固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食用油中的微量辣椒堿

固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食用油中的微量辣椒堿

近年來，非法食用（通常稱為地溝油）被多次禁止，并嚴重威脅到消費者的健康，這已成為中國食品安全部門必須盡快解決的問題。地溝油的鑒別方法及指標也被國人廣泛關(guān)注。國內(nèi)學(xué)者已提出多種鑒別指標(如多環(huán)芳烴、膽固醇、電導(dǎo)率等),也在實踐中取得了一定效果。但“道高一尺,魔高一丈”,不法分子的地溝油精制工藝也在不斷發(fā)展。他們不但通過白土吸附脫色、水洗、真空高溫除臭等步驟去除了地溝油中存在的大部分常規(guī)雜質(zhì),而且將其摻入正常的食用油中進行出售,進一步降低所含指標物質(zhì)的含量,因此更給地溝油的檢測增加了難度。這種情況導(dǎo)致剛提出的多種鑒別指標又失效了,新的地溝油檢測方法仍是國內(nèi)當前的研究熱點。近來又出現(xiàn)了通過測定脂肪酸組成及微量雜質(zhì)鑒別地溝油的報道。地溝油是一個泛指概念,是對各類劣質(zhì)油的統(tǒng)稱,一般包括泔水油、煎炸廢油、食品及相關(guān)企業(yè)產(chǎn)生的廢棄油脂,而來自餐飲業(yè)的泔水油是地溝油的主要原料來源之一。由于國人的飲食習(xí)慣及口味愛好,辣椒是各種調(diào)料中用量較大,使用范圍較廣的一種。辣椒堿(也稱辣椒素)是引起辣味的主要化學(xué)成分,主要存在于辣椒屬植物的果實及種子中。辣椒堿具有脂溶性強、穩(wěn)定性好、沸點高等特點。目前的地溝油加工工藝很難完全去除具有這樣特點的物質(zhì)。正常食用油基本不含辣椒堿,而接觸過辣椒的餐廚廢棄油脂難以避免地含有這類成分。因此辣椒堿類成分可作為鑒別餐廚廢棄油脂的特征指標。目前餐飲業(yè)辣味調(diào)料基于兩種原料:天然辣椒及由人工合成的壬酸香草酰胺,而天然辣椒中以辣椒素及二氫辣椒素含量最大?；谏鲜銮闆r可以推斷餐飲泔水油中檢出這3種物質(zhì)的可能性最大,因此將它們確定為檢測目標。這3種物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)見圖1。對辣椒堿類物質(zhì)的定量檢測以分光光度法及液相色譜法為主,測定對象主要是辣椒及與辣椒有關(guān)的提取物及調(diào)味品。國內(nèi)已有研究者用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)進行辣椒堿定性分析,但采用LC-MS技術(shù)測定食用油中辣椒堿殘留量的工作國內(nèi)還未見報道。本文采用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立了食用油中3種微量辣椒堿(辣椒素、二氫辣椒素及壬酸香草酰胺)的檢測方法,并對國家食品安全風(fēng)險評估中心提供的67個正常及地溝油樣本進行了分析,結(jié)果表明辣椒堿是一個良好的地溝油鑒別指標。1實驗部分1.1試劑和儀器TSQQuantumAccess液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司);GENIUS3渦旋混合儀(德國IKA公司);Milli-Q高純水發(fā)生器(美國Millipore公司);水浴氮氣吹干儀。甲醇、乙腈、甲酸均為高效液相色譜純(美國TEDIA公司);分析純二氯甲烷購自美國J.T.Baker公司;實驗用水均為自制Milli-Q超純水;硫酸及氫氧化鈉為分析純(沈陽化學(xué)試劑廠);C18固相萃取小柱(1000mg/6mL)由大連中譜科技有限公司提供。標準品:辣椒素(capsaicin)、二氫辣椒素(dihydrocapsaicin)、壬酸香草酰胺(nonylicacidvanillylamide)及二苯胺(diphenylamine,內(nèi)標)購自阿拉丁試劑公司,所有標準品純度>99%。1.2儀器條件1.2.1流動相及色譜柱的選擇色譜柱:UF-ODS柱(150mm×2.1mm,3.0μm,大連中譜科技有限公司);進樣量:10μL;柱溫:25℃;流動相A:乙腈,B:水,C:0.1%甲酸。梯度洗脫程序:起始30%A-60%B-10%C;10min內(nèi)線性改變?yōu)?0%A-20%B-10%C;保持2min;12~20min100%乙腈沖洗色譜柱;20~30min按照起始比例進行平衡,流速為0.25mL/min。1.2.2多反應(yīng)監(jiān)測及檢測電噴霧離子源,正離子電離模式,電離電壓:3.5kV。鞘氣壓力:2.8×105Pa,輔助氣壓力:7×104Pa,傳輸毛細管溫度:300℃,鞘氣溫度340℃。碰撞氣壓力:0.2Pa。采集數(shù)據(jù)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。其他質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。1.3配制成儲備液3種辣椒堿標準品各稱取10.0mg,用乙腈定容至10mL,配制成1.00g/L的儲備液;二苯胺標準品稱取10.0mg,用甲醇定容至10mL,配制成1.00g/L的儲備液,置于-20℃冰箱中保存。使用時根據(jù)需要配制成相應(yīng)濃度的標準品溶液。1.4目標化合物的提取取500μL食用油樣品于10mLPeek管中,加入500μL二氯甲烷,再加入3mL20g/L氫氧化鈉,渦旋提取10min,以4000r/min離心10min,取上層水相;殘留油相再用3mL20g/L氫氧化鈉重復(fù)提取一次,合并水相,用1∶15稀硫酸(1份濃硫酸+15份水)調(diào)節(jié)pH在2~3之間后進行固相萃取(SPE)操作。C18固相萃取小柱預(yù)先用3mL×3次乙腈及3mL×2次純水淋洗進行活化;然后將調(diào)完pH值的水相提取液加入,調(diào)節(jié)SPE裝置的流速至1~2滴/s,待全部溶液通過SPE小柱后,以3mL×2次超純水淋洗,棄去流出液;最終以3mL×2次乙腈洗脫3種目標化合物。用氮吹裝置于50℃緩緩吹干后,加入200μL100μg/L二苯胺甲醇溶液溶解殘渣,再轉(zhuǎn)入液相色譜樣品瓶中進行LC-MS/MS測定。2結(jié)果與討論2.1固相萃取法提取辣椒堿辣椒堿在中性條件下的脂溶性強,而在強堿性條件下其結(jié)構(gòu)中的酚羥基解離,水溶性強,借助這個特點可實現(xiàn)辣椒堿與主體油脂的分離。首先通過堿性水溶液進行提取;然后再通過固相萃取技術(shù),實現(xiàn)辣椒堿的富集,并除去無機酸、無機堿及殘留的油脂。經(jīng)過這樣的分離富集步驟,不僅提高了靈敏度,減小了基體干擾,同時也避免了殘留油脂對色譜柱及質(zhì)譜儀器的污染和損傷。通過對比乙腈直接萃取和本提取方法的提取效果,發(fā)現(xiàn)本方法的提取率更高,且基本沒有油脂殘留,不會對色譜柱及質(zhì)譜儀器造成殘留污染。圖2顯示了本方法對一地溝油樣品(4-21-24)的實際分析效果。2.2測定誤差的測定色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析中一般使用兩種內(nèi)標:(1)提取內(nèi)標:用于跟蹤補償樣品前處理過程的損失;(2)進樣內(nèi)標:用于校準分析儀器波動造成的測定誤差。針對本文的情況,提取內(nèi)標須選擇與辣椒堿化學(xué)性質(zhì)非常近似(同時含有酚羥基及酰胺、碳鏈長度合適)且地溝油、食用油中都不存在的物質(zhì)。除使用同位素內(nèi)標外,其他合適的提取內(nèi)標不易獲得。而同位素內(nèi)標過于昂貴,不利于方法的普及。在此情況下本文僅用二苯胺作為進樣內(nèi)標,其出峰時間與待測辣椒堿較接近可較好地校準儀器波動引起的誤差。實際回收率及精密度結(jié)果表明,這種方法是可行的。2.3方法的線性回歸系數(shù)和檢出限用3種辣椒堿標準品及二苯胺的儲備液配制40、20、10、5、2、0.5、0.2μg/L的系列標準溶液,每個標準溶液中均加入100μg/L的二苯胺。對系列標準品進行LC-MS分析,以目標化合物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標,以目標化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標做標準曲線。結(jié)果表明在上述濃度范圍內(nèi)3種化合物的線性回歸系數(shù)均大于0.994。在空白大豆油中按照2.00μg/L及0.200μg/L兩個質(zhì)量濃度水平定量添加3種辣椒堿標準品,并按照本法重復(fù)提取分析5次,測定回收率及精密度(以相對標準偏差(RSD)表示)。檢出限(LOD)使用0.200μg/L添加水平的數(shù)據(jù)按3倍信噪比推算。結(jié)果如表2所示,3種辣椒堿的回收率在85%~93%之間;包括前處理在內(nèi)的整體方法精密度小于10%;檢出限在0.02~0.05μg/L之間。2.46種辣椒堿含量之和10%g/l的鑒定試驗結(jié)果采用本文方法對國家食品安全風(fēng)險評估中心提供的第四批37個盲樣及第五批30個盲樣進行了分析,結(jié)果分別列于表3和表4。表中同時列出了地溝油(ICO)樣本的來源及摻雜比例。從結(jié)果看正常食用油中基本不含有辣椒堿成分,3種辣椒堿含量之和最大不超過0.15μg/L。而大部分地溝油中3種辣椒堿含量之和均超過1μg/L,最大達到6000μg/L。如果設(shè)定3種辣椒堿含量之和超過0.2μg/L為判斷指標,則48個地溝油中36個樣本可以得到正確地鑒別。與此同時,所有正常食用油樣品也獲得正確的判斷結(jié)果,沒有錯判的情況。其中,第4批6個漏檢的地溝油樣品中,除來自深圳寶安的2個樣品外,其余都是地溝油摻雜比例比較小的樣品(3個樣本摻雜10%,一個樣本摻雜20%)。從這個角度看,本方法對大多數(shù)種類的地溝油是有一定的鑒定能力。此外對大部分同一來源的地溝油樣品,摻雜的比例越大,辣椒堿的測定結(jié)果越高,其數(shù)值與地溝油的摻雜比例大體成線性關(guān)系,因此本方法在一定程度上也可以判斷地溝油的摻雜比例。3方法的科學(xué)性和有效性更本文建立了食用油中3種微量辣椒堿殘留量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法,并將其用于地溝油的鑒別分析,取得了良好的效果。本方法識別出48個地溝油中的36個,正判率達到75%。而且,本方法還有一個顯著特點:假陽性率為零,即不會將正常的食用油誤