(guān)系

腦室注射神經(jīng)生長因子對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)再生的影響及其與頸曲應(yīng)途徑的關(guān)系

神經(jīng)生長因子（ngf）是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性物質(zhì)，可以維持金元的生存，參與受損器官的恢復(fù)。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是細胞內(nèi)重要的第二信使,它能激活蛋白激酶A(PKA)而產(chǎn)生一系列的生物效應(yīng)。有報道脊髓損傷后神經(jīng)元cAMP含量下降,而體外研究發(fā)現(xiàn)NGF使培養(yǎng)神經(jīng)元的cAMP含量增加。本研究采用大鼠腦缺血再灌注模型,研究腦梗死后大腦皮質(zhì)內(nèi)源性cAMP的含量及PKA、GAP-43基因表達的變化,觀察腦室內(nèi)注射NGF對大鼠大腦皮質(zhì)cAMP含量及GAP-43和PKAmRNA表達的影響,以了解cAMP-PKA信號途徑在NGF促進再生過程中的作用。1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及pcr檢測1.1材料成年Wistar大鼠60只,體重200~250g,由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,分為4組:假手術(shù)組(對照組)、單純腦缺血再灌注組(缺血組)、NGF1組(小劑量組)和NGF2(大劑量組)各15只。每組又分為術(shù)后6、24h、3天3個時間點,每個時間點各5只。SR-6N型立體定向儀(日本產(chǎn))。NGF購自武漢海特生物公司,125I-cAMP放免試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué),引物由上海生工生物工程公司合成,M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自Fermentas公司,RNA裂解液為Omega公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1腦室注射NG用6%的水合氯醛35mg/100g腹腔注射麻醉動物,頭頂部矢狀正中切口,在立體定向儀下定位,在前囟后0.9mm,右側(cè)1.3mm處進針4.2mm,NGF1組和NGF2組分別用微量注射器注入0.5及2.5μg/100g體重(0.9%生理鹽水稀釋10μl),10min注完,保留3min,拔出注射器,用骨蠟封住針眼,縫合切口,對照組不注射NGF,余手術(shù)過程同上。1.2.2模型制作在腦室注射后用Kuge等線栓法,取頸正中切口,分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)及頸外動脈(ECA),結(jié)扎ECA及CCA近端,微血管夾暫時夾閉翼腭動脈,在CCA近分叉處剪一小口,將一頭端5mm涂有硅膠、直徑達0.24mm的尼龍線經(jīng)CCA插入ICA約18mm形成大腦中動脈閉塞(MCAO),用絲線固定栓子在CCA內(nèi)。翼腭動脈復(fù)流,縫合切口,2h后拔出尼龍線使其再灌注,對照組線栓插入12mm,其余操作同缺血組。MCAO的動物清醒后可見左側(cè)肢體癱瘓,無癱瘓和死亡的動物剔除。1.2.3cAMP檢測在再灌注6、24h取各組右側(cè)缺血周圍區(qū)大腦皮質(zhì)組織50mg,按試劑盒說明配制醋酸緩沖液,加入預(yù)冷的醋酸緩沖液2ml勻漿,2ml無水乙醇洗勻漿器后倒入勻漿液中,3500r/min離心15min,收集上清,再用75%的乙醇1ml洗勻漿器2次,用該液洗勻漿沉淀同上離心15min,合并上清于60℃烤箱中吹干,4℃保存。標(biāo)本收集齊后用放射免疫法測cAMP濃度。1.2.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測PKA及GAP-43mRNA表達各組分別在6、24h及3天處死大鼠(6、24h用于測PKAmRNA,與cAMP同時取材,3天測GAP-43mRNA表達),取右側(cè)大腦皮質(zhì)組織,用RNA裂解液勻漿,提取總RNA,用DU-640型紫外分光光度計進行定量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照試劑盒說明書進行操作。PCR:取各實驗組逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)2μl,上、下游引物各2μl,2×PCRMasterMix12.5μl,DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水6.5μl。引物采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計,并向基因庫檢索驗證,與其他基因無高度同源性,引物序列見表1。PKA擴增條件:(1)95℃預(yù)變性3min;(2)94℃變性1min;(3)56℃退火40s;(4)72℃延伸1min,2-4步進行30個循環(huán)。最后72℃延伸10min。β-actin及GAP-43擴增條件:(1)94℃預(yù)變性5min;(2)94℃變性40s;(3)55℃退火40s;(4)72℃延伸40S,2-4步進行30個循環(huán)。最后72℃延伸10min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μl加2μl載樣緩沖液,在1.5%瓊脂糖凝膠(含5μl/100mlgoldview)上電泳約50min(電壓70V)。用LabWorks4.0凝膠成像及分析系統(tǒng)進行圖像分析。由該系統(tǒng)分析PKA及GAP-43與β-actin的積分吸光度(A)值。以各組PKA/β-actin及GAP-43/β-actin積分A值作為PKA及GAP-43mRNA的表達水平。1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS10.0版統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,所有計量資料用xˉ±sxˉ±s表示,組間比較用單因素方差分析,P<0.05為差異有顯著性意義。2結(jié)果2.1兩組mp、又比及又比對ws-pcr含量的影響對照組不同時間點cAMP含量差異無顯著性(P>0.05),缺血6h皮質(zhì)cAMP含量較對照組明顯下降,24h略有回升,但與6h比較無顯著性差異,6h及24hNGF1組cAMP含量升高接近對照組水平,而NGF2組高于對照組,在兩個時間點NGF2組cAMP含量明顯高于NGF1組(P<0.01,表2)。2.2agf對agf小鼠6h及24h的表達影響對照組大腦皮質(zhì)有明顯的PKAmRNA表達,6h及24h皮質(zhì)PKAmRNA表達明顯下降(P<0.01),NGF組6h及24h較缺血組明顯升高,接近對照組(與對照組P>0.05)。6h大劑量組的升高更顯著(與小劑量組比較P<0.05),24hNGF兩組無顯著性差異(P>0.05,圖1,2,表3)。2.3組小鼠小劑量和大劑量后療效比較對照組大腦皮質(zhì)有明顯的GAP-43mRNA的表達,A值為0.97±0.13,缺血組3天表達明顯下降(0.51±0.11,與對照組比較P<0.01),而小劑量NGF組3天較缺血組明顯升高(0.79±0.12,與對照組比較P<0.05,與缺血組比較P<0.01),大劑量組的升高更顯著(1.01±0.11,與對照組比較P>0.05,與缺血組比較P<0.01,圖3)。3port-pka信號通路調(diào)控視網(wǎng)膜mrna的表達哺乳動物中樞神經(jīng)(CNS)損傷后的再生非常有限,背根神經(jīng)節(jié)軸突在雪旺細胞(周圍神經(jīng)髓鞘成分)中生長而在少突膠質(zhì)細胞(中樞神經(jīng)髓鞘)中不能生長,因為成年CNS中一些髓鞘成分如NogoA,髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和少突膠質(zhì)髓鞘糖蛋白(OMG)等抑制損傷后的軸突再生。但如果提供一個允許的生長環(huán)境時CNS神經(jīng)元仍能長出長的突起。Cai等的體外研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)小腦神經(jīng)元在遭遇MAG或髓鞘之前首先暴露于神經(jīng)營養(yǎng)因子中時,軸突生長不再被抑制。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一,對神經(jīng)元的發(fā)育和生存、軸突的生長、突觸的重構(gòu)和功能起著重要作用。外源性NGF對腦缺血神經(jīng)元變性、壞死具有保護和修復(fù)作用,本研究試圖通過應(yīng)用外源性NGF改善腦梗死后大腦皮質(zhì)的軸突再生,并觀察cAMP-PKA信號在其中的作用。cAMP-PKA信號途徑在軸突的生長和誘導(dǎo)中起重要作用,PKA分子由兩個調(diào)節(jié)亞基(PKAr)和兩個催化亞基(PKAc)組成,PKAr與cAMP結(jié)合后釋放出具有激酶催化活性的PKAc,PKAc通過催化多種底物蛋白的磷酸化來調(diào)控細胞反應(yīng)。Chierzi等用cAMP-PKA信號通路的抑制劑能明顯減少DRG(背根神經(jīng)節(jié))神經(jīng)元軸突再生的數(shù)量,相反,通過激活腺苷酸環(huán)化酶和抑制磷酸二酯酶來提高cAMP的水平,卻能使損傷RGC(視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞)的軸突雙倍再生;而且增加PKA的活性能夠提高RGC生長錐的再生能力。Monsul等也發(fā)現(xiàn)增加細胞內(nèi)cAMP水平能促進成年大鼠的視神經(jīng)再生,說明cAMP-PKA信號途徑參與了CNS神經(jīng)元生長錐的再形成。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn),在大鼠腦缺血再灌注6h及24h缺血周圍區(qū)大腦皮質(zhì)cAMP含量明顯下降。ATP,腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶均影響的cAMP含量,腦缺血后ATP的含量及腺苷酸環(huán)化酶的活性顯著下降是cAMP減少的重要原因。Pearce等的研究發(fā)現(xiàn)胸段脊髓挫傷后不僅鄰近的頸段脊髓cAMP的含量下降,而且與損傷脊髓有直接聯(lián)系的腦干和感覺運動皮質(zhì)的內(nèi)源性cAMP明顯減少。cAMP的減少導(dǎo)致細胞生理功能的紊亂,最終可能導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。增加cAMP水平能夠阻止通過軸突順行和逆行轉(zhuǎn)運導(dǎo)致的損傷蔓延,特別是在胞體和軸突之間的快速轉(zhuǎn)運。線栓前腦室注射NGF組cAMP含量較單純?nèi)毖M明顯升高,大劑量組在6h及24hcAMP水平甚至高于對照組,這與以往離體研究的結(jié)果一致。PKA的激活受cAMP調(diào)控,本研究的結(jié)果也表明PKAmRNA的表達水平與腦組織cAMP含量呈正相關(guān)。GAP-43作為軸突生長的標(biāo)志物,在神經(jīng)元發(fā)育和軸突生長時高水平地表達,它的表達增加意味著軸突的發(fā)芽增加。本實驗在缺血再灌注3天測GAP-43mRNA的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純?nèi)毖M缺血周圍區(qū)皮質(zhì)GAP-43mRNA的表達減弱,而NGF組其表達明顯增加,給予大劑量NGF后GAP-43mRNA的表達強于對照組。Anguelova等發(fā)現(xiàn)在海馬損傷后兩天GAP-43蛋白的表達明顯減少,7天開始回升,他們認為損傷后軸突發(fā)芽出現(xiàn)在7~20天。而我們給予NGF后在損傷后3天即有GAP-43基