噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展

噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展

ph檢查和其他展示最早于1985年開始。最先構(gòu)建的噬菌體多肽或抗體展示文庫(kù)則始于1990年。由此,噬菌體展示技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)飛速發(fā)展的時(shí)期。噬菌體展示的基本概念是將外源蛋白質(zhì)或多肽的基因表達(dá)產(chǎn)物與噬菌體衣殼蛋白融合,并在其表面展示,同時(shí)將其遺傳密碼信息整合到個(gè)體噬菌體的基因組中。這個(gè)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是直接將可現(xiàn)的表達(dá)型與其基因型聯(lián)系在一起,再利用其配體的特異性親和力,將所感興趣的蛋白質(zhì)或多肽挑選出來。由此建立的噬菌體文庫(kù)的滴度可達(dá)到106—1012。10年來,噬菌體展示技術(shù)被用于抗體的制備、多肽及蛋白質(zhì)和酶的制備。特別是近幾年來,該技術(shù)被作為一種新工具用于多肽和蛋白質(zhì)藥物的發(fā)現(xiàn)與研制、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用及蛋白質(zhì)-DNA相互作用的研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究以及基因治療藥物的定向傳遞等多方面的研究。隨著噬菌體展示技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,其優(yōu)越性被越來越多的實(shí)驗(yàn)室所認(rèn)識(shí),使得該技術(shù)的使用范圍不斷擴(kuò)展,也使該技術(shù)得以不斷的完善和發(fā)展。在噬菌體表面展示技術(shù)的基礎(chǔ)上,目前已衍生出桿狀病毒和一些動(dòng)物病毒表面展示技術(shù),酵母表面展示技術(shù)等。最近又報(bào)道一種新的、不依賴于宿主細(xì)胞,完全在體外展示的技術(shù)。從Medline收錄的論文摘要可以看到,以“Phage”和“Display”為關(guān)鍵詞搜索到的論文的篇數(shù)從90年代初到本世紀(jì)初呈指數(shù)上升的趨勢(shì)。本文將較詳細(xì)地介紹噬菌體展示技術(shù)的基本原理和方法,將該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)盡可能多的展示給讀者。1針對(duì)重組基因的分子展示技術(shù)早期的基因表達(dá)文庫(kù)屬非展示系統(tǒng),是將DNA片段連接于噬菌體或質(zhì)粒表達(dá)載體上,然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,通過對(duì)大量的菌落或噬菌斑的篩選,將能產(chǎn)生具有生物活性蛋白質(zhì)的單個(gè)菌落或噬菌斑分離出來。用這種方法構(gòu)建的文庫(kù)局限在106個(gè)重組子以下,且因受細(xì)胞培養(yǎng)皿大小和數(shù)量的局限,需要大量的人力物力去獲得足夠的單克隆。有別于非展示系統(tǒng),展示系統(tǒng)是將所克隆的基因與其所編碼的蛋白質(zhì)以某種方式有機(jī)的結(jié)合在一起,并使其基因表達(dá)產(chǎn)物在表面展示。由此建立的展示文庫(kù)可通過淘選(Panning)而不是篩選(Screening)過程,將所需要的重組基因分離出來。所謂淘選,是將展示文庫(kù)作為流動(dòng)相,而將與欲選擇的重組基因產(chǎn)物有特異性親和力的靶分子固定在一個(gè)固相載體上,洗去不能與固定相特異結(jié)合的文庫(kù)的大部分成員,將特異結(jié)合的成員洗脫下來,再進(jìn)一步擴(kuò)增,進(jìn)入下一輪淘選。由于與固定相有特異結(jié)合力的蛋白質(zhì)與其編碼基因是結(jié)合在一起的,如此反復(fù)數(shù)輪淘選,即可將無用的基因去掉而將有用的基因富集并分離出來。噬菌體展示技術(shù)是目前應(yīng)用得最為廣泛的分子展示技術(shù),是利用細(xì)菌的病毒,如絲狀噬菌體M13作為載體,將基因和基因產(chǎn)物有機(jī)的結(jié)合起來。由此衍生的其他展示系統(tǒng)的基本原理都是一樣的,只是載體和宿主細(xì)胞不同而已,分別介紹如下。2主唾液的暴露2.1噬菌體基因的表達(dá)單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)是利用了M13噬菌體獨(dú)特的生命周期及其所表達(dá)的幾個(gè)噬菌體蛋白質(zhì)。絲狀噬菌體M13大約895nm長(zhǎng),9nm直徑。它的單鍵DNA基因組由6407個(gè)核苷酸殘基組成,編碼10種不同的蛋白質(zhì),并被包裝于約有2700—3000個(gè)拷貝數(shù)的基因8蛋白質(zhì)(g8p)的蛋白衣殼內(nèi)。M13的尾部有一種3—5個(gè)拷貝的蛋白質(zhì),其編碼基因?yàn)榛?,稱其為g3p。不像其他大多數(shù)的噬菌體,M13在感染大腸桿菌后,并不引起宿主細(xì)胞的裂解,而是使宿主細(xì)胞穩(wěn)定地分泌出噬菌體顆粒。當(dāng)M13的g3p接觸到雄性大腸桿菌的F纖毛時(shí)而引發(fā)感染。當(dāng)噬菌體進(jìn)入細(xì)胞時(shí),衣殼蛋白被除去,并存留在內(nèi)膜上。宿主DNA復(fù)制系統(tǒng)將噬菌體的單鏈DNA轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)粒狀的雙鏈DNA,這種雙鏈DNA基因組被復(fù)制,然后進(jìn)入環(huán)狀復(fù)制形式而產(chǎn)生可包裝于噬菌體顆粒中的單鏈DNA。質(zhì)粒狀的雙鏈DNA也可以作為膜板,轉(zhuǎn)錄成噬菌體蛋白的mRNA。g8p和g3p的引導(dǎo)序列將這些蛋白直接運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌的細(xì)胞內(nèi)膜。新合成的單鏈?zhǔn)删wDNA在穿過內(nèi)膜時(shí)被包裝為成熟的噬菌體顆粒。成熟的噬菌體在穿過宿主細(xì)胞壁時(shí)并不引起宿主細(xì)胞的裂解,因此M13噬菌體可被不斷地產(chǎn)生,直到對(duì)細(xì)胞有害的g3p產(chǎn)物大量積累以及細(xì)胞本身的廢物累積過多而引起細(xì)胞死亡為止。將外源基因與噬菌體的g3p或g8p基因融合,在g3p或g8p表達(dá)和噬菌體包裝的過程中,使外源基因產(chǎn)物在噬菌體表面展示,通過和固相化的靶分子的相互作用,將所要的基因分離出來。由于g3p或g8p的拷貝數(shù)不同,可根據(jù)需要,將外源基因與g3p或g8p的基因融合,獲得1—5(與g3p融合)或超過100(與g8p融合)個(gè)拷貝數(shù)的表面展示融合蛋白,但與g8p融合的蛋白分子量不能太大。當(dāng)展示在噬菌體g3p的外源基因產(chǎn)物與固相化的靶分子特異性結(jié)合時(shí),也同時(shí)使噬菌體結(jié)合在一起,因此可以將噬菌體上含有的大量拷貝的g8p的酶標(biāo)抗體作為檢測(cè)工具。將噬菌體和質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起的雜交載體為噬菌粒。噬菌粒帶有M13(單鏈)和質(zhì)粒(雙鏈)的復(fù)制起始位點(diǎn),能像質(zhì)粒一樣復(fù)制,或者在輔助噬菌體如M13K07的幫助下,裝配成重組噬菌體顆粒。雖然噬菌粒帶有M13的復(fù)制起始位點(diǎn),但它缺乏噬菌體蛋白的基因而難以產(chǎn)生完整的噬菌體。而輔助噬菌體能提供將單鏈?zhǔn)删wDNA復(fù)制并包裝成完整噬菌體顆粒所需的蛋白質(zhì)。由于M13K07輔助噬菌體含有一個(gè)低效的復(fù)制起始點(diǎn),噬菌粒DNA能更有效地復(fù)制,因此新產(chǎn)生的大量的噬菌體DNA為噬菌粒DNA,在缺乏噬菌粒競(jìng)爭(zhēng)的條件下,K07起始復(fù)制子也能復(fù)制輔助噬菌體的基因組。噬菌粒含有氨卞抗性基因,而M13K07含有卡那霉毒抗性基因,使被感染的細(xì)胞能從未被感染的細(xì)胞中挑選出來。被輔助噬菌體M13K07感染后的宿主細(xì)胞能在含有氨卞和卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),噬菌體展示系統(tǒng)就是基于噬菌粒和M13K07的相互作用之上的。2.2噬菌體基因產(chǎn)物的組裝λ噬菌體是最早使用的克隆載體,此后它在分子克隆中始終起著重要的作用。λ噬菌體展示系統(tǒng)是將外源肽或蛋白質(zhì)與λ噬菌體的主要尾部蛋白PV或λ噬菌體頭部組裝的必需蛋白-D蛋白融合而被展示的。λ噬菌體的基因組是一長(zhǎng)度約50kb的雙鏈DNA分子。在λ噬菌體顆粒內(nèi),該DNA為一線形雙鏈分子,其末端為長(zhǎng)12個(gè)核苷酸的互補(bǔ)單鏈(粘端)。當(dāng)λ噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)胞后,其粘端通過堿基配對(duì)而結(jié)合,形成環(huán)狀分子。宿主體內(nèi)的DNA連接酶很快將其切口封閉而形成閉環(huán)DNA,在感染早期充當(dāng)轉(zhuǎn)錄模板。在裂解性生長(zhǎng)過程中,環(huán)狀病毒DNA分子被復(fù)制了許多倍,λ噬菌體基因產(chǎn)物大量合成,并組裝成子代λ噬菌體顆粒。最終宿主細(xì)胞裂解,釋放出許多感染性病毒顆粒。在溶源性生長(zhǎng)過程中,λ噬菌體基因組通過位點(diǎn)專一重組整合入宿主DNA分子中,隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制并轉(zhuǎn)入子代。與絲狀噬菌體比較而言,λ噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)組裝而不必通過分泌途徑,因此它可展示的肽或蛋白質(zhì)范圍較廣,尤其適合展示那些不能被E.coli分泌的復(fù)雜蛋白質(zhì)。成熟的λ噬菌體顆粒是兩個(gè)結(jié)構(gòu)單位,即頭部和尾部組成。D蛋白是λ噬菌體頭部組裝必需的蛋白,也稱裝飾蛋白,分子量為11KD,有405個(gè)拷貝。在λ噬菌體頭部組裝過程中,當(dāng)DNA進(jìn)入頭部以后,D蛋白附著于衣殼外側(cè),將噬菌體頭部固定。當(dāng)噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時(shí),它可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝,故D蛋白可作為外源序列融合的載體,這種展示一般為N端展示。D蛋白展示的體外組裝途徑是將D融合蛋白結(jié)合到λD-噬菌體表面。體內(nèi)組裝途徑是將含D融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入λD-溶源的E.coli菌株中,從而彌補(bǔ)溶源菌所缺的D蛋白,通過熱誘導(dǎo)被組裝,或利用噬菌體P1的Cre-LoxP定點(diǎn)重組系統(tǒng)將外源基因整合到λ噬菌體基因組中。這種方法是在具有Cre重組酶的E.coli細(xì)胞中導(dǎo)入含D融合基因和LoxP重組位點(diǎn)的質(zhì)粒,然后用含LoxP位點(diǎn)的λD-噬菌體感染。在感染過程中,Cre重組酶使質(zhì)粒的LoxP位點(diǎn)與噬菌體基因組的LoxP位點(diǎn)重組,從而使質(zhì)粒DNA整合,并表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行裝配。λ噬菌體的主要尾部蛋白PV也可以供外源序列的插入。λ噬菌體基因V編碼的主要尾部蛋白形成管狀結(jié)構(gòu),由32個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)組成,每個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)又由6個(gè)PV亞單位組成。PV分子量為25.8KD,由246個(gè)氨基酸殘基組成,在衣殼表面有192個(gè)拷貝。PV有兩個(gè)折疊區(qū),C端的折疊區(qū)是病毒的非功能區(qū),可供外源序列插入或替換。2.3t4衣殼系統(tǒng)基因信息T4噬菌體展示系統(tǒng)是將外源肽或蛋白質(zhì)與T4噬菌體的小衣殼蛋白SOC的C端融合而被展示。T4噬菌體的基因組為雙鏈DNA,分子量為1.2×108。完整的T4噬菌體由頭部,尾部和尾纖毛三部分組成。與λ噬菌體一樣,T4噬菌體也有裂解生長(zhǎng)過程和溶源生長(zhǎng)過程。SOC是一個(gè)分子量為9KD的小蛋白,是T4衣殼組裝非必需的,而且不論是在體內(nèi)還是體外,它都具有與成熟的衣殼表面特定位點(diǎn)高親和力的專一結(jié)合的能力,其拷貝數(shù)約為960/衣殼或104/多聚頭部。利用一個(gè)陽性選擇載體將融合有外源序列的SOC融合基因同源整合入缺失SOC的T4基因組中,選擇恢復(fù)溶菌酶生長(zhǎng)不依賴性的噬菌體,即可將外源肽或蛋白質(zhì)展示于噬菌體表面。該系統(tǒng)容量大(至少35KD的蛋白質(zhì)),拷貝數(shù)高,故在完整結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的免疫學(xué)展示、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究與生物工程學(xué)等方面有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力,其缺點(diǎn)是高價(jià)展示不適合高親和力配體篩選。也有將外源蛋白與T4噬菌體的次要纖維蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示的報(bào)道。3真核細(xì)胞病毒的顯示系統(tǒng)3.1膜包和病毒簡(jiǎn)介桿狀病毒是一種帶有囊膜的動(dòng)物病毒,它主要致病于無脊椎動(dòng)物和昆蟲。桿狀病毒具有一個(gè)大環(huán)狀雙鏈DNA基因組,其分子量在80kb至180kb范圍內(nèi),其轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制以及核衣殼的裝配都是在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的。根據(jù)感染周期的差異,可將桿狀病毒分為兩種表現(xiàn)型:第一種表現(xiàn)型的感染周期為出芽病毒(BV),BV形成于核衣殼穿過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞外空間時(shí)。第二種表現(xiàn)型的感染周期為包涵體病毒(ODV,occlusion-derivedvirus),ODV發(fā)生于感染后期,當(dāng)核衣殼在細(xì)胞核內(nèi)被囊膜包被時(shí)。雖然BV和ODV的核衣殼結(jié)構(gòu)看上去一樣,但它們的囊膜的來源和組成是不同的。BV感染宿主細(xì)胞依賴于其主要囊膜蛋白GP64EFP。已知Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus(AcMNPV)被廣泛應(yīng)用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白質(zhì)。該病毒全基因組序列已被測(cè)定,是桿狀病毒家族中的一員,屬于BV表現(xiàn)型。AcMNPV囊膜的主要蛋白是一種糖蛋白,GP64。GP64的基因編碼一種I型具有一N端信號(hào)肽序列和C端穿膜區(qū)域的膜融合糖蛋白。GP64蛋白在病毒顆粒表面是以二硫鍵相連,似一三聚體,由酸啟動(dòng)調(diào)節(jié)膜的融合,負(fù)責(zé)病毒進(jìn)入細(xì)胞。GP64的編碼基因由早期和晚期啟動(dòng)子調(diào)節(jié),這使得GP64在感染的早期和晚期都出現(xiàn)在細(xì)胞膜上。當(dāng)核衣殼組裝好以后,就會(huì)在GP64集中的細(xì)胞質(zhì)膜處穿膜出芽,完成最后的囊膜包裝。通過對(duì)GP64蛋白結(jié)構(gòu)的了解,可將GP64分為與其單聚體構(gòu)象有關(guān)的區(qū)域和與膜融合有關(guān)的區(qū)域。這個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得GP64可發(fā)展成為一個(gè)很好的真核病毒展示系統(tǒng)。Mottershead等人是第一次成功地將熒光蛋白GFP等外源蛋白在桿狀病毒囊膜表面展示的研究小組。他們將外源蛋白基因插入到帶有GP64基因的表達(dá)質(zhì)粒中,使其與GP64N端融合,然后將其與野生型AcMNPV線形DNA共轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞,使它們能同源重組。這種同源重組病毒具有兩種GP64的編碼序列:一種是野生型的GP64,是病毒感染所必需的;另一種是融合蛋白的GP64,受Polyhedrin基因啟動(dòng)子的控制,這種展示系統(tǒng)可發(fā)展為真核展示文庫(kù)、以及使桿狀病毒具有感染新的宿主細(xì)胞的能力。3.2反轉(zhuǎn)錄病毒屬桿狀病毒并不是惟一用于外源多肽或蛋白質(zhì)的真核展示系統(tǒng),還有其他一些真核細(xì)胞病毒也用于多肽或蛋白質(zhì)的展示,如脊髓灰質(zhì)炎病毒,鼻病毒,sindbis病毒,反轉(zhuǎn)錄病毒,以及植物病毒如煙草花葉病毒和豆花葉病毒。這里主要介紹反轉(zhuǎn)錄病毒展示系統(tǒng)。反轉(zhuǎn)錄病毒是一類很大的性質(zhì)相似的病毒群,也稱RNA腫瘤病毒,可以在許多動(dòng)物中引起腫瘤。反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組為雙倍體,由兩條RNA正鏈構(gòu)成。該類病毒粒子的結(jié)構(gòu)類似,其RNA,gag蛋白和反轉(zhuǎn)錄酶位于病毒粒子核心,外面包以被膜糖蛋白。C型鼠白血病病毒(MuLV)是反轉(zhuǎn)錄病毒家族中的一員,具有囊膜結(jié)構(gòu)。它的囊膜結(jié)構(gòu)上含有一種球狀能與細(xì)胞受體結(jié)合的表面蛋白SU和另一種具有N端融合區(qū)的跨膜蛋白TM。它們以多肽單鏈的形式合成,再經(jīng)蛋白水解成為成熟的囊膜復(fù)合體。MuLVSU的N端具有一保守的折疊區(qū),是與受體結(jié)合的活性位點(diǎn)。SU的C端具有一高度可變的區(qū)域,這一區(qū)域的缺失或插入外源多肽或蛋白質(zhì)都不會(huì)影響病毒的感染周期,將這個(gè)區(qū)域作為外源多肽或蛋白質(zhì)的插入位點(diǎn)已成功地實(shí)現(xiàn)了外源蛋白在MuLV的表面展示。4整合蛋白的活性成分,包括蛋白質(zhì)對(duì)屬革蘭氏陰性菌的大腸桿菌膜表面的蛋白結(jié)構(gòu)及功能的研究結(jié)果表明,與肽聚糖相關(guān)的脂蛋白的N末端,外膜脂蛋白和外膜蛋白A(OMPA)以及Tolq蛋白都具有表面展示外源多肽或蛋白的潛力,并有成功的報(bào)道。對(duì)葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌等各種革蘭氏陽性菌的研究表明,其細(xì)菌表面受體的C端區(qū)可以融合外源序列,如葡萄球菌A蛋白(SpA),鏈球菌M6蛋白和纖維結(jié)合素結(jié)合蛋白。與大腸桿菌表面展示系統(tǒng)一樣,革蘭氏陽性菌的表面展示系統(tǒng)也是將插入有外源序列的融合蛋白通過表達(dá)質(zhì)粒載體來實(shí)現(xiàn)。革蘭氏陽性細(xì)菌表面展示系統(tǒng)比革蘭氏陰性細(xì)菌展示系統(tǒng)有更大的優(yōu)越性;第一,革蘭氏陽性細(xì)菌表面受體比革蘭氏陰性細(xì)菌更能接受外源序列的插入。第二,革蘭氏陰性細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的表面要穿過整個(gè)細(xì)胞質(zhì)膜,需要膜上正確整合過程,而革蘭氏陽性細(xì)菌展示系統(tǒng)只需穿過單層膜就可實(shí)現(xiàn)理想的展示。第三,以細(xì)菌全細(xì)胞作為診斷或淘選,實(shí)驗(yàn)操作中,因?yàn)楦锾m氏陽性細(xì)菌有較厚的細(xì)胞壁,不易在各種實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)生細(xì)胞裂解。細(xì)菌表面展示系統(tǒng)可以用于“全細(xì)胞抗體”的形成,進(jìn)行各種診斷實(shí)驗(yàn),還可替代噬菌體表面展示技術(shù),從文庫(kù)中淘選特異性多肽或抗體。也可以發(fā)展成生物濾器,將某些化合物的特異性配體展示在細(xì)菌表面來實(shí)現(xiàn)對(duì)所需化合物的特異性捕獲,還可將酶展示在細(xì)菌表面來發(fā)展新的微生物催化劑,用于特異性去毒,如廢水處理等。5酵母表面受體蛋白與原核細(xì)胞E.coli不同,酵母S.cerevisiae是真核細(xì)胞生物,它具有與哺乳動(dòng)物相同的蛋白質(zhì)折疊和分泌系統(tǒng)。然而酵母與E.coli也有共同之處,即非常易于培養(yǎng),其簡(jiǎn)單的遺傳單位比哺乳動(dòng)物細(xì)胞更易于文庫(kù)的建立和操作。因此,酵母作為一個(gè)表面展示的宿主細(xì)胞,用于大量融合蛋白或多肽的展示,具有噬菌體展示系統(tǒng)和原核細(xì)胞展示系統(tǒng)無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。選用酵母粘性受體蛋白作為表面展示的支架,用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行篩選,已成功地獲得表面展示單鏈抗體的酵母。酵母具有兩種有關(guān)的細(xì)胞表面受體蛋白,一種為a-凝集素,另一種為α-凝集素。它們的功能是通過具有α和a單倍體細(xì)胞之間的粘性的調(diào)節(jié),使其融合為雙倍體。α-凝集素的C端與細(xì)胞壁葡聚糖共價(jià)連結(jié),而a-凝集素的C端被用作外源序列的插入?yún)^(qū)域。a-凝集素具有兩個(gè)亞基,Aga1p亞基有725個(gè)氨基酸殘基,與細(xì)胞壁β葡聚糖共價(jià)連結(jié),而Aga2p亞基有69個(gè)氨基酸殘基,通過兩個(gè)二硫鍵與Aga1p亞基連結(jié)。天然a-凝集素的結(jié)合活力位于Aga2p亞基的C端,這為外源蛋白在細(xì)胞外表面的展示提供了一個(gè)有用的插入位點(diǎn)。其方法是先將外源序列插入PCR擴(kuò)增的Aga2pC端片段中,再裝入一個(gè)酵母穿梭質(zhì)粒,酶切使其成為線形DNA,然后通過同源重組,將插入序列整合到酵母基因組中。6共價(jià)展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)的核心是將展示蛋白質(zhì)的表現(xiàn)型與其基因型有機(jī)的結(jié)合起來。之后發(fā)展起來的其他展示技術(shù)都是以此為基礎(chǔ)的,但它們都受限于載體本身和宿主細(xì)胞以及基因轉(zhuǎn)移的效率。近幾年來,一些體外展示技術(shù)發(fā)展起來,它們不需要將DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),其限制因素僅在于DNA文庫(kù)的質(zhì)量,它能加入到無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)中,這使得所構(gòu)建的文庫(kù)在分子展示上的容量大大超過完整細(xì)胞和病毒,往往可以達(dá)到1014—1015。這是目前單位最小而容量又最大的展示系統(tǒng)。共價(jià)展示技術(shù)是一種體外展示文庫(kù)技術(shù),它避免了由其他展示系統(tǒng)所具有的許多問題和局限性。共價(jià)展示技術(shù)利用了E.coli的噬菌體P2的一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)蛋白的不尋常的特點(diǎn)。這個(gè)蛋白是由噬菌體的A基因所編碼,稱為P2A,是一個(gè)核酸內(nèi)切酶。它通過結(jié)合到噬菌體的起動(dòng)子而啟動(dòng)其滾環(huán)式復(fù)制過程,并在DNA上形成一個(gè)單鏈切口(Nick)。在宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)制下,由P2A在DNA鏈形成的3’-OH,被用作新生DNA鏈合成的引物,而切口所暴露的另一端,5’-磷酸基團(tuán)是發(fā)展共價(jià)展示技術(shù)的關(guān)鍵,因?yàn)樗梢耘cP2A活性中心的酪氨酸共價(jià)結(jié)合。P2A的另一個(gè)性質(zhì)是它所共價(jià)結(jié)合的DNA正是編碼它本身的基因。將多肽庫(kù)的基因與P2A基因融合,并在體外合成,其產(chǎn)物也就與編碼自己的DNA序列結(jié)合在一起。共價(jià)展示技術(shù)的操作如下:制備一個(gè)DNA文庫(kù),每個(gè)DNA分子含有P2A的編碼序列,并與一外源多肽的編碼序列融合在一起。這個(gè)DNA庫(kù)在體外E.coliS30的細(xì)胞裂解液中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與翻譯。由于P2A的特性,每個(gè)DNA分子都與自己編碼的基因產(chǎn)物共價(jià)連接。這個(gè)DNA-蛋白復(fù)合物的選擇可以像噬菌體展示技術(shù)一樣,利用固相化的靶分子的親和力,洗去不能結(jié)合的分子,然后將能結(jié)合的DNA-蛋白復(fù)合物洗脫下來。下一步可通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增,或?qū)⑵淇寺〉郊?xì)菌宿主細(xì)胞中。另外一種體外展示技術(shù)是多聚體展示技術(shù),這個(gè)系統(tǒng)是以DNA為模板轉(zhuǎn)錄和翻譯,在一定的控制條件下,使穩(wěn)定的mRNA-核糖體-多肽復(fù)合物能夠分離出來,利用固相化的靶分子將具有特異性親和力的多聚體復(fù)合物選擇出來,再利用EDTA將復(fù)合物中的mRNA解離下來,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增,進(jìn)入下一輪淘選。還有一種體外展示技術(shù)是RNA-多肽融合系統(tǒng),這個(gè)展示系統(tǒng)是利用嘌呤霉素分子將mRNA分子和其所編碼的多肽共價(jià)結(jié)合起來。嘌呤霉素是一種抗生素,它可以模仿tRNA氨酰末端進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn),與通過核糖體翻譯生成的多肽形成一種酰胺鍵。在RNA-多肽融合系統(tǒng)中,嘌呤霉素與單鏈DNA連接物的3’端連結(jié),然后這個(gè)DNA連接物再與文庫(kù)編碼的mRNA3’端連結(jié)。當(dāng)mRNA在體外翻譯時(shí),核糖體到達(dá)mRNA和DNA的結(jié)合點(diǎn)并穩(wěn)定下來,嘌呤霉素進(jìn)入核糖體A位點(diǎn),并與所編碼的多肽形成穩(wěn)定的酰胺鍵。一個(gè)mRNA-DNA-嘌呤霉素分子文庫(kù)可在體外翻譯,然后用固相化的靶分子將純化的RNA-多肽復(fù)合物淘選出來,像多聚體展示系統(tǒng)那樣,這個(gè)復(fù)合體可通過反轉(zhuǎn)錄PCR得到進(jìn)一步的擴(kuò)增。7凝血酶受體的分離純化在展示技術(shù)的實(shí)際操作中,有時(shí)會(huì)出現(xiàn)分離不到可結(jié)合的噬菌體或只得到低親和力的噬菌體的問題,這可以通過修飾原噬菌體展示文庫(kù),構(gòu)建第二文庫(kù)的方式得以解決。如果問題是因?yàn)橛H和力很低,但是又發(fā)現(xiàn)它具有一段保守序列,可將這一段序列固定,而將周圍的核苷酸重排。另一種方法是,如果只得到一個(gè)親和力很低的多肽,可根據(jù)這個(gè)多肽的基因序列,在合成寡核苷酸鏈,按序加入每個(gè)核苷酸時(shí),加入少量的另外三種核苷酸,這樣就可獲得每種只有一個(gè)氨基酸殘基不同的多肽庫(kù)。在更嚴(yán)格的條件下,可從這種多肽庫(kù)中找到親和力很強(qiáng)的多肽。還有一種改善親和力的方法是使這個(gè)多肽或蛋白具有多價(jià)性,如將一個(gè)6肽以5個(gè)重復(fù)連成一體,獲得一個(gè)6肽的多價(jià)體。也有人將8肽與噬菌體的每個(gè)g8p衣殼蛋白融合,獲得一個(gè)高密度表達(dá)的多肽庫(kù)。與構(gòu)建高滴度文庫(kù)同樣重要的是設(shè)計(jì)一個(gè)更巧妙的篩選方法。在一般情況下,可通過非常簡(jiǎn)單的固相化靶分子來進(jìn)行淘選。但是也有如下缺點(diǎn):1.靶分子必須是純化的;2.一些抗體不能與天然狀態(tài)的蛋白抗原結(jié)合;3.由于功能性親合力(Avidity)因素,很難得到高親合力的克隆;4.很難區(qū)分具有同樣親和力的克隆。圍繞上述問題,也發(fā)展出了一些新的篩選方法。在純化有困難時(shí),如細(xì)胞膜蛋白是很難表達(dá)和純化的一類蛋白,可用完整細(xì)胞對(duì)多肽庫(kù)進(jìn)行淘選,如尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化受體的多肽拮抗劑,MC-1的配體等的分離鑒定。在以同樣的方法分離凝血酶受體的配體時(shí),是用人血小板細(xì)胞進(jìn)行淘選,用已知的凝血酶受體的一個(gè)激動(dòng)劑將結(jié)合的噬菌體洗脫下來。其中一個(gè)噬菌體可從細(xì)胞膜抽提液中將凝血酶受體免疫沉淀下來,其上所展示的多肽可抑制該受體凝集血小板的活力。在不需了解完整細(xì)胞有關(guān)受體的任何信息時(shí),多肽庫(kù)也可對(duì)細(xì)胞的結(jié)合和吸收進(jìn)行篩選。這種篩選可用于那些細(xì)胞表面蛋白組成復(fù)雜并經(jīng)常改變的一類細(xì)胞,如癌細(xì)胞。用這種方法分離到一個(gè)20肽,它不僅可與成纖維細(xì)胞結(jié)合,還可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。絲狀噬菌體衣殼蛋白g8p有150—300個(gè)拷貝數(shù),而尾部蛋白g3p只有3—5個(gè)拷貝數(shù)。將多肽或蛋白與g3p融合展示時(shí),往往觀察到這種噬菌體被細(xì)胞吸收進(jìn)去的現(xiàn)象。而當(dāng)將多肽或蛋白與g8p蛋白融合時(shí),可觀察到10倍數(shù)量的噬