反相液相色譜的原理及應(yīng)用

反相液相色譜的原理及應(yīng)用

1反相液相色譜技術(shù)在多肽藥物分離中的應(yīng)用自20世紀(jì)80年代以來，隨著科學(xué)生命的深入，這種用于分離和提取蛋白質(zhì)和養(yǎng)分的色度成像方法得到了很大發(fā)展。其中,反相液相色譜由于具有許多其它色譜方法不可比擬的優(yōu)勢,正受到人們的關(guān)注。它能有效地分離各種多肽混合物,特別適用于分子量不大的蛋白質(zhì)和多肽物質(zhì)的分離、純化和鑒定,在蛋白質(zhì)及多肽研究中已得到了廣泛的應(yīng)用。近年來,隨著基因組和蛋白質(zhì)組計劃的實施,對不同蛋白質(zhì)的快速分析、定性以及定量的需求更大,反相液相色譜以其快速簡便、靈敏度高、重復(fù)性好、分辨率高等優(yōu)勢受到人們的重視,已成為一種常備的不可缺少的分析手段,并用于多肽藥物分離中。反相液相色譜與各種質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合也已成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的重要手段和發(fā)展方向。2抗相萃取層析成像2.1rplc固相分離技術(shù)反相液相色譜(reverse-phaseliquidchromatography,RPLC)是目前液相色譜分離中使用最為廣泛的一種模式,它的特點是固定相的極性比流動相弱。與它相對應(yīng)的是正相液相色譜或極性相液相色譜(normal-phaseliquidchromatography),如硅膠、氧化鋁或離子交換等極性介質(zhì)為固定相的色譜,其中流動相的極性低于固定相。由于RPLC固相載體的疏水性,它可以根據(jù)流動相中被分離物質(zhì)分子疏水性的不同而發(fā)生強(qiáng)弱不同的相互作用,從而使不同分子在反相柱中彼此分離。疏水性較弱的樣品分子和固定相間的相互作用較弱,因此較快流出;反之,疏水性相對較強(qiáng)的分子和固定相間存在較強(qiáng)的相互作用,在柱內(nèi)保留時間相對較長。RPLC在20世紀(jì)50年代就已用于許多有機(jī)小分子的分離和分析,80年代后逐步應(yīng)用于生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、核酸的鑒定,并用于制備規(guī)模的分離。RPLC與其它色譜方法相比具有分辨率和回收率高、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)勢。由于RPLC可使用揮發(fā)性體系如水溶三氟乙酸(TFA)-乙腈(ACN),純化產(chǎn)物不必進(jìn)行脫鹽,因此,可大大簡化操作步驟。另外,在其它模式的色譜中,保留時間主要決定于天然蛋白質(zhì)分子表面的某些基團(tuán)與固定相配基間的相互作用。而在RPLC中,蛋白質(zhì)分子通過色譜柱時會發(fā)生或多或少的去折疊,內(nèi)部某些疏水殘基暴露并與固定相相互作用,從而表現(xiàn)出與其它色譜及電泳方法不同的選擇性,提供其它方法不能提供的信息,這成為RPLC在蛋白質(zhì)及多肽分離分析中的又一個有利因素。由于以上種種原因,RPLC已成為廣泛使用的一種分離模式,普遍用于多肽和蛋白質(zhì)的分離分析。2.2多肽和蛋白質(zhì)的功能保留機(jī)制RPLC分離與流動相中溶質(zhì)分子與固定相配基間的疏水相互作用有關(guān)。人們對于反相分離中這種疏水作用的本質(zhì)進(jìn)行了大量的研究,提出了許多不同理論,但對其機(jī)理尚未達(dá)成共識,RPLC中的保留行為究竟是一種吸附過程還是分配過程還存在很多爭論。目前,根據(jù)理論分析和實驗數(shù)據(jù)證明,一些研究者認(rèn)為溶質(zhì)在RPLC上的保留是吸附機(jī)制和分配機(jī)制共同作用的結(jié)果。對于較小分子而言,人們更多考慮其分配機(jī)制;而對于多肽和蛋白質(zhì)這樣的生物大分子,由于其分子尺度往往比固定相表面疏水鍵合相大得多,通常以表面部分區(qū)域與固定相發(fā)生作用,其保留機(jī)制多被認(rèn)為是主要基于它們在疏水固定相上的吸附。簡單地說,在多肽及蛋白質(zhì)的RPLC中,初始洗脫條件下洗脫液中有機(jī)成分濃度較低,分子與固定相疏水作用較強(qiáng),幾乎完全被固定相吸附。而一旦洗脫液中有機(jī)成分達(dá)到特定濃度,使得多肽或蛋白質(zhì)與固定相間作用小于流動相與固定相間的作用時,分子完全從固定相上洗脫下來,幾乎不再與固定相發(fā)生作用。這一保留機(jī)制也被人稱為“on-off”機(jī)制。正由于多肽和蛋白質(zhì)這種特殊的保留機(jī)制,洗脫液成分極微小的改變就會大大影響多肽和蛋白質(zhì)的保留行為,從而保證疏水特征相近的多肽或蛋白質(zhì)得以充分分離。蛋白質(zhì)及肽段分離中常常采用反相離子對色譜(reversed-phaseion-pairchromatography,RP-IPC),它是通過向流動相中加入兩親離子來提高溶質(zhì)分子的保留值。陰離子對試劑如三氟乙酸(TFA)可與多肽的質(zhì)子化氨基結(jié)合,而陽離子對試劑如三乙胺(TEA)可與多肽的去質(zhì)子化羧基結(jié)合。在RP-IPC體系中,主要由固定相疏水表面對配對離子的選擇性吸附來決定溶質(zhì)保留值,因此,洗脫液pH值及配對離子的種類、濃度對樣品各成分尤其是疏水性較小的肽段的有效分離非常重要。3重組人組織型的rplc的制備RPLC的一個主要應(yīng)用領(lǐng)域就是多肽和蛋白質(zhì)的制備和分析。對于分子結(jié)構(gòu)比較簡單的多肽和某些蛋白質(zhì),在不影響產(chǎn)物的活性或產(chǎn)物在RPLC后很容易重新折疊復(fù)性的前提下,用RPLC進(jìn)行純化制備是一項高效的手段。同時,RPLC分辨率高和重復(fù)性好的特點,使它在蛋白質(zhì)及多肽分析領(lǐng)域占據(jù)核心地位。盡管在RPLC中有機(jī)溶劑的存在及疏水固定相的影響可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的改變,但這對分析鑒定并不重要,雖然被分析的蛋白質(zhì)發(fā)生了變性,卻能夠給出該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征及疏水性等信息,并將其精確地與其它蛋白質(zhì)相區(qū)分。3.1重組人淀粉狀蛋白的純化RPLC可用于絕大多數(shù)的多肽純化。RPLC流動相以水為基本組成部分,與肽的生物學(xué)性質(zhì)相適應(yīng),雖然流動相中的酸、有機(jī)溶劑以及固定相均可能使肽的天然構(gòu)象發(fā)生變化,但當(dāng)這些因素除去后,肽的構(gòu)象一般能恢復(fù)原狀,因此在RPLC中,肽的回收率一般在80%以上。早在1986年,人們就用RPLC對神經(jīng)肽進(jìn)行了純化。Boyes等也報道了用連續(xù)RPLC對細(xì)菌原液中的重組人淀粉狀蛋白前體多肽片段進(jìn)行分離。與分子量小、空間折疊相對簡單的多肽相比,蛋白質(zhì)的RPLC分離經(jīng)常存在一些問題。蛋白質(zhì)分子量一般都在萬級以上,很多有亞基結(jié)構(gòu),立體構(gòu)型及構(gòu)象復(fù)雜,與流動相、固定相及樣品中的其它成分以及蛋白質(zhì)本身都可能存在多種復(fù)雜的相互作用,會造成譜帶擴(kuò)散、峰形拖尾等問題,甚至發(fā)生變性和不可逆吸附,引起回收率和分辨率的降低。因此,隨著蛋白質(zhì)體積和疏水性的增加純化難度也會增加。但是,選用適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件,也可用RPLC對某些蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。核糖體蛋白的純化就是其中一個具有代表性的例子。近年來,關(guān)于多肽及蛋白質(zhì)的RPLC純化也取得了許多成功,如Krusa等用RPLC對大豆蛋白進(jìn)行了純化和定量分析,其它一些應(yīng)用的實例[16,17,18,19,20,21,22,23]見表1。3.2反相色譜圖的生成闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能,對蛋白質(zhì)進(jìn)行深入研究都離不開對其一級結(jié)構(gòu)、修飾位點等的了解。在蛋白水解酶(如胰蛋白酶)或化學(xué)試劑(如溴化氰)作用下,蛋白質(zhì)可被部分裂解,RPLC對肽段混和物可進(jìn)行有效分離。在這一過程中所獲得的反相色譜圖即稱為該蛋白質(zhì)的“肽圖”。肽圖法已成為RPLC在蛋白質(zhì)及多肽分析中最重要、最廣泛的應(yīng)用,已用于重組蛋白質(zhì)量控制、疾病診斷等諸多領(lǐng)域。反相肽圖中常采用C18柱,由于酶消化產(chǎn)物含有大量疏水性各不相同的肽段,因此多采用較窄的梯度并延長梯度時間。由于蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中肽段分子量通常較小,借助反相肽圖進(jìn)行蛋白質(zhì)及多肽分析可得到重復(fù)性好、分辨力高的結(jié)果,已有多種多肽及蛋白質(zhì)用RPLC進(jìn)行了肽圖分析[25,26,27,28,29,30],見表2。這其中既包括人生長激素、人粒細(xì)胞集落刺激因子這樣的重要藥物蛋白,也包括聚乙二醇-人生長激素這樣的蛋白質(zhì)修飾產(chǎn)物。肽圖分析有利于確定產(chǎn)物的一維結(jié)構(gòu),并有可能確定修飾位點。3.2.1基于反相肽圖的二硫鍵分析這是肽圖分析的重要應(yīng)用之一。肽圖上各峰經(jīng)氨基酸分析并結(jié)合Edman降解或電噴霧質(zhì)譜等手段,可得到每一肽段的精確序列。如Moritz等用RPLC對單克隆抗體A33進(jìn)行了序列測定。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,反相肽圖結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜已成為一種方便、快捷的序列測定方法,用于重組蛋白的測序。如果酶解過程中控制條件使二硫鍵不被破壞,通過比較二硫鍵還原前后的肽圖即可判斷二硫鍵的位置。Cunsolo即用上述方法對一種花粉蛋白中某肽段二硫鍵的位置進(jìn)行了表征。如與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫相結(jié)合進(jìn)行分析,反相肽圖還可對未知蛋白進(jìn)行鑒定。如Hoffmann用RPLC與質(zhì)譜聯(lián)用對LIM1215細(xì)胞中分離出的部分胞質(zhì)蛋白進(jìn)行了鑒定。3.2.2重組蛋白的檢測天然蛋白質(zhì)的色譜通常無法反映蛋白質(zhì)組成上的細(xì)微不同,而RPLC以其高分辨率在揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)細(xì)微差異上有出色的表現(xiàn),即使一個氨基酸的改變也可通過相應(yīng)肽段保留時間的變化清楚反映出來。例如,肽段上脫酰胺作用常常引起保留時間的輕微延長,而氧化產(chǎn)物如甲硫氨酸亞砜或半胱磺酸的形成常引起保留時間的顯著下降。同樣,變異蛋白質(zhì)的形成也會引起一個或多個肽段保留時間的變化。在血紅蛋白的研究中,人們已用RPLC分析出多種變異體,還有人利用RPLC肽圖與質(zhì)譜結(jié)合成功鑒定了又一種血紅蛋白變異體(b-134Val→Ala)。由于RPLC在識別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異上的出色表現(xiàn),已成為重組蛋白表征及藥用蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的一個有力工具,還可為許多疾病診斷提供依據(jù)。3.2.3在其他方面的應(yīng)用隨著人們對蛋白質(zhì)修飾的研究不斷深入,RPLC不僅被用來分離修飾與未修飾產(chǎn)物,在修飾產(chǎn)物分析上也得到了很好應(yīng)用。蛋白質(zhì)修飾包括蛋白質(zhì)在體內(nèi)的翻譯后修飾如形成N-甲酸基或N-乙?；苌镞M(jìn)行N端封閉;形成氨基化物進(jìn)行C端封閉;Ser、Thr、Tyr等含羥基的氨基酸磷酸化,Asn的N-糖基化及Ser、Thr的O-糖基化。還包括人工化學(xué)修飾如聚乙二醇、葡聚糖修飾等。借助RPLC可闡明修飾的位點及其化學(xué)本質(zhì)。由于糖肽在RPLC中的保留行為與其糖基化水平密切相關(guān),糖基化程度越高,保留時間越短,因此可將糖蛋白水解成肽段后進(jìn)行反相色譜分析,從而得到糖基化水平及所處肽段。Huddleston等專門討論了糖基化的定性分析。同樣,磷酸化蛋白質(zhì)中連接磷酸基的數(shù)量、位置等也可從RPLC分析中得出。無論是翻譯后修飾還是化學(xué)修飾,修飾位點的測定多采用對蛋白質(zhì)作肽圖后經(jīng)比較確定被修飾的肽段,再結(jié)合質(zhì)譜分析得到精確位點,這方面已做了許多有意義的工作。Ogueta等就利用RPLC和離子阱質(zhì)譜對兩種蛋白的磷酸化位點進(jìn)行了分析,得到了很好的結(jié)果。這一方法也可用于化學(xué)交聯(lián)蛋白質(zhì)分析,如交聯(lián)RNaseA中的交聯(lián)位點。該分析方法還可用于蛋白質(zhì)活性位點及結(jié)合位點等的鑒定。但在有些蛋白質(zhì)的大分子修飾位點判斷中,修飾上的分子對酶解及肽段分離的影響會對分析造成困難。3.3物濃度對酶活性的影響隨著RPLC在臨床及生物醫(yī)藥中廣泛地應(yīng)用,人們開始利用它來檢測體內(nèi)特定酶的活性。酶活性測定多采取分光光度法,但這種方法需要所測樣品達(dá)到一定純度。RPLC可經(jīng)特異監(jiān)控底物及產(chǎn)物濃度直接測量體液和組織中的酶活性,具有特異性強(qiáng)、簡便快速的優(yōu)點。通常將樣品加入合適底物,通過加熱、加酸或加入特定抑制劑終止反應(yīng),用反相液相色譜測定底物或產(chǎn)物濃度的改變并計算出酶活性,也可直接從活體的體液中底物或產(chǎn)物濃度變化來監(jiān)測酶活性。另外,由于RPLC可精確測定肽段的磷酸化,也有人將其用于酪氨酸激酶的活性測定。Hartwick等曾通過RPLC監(jiān)測腺苷的濃度來確定紅血球中腺苷脫氨酶的活性,還借助RPLC成功地測定了3′-AMP合成酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、黃嘌呤氧化酶等的活性,表現(xiàn)出RPLC在這一領(lǐng)域的巨大潛力。3.4非特異性疏水相互作用的研究RPLC應(yīng)用中的另一個重要方面是對多肽和蛋白質(zhì)的不同構(gòu)象中間體及其之間相互轉(zhuǎn)變的研究,這方面已有大量工作,如對胰島素、溶菌酶、重組生長因子和N-甲基重組生長因子及細(xì)胞色素C等多種蛋白質(zhì)及多肽在RPLC的疏水環(huán)境中構(gòu)象變化的研究。這些研究的共同特征是蛋白質(zhì)和多肽的吸附和解吸附與溶劑或配基引起的構(gòu)象改變有關(guān)。蛋白質(zhì)在RPLC固定相上的保留行為是基于蛋白質(zhì)與固定相配基間的非特異性疏水相互作用,這種疏水作用力的強(qiáng)弱與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)尤其與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的暴露程度有著密切的關(guān)系。它不僅取決于蛋白質(zhì)的氨基酸序列,更取決于蛋白質(zhì)與固定相發(fā)生作用時特定的空間構(gòu)象。不同條件下,由于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)發(fā)生不同程度的暴露,與固定相配基作用的位點也隨之變化,從而在RPLC中反映出色譜行為的改變。因此,可以利用RPLC來分析蛋白質(zhì)分子表面疏水性和空間構(gòu)象的穩(wěn)定性。如果蛋白質(zhì)或多肽的空間構(gòu)象比較穩(wěn)定,那么在各種不同的色譜條件下,蛋白質(zhì)與配基的結(jié)合位點不容易改變,保留機(jī)制不變。反之,因空間構(gòu)象的變化,就有可能采用不同的保留機(jī)制。這為測定構(gòu)象中間體轉(zhuǎn)變過程的動力學(xué)及熱動力學(xué)提供了直接手段。RPLC在蛋白質(zhì)構(gòu)象改變研究中的應(yīng)用已表現(xiàn)出巨大潛力。Kumar等使用RPLC證明了RNaseA經(jīng)三氯乙酸處理后構(gòu)象的改變。還有人通過用RPLC分離變化過程中的各種折疊中間體,動態(tài)監(jiān)測了牛胰島素在二硫蘇糖醇作用下去折疊的過程。另外,Mccrossin等還通過RPLC分離和肽圖分析相結(jié)合檢測了鹽酸胍存在下豬生長激素的降解情況。隨著反相材料和檢測手段的發(fā)展,RPLC在蛋白質(zhì)構(gòu)象行為研究中的潛力已被越來越多的人們所認(rèn)識。3.5rplc作熱價生物學(xué)模型Hodges等認(rèn)為可用RPLC研究蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性中的疏水作用。當(dāng)前蛋白質(zhì)化學(xué)家面臨