組織培養(yǎng)十常見植物脫毒與快繁

第十章常見植物脫毒與快繁技術(shù)

宜職院08.9

目的與要求了解農(nóng)作物、果樹、花卉、藥用植物的脫毒和快繁的生產(chǎn)意義與基本技術(shù)，根據(jù)地方特點和組培技術(shù)現(xiàn)狀，例舉部分植物進(jìn)行講授，并結(jié)合學(xué)生查閱資料共同探討。具有農(nóng)作物、果樹、花卉、藥用植物快繁基本技術(shù)，具備馬鈴薯、草莓等植脫毒技術(shù)，進(jìn)行微型薯生產(chǎn)基本知能，有利用圖書及網(wǎng)絡(luò)資源收集相關(guān)資料，了解相關(guān)行業(yè)信息的能力，并具備一定交流探討能力。

第一節(jié)農(nóng)作物的脫毒與快繁

植物組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛運用于農(nóng)作物育種和良種繁育，尤其是許多無性繁殖類農(nóng)作物脫毒及良種快繁，對提高農(nóng)作物生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質(zhì)發(fā)揮了極其重要的作用。一、馬鈴薯的脫毒和快繁

（一）莖尖培養(yǎng)脫毒

1、取材生產(chǎn)大田頂芽，或塊莖，預(yù)培養(yǎng)抽生的枝條污染較少。供試材料存在病毒可結(jié)合熱處理脫毒。

2、消毒自來水沖洗1h，70%酒精30s，10%漂白粉溶液5～10min，無菌水沖洗2～3次。

3、接種解剖鏡下，解剖刀切取0.1～0.3mm帶有1～2個葉原基的莖尖，接種到培養(yǎng)基上。

4、培養(yǎng)條件MS、Miller，25±2℃，1000lx，4周后增至2000～3000lx，光照16h。

5、病毒鑒定目測法和指示植物鑒定法。（二）微型薯生產(chǎn)技術(shù)

由試管苗生產(chǎn)的重1～30g的微小馬鈴薯被稱為微型薯。不帶病毒，增產(chǎn)效果一般在40%以上。

1、試管生產(chǎn)微型薯一般只有1～5g。用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)微型薯分以下兩個步驟：

（1）單莖段擴(kuò)大繁殖

（2）微型薯的誘導(dǎo)。

2、溫室多層架盤工廠化生產(chǎn)

3、低網(wǎng)畦生產(chǎn)二、甘薯的脫毒與快繁（一）莖尖培養(yǎng)1、莖尖培養(yǎng)脫毒取高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)母株枝條，切成帶1芽小段。自來水流水沖洗，70%酒精10s，0.1%的升汞10min，無菌水4～5次，或2%次氯酸鈉5min，無菌水3～4次。2、莖尖剝離和培養(yǎng)解剖鏡下剝?nèi)パ可陷^大幼葉，切取0.3～0.5mm含1～2個葉原基的莖尖分生組織，迅速接種到制備好的培養(yǎng)基上。3、病毒檢測

目測法和指示植物鑒定法。

（二）脫毒苗擴(kuò)繁和種薯的生產(chǎn)

通過病毒檢測的脫毒苗先在試管內(nèi)進(jìn)行切段快繁。30d左右長成有6～8片展開葉的試管苗。待試管苗繁殖到一定數(shù)量后，即可在防蟲條件下于無菌基質(zhì)中進(jìn)行栽培繁殖。所結(jié)小薯即為原原種薯。以原原種（苗）為種植材料，在防蟲條件下的無病毒土壤上培育出的薯塊即為原種。以原種苗在大田條件下生產(chǎn)所結(jié)薯塊即為生產(chǎn)用種薯（良種）。

紅薯原原種煉苗第二節(jié)果樹脫毒快繁

利用組織培養(yǎng)方法繁殖果樹植株具有占地面積小，繁殖周期短，全年都能進(jìn)行繁殖，繁殖系數(shù)高等特點。還可以消除果樹的某些病毒病，適應(yīng)果樹向品種更新快、矮化密植以及無病毒栽培方向發(fā)展的需要。

一、草莓（一）草莓離體快繁技術(shù)1、外植體6～7月份匍匐莖15～20cm長時取材。2、培養(yǎng)基初代MS+6-BA0.5mg/L+GA30.1mg/L+IBA0.2mg/L增殖MS+6-BA0.5～1.0mg/L。3、生根和馴化1/2MS+IBA0.2～1.0mg/L根2～3cm時煉苗，一周后發(fā)新根，四周后可移栽。（二）花藥培養(yǎng)脫毒1、花藥培養(yǎng)脫毒技術(shù)春季取單核期花蕾（直徑約4mm），4～5℃低溫處理24h。浸入70%酒精30s，漂白粉或0.1%氯化汞10～15min。剝?nèi)』ㄋ幏旁谂囵B(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+IBA0.2mg/L，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.05mg/L2、脫毒苗的檢測指示植物小葉嫁接鑒定法和電子顯微鏡鑒定法。草莓小葉嫁接法二、柑橘1、莖尖微芽嫁接砧木種子45℃溫水浸泡5min—55～56℃熱水處理50min—取出吸干—消毒—剝?nèi)シN皮—種子接種于MS培養(yǎng)基—27±1℃暗培養(yǎng)—2周后萌發(fā)芽苗可作砧木。

接穗材料強健新梢—熱空氣處理45min(50℃)—取lcm長芽條—消毒處理—切取0.14～0.18mm微莖尖。砧木苗切去長根和子葉，上胚軸留1～1.5cm切除頂部，垂直于莖，切開一個倒T字形切口，將微莖尖放置于砧木切口內(nèi)，莖尖底部和砧木切口形成層緊密貼合。

嫁接苗轉(zhuǎn)植于新鮮培養(yǎng)基上，27±1℃、16h光照，2～4周后抽生新芽，成活率可達(dá)20%～50%。5～8周可移植。

柑橘花藥培養(yǎng)示意圖2、無病毒苗的繁殖經(jīng)無病毒苗鑒定后選出無病毒良種苗木，可建立原種母本園。在隔離區(qū)，按無病苗的栽培要求建成無病良種母本園，供繁殖無病苗木采穗用。三、香蕉（一）花序軸切片培養(yǎng)1、花序軸切片香蕉果穗已完全抽出時采上部末結(jié)實花序，無菌下剝?nèi)“プ臃?。取頂?0～15cm長的花序軸段，滅菌后橫切成2～3cm厚的薄片，再縱切成數(shù)片。2、培養(yǎng)過程常用MS培養(yǎng)基，也可用SM或改良MS，繼代也可用Knudson培養(yǎng)基。香蕉雄花序外植體誘幼苗過程（二）影響試管育苗的關(guān)鍵技術(shù)

芽的反復(fù)增殖是香蕉試管育苗的技術(shù)關(guān)鍵。

芽的增殖效果如何，較重要的衡量指標(biāo)是增殖率和代期（—次繼代培養(yǎng)的時間），均與生長調(diào)節(jié)劑關(guān)系最為密切。細(xì)胞分裂素以6-BA3～4mg／L為宜，增殖率可達(dá)到4以上，代期為3～4周，因而增殖效率高。第三節(jié)蔬菜組織培養(yǎng)

一、番茄

1、花藥培養(yǎng)

⑴取花藥3～7mm長、單核中期的花蕾。

⑵將花蕾用0.1‰吐溫40溶液浸泡5min—70％酒精15s—3％的漂白粉10min—無菌水沖洗—接種

⑶從花蕾中取出花藥，接種在DBMII＋2.0mg/LNAA＋1.0mg/LKIN的培養(yǎng)基上，27℃、24h光照后黑暗下培養(yǎng)。2、葉培養(yǎng)

⑴取無菌幼嫩葉片，切成5×5mm的小塊。

⑵MS＋0.2mg/LIAA＋2mg/LBA27℃、光。

⑶25天后，愈傷組織分化芽。一個月后每切塊長出2～5個芽。

⑷芽轉(zhuǎn)到無激素的MS培養(yǎng)基上，5～10d后形成根。

3、胚培養(yǎng)⑴外植體的制備授粉后30～40d果實—95%乙醇消毒—5%NaCl中5min—無菌蒸餾水充分淋洗除去種子上的膠狀復(fù)被。⑵培養(yǎng)基MS附加硫胺素3.0um。pH6.0。附加2.4－D9.05um,IiP4.92um和椰乳100ml/L的MS用做愈傷組織啟動和保存培養(yǎng)基。⑶培養(yǎng)條件愈傷組織啟動和保存暗培，27℃。再生生根20～30℃、16h/d，熒光下進(jìn)行二、甘藍(lán)1、取材和處理剝?nèi)ト~球的葉片，留下中心柱和腋芽，—70%酒精1-2分鐘—0.2%升汞10-15分鐘—剝離腋芽—接種在繁芽培養(yǎng)基上（MS+IAA0.2-0.5mg/L+6BA1.0-3.0mg/L）2、培養(yǎng)

光照1000-3000lx,12-13h/d,20±2℃，濕度50%-60%。3、擴(kuò)大繁殖重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)繁，直到達(dá)到要求繁殖數(shù)量為止。第四節(jié)觀賞植物的組織培養(yǎng)蘭花蘭花系蘭科植物，在自然條件下主要靠分株繁殖，繁殖率一年只有幾倍，所以無法大量繁殖生產(chǎn)，而且由于長期進(jìn)行無性繁殖，帶病毒株增多，逐漸使種性降低，影響生長。

1、取材和處理切取lOcm長生長健壯的莖尖，去苞葉洗凈—75％酒精—5％的漂白粉10min—無菌水沖洗—接種。在蘭花葉片組織培養(yǎng)中，應(yīng)選擇帶有嫩葉的花梗，以后的處理方法同莖尖。2、原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)莖尖生長點或葉片接種在原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。因蘭花種類而異，可以用固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基中應(yīng)加比較多的蔗糖)。凡原球莖切口處不變褐或變褐物質(zhì)排出量較少的種類，可用固體培養(yǎng)基，而易變褐的種類，最好用液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)溫度應(yīng)于23℃，光照強度1500-20001x。原球莖的增殖3、苗的分化培養(yǎng)蘭科植物與其他草本花卉不同，它不易受生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，一般是將原球莖轉(zhuǎn)入離子濃度較低的培養(yǎng)基中，加入一些如椰子汁等天然提取物質(zhì)，效果會更好，原球莖很快再生成植株。lcm高的幼苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～6個月，使其長3～4片葉、3～4條根、3～10cm高，可移栽在泥炭和蛭石中，保濕弱光施肥。原球莖再分化蝴蝶蘭第五節(jié)藥用植物離體培養(yǎng)蘆薈蘆薈不能自花授粉結(jié)實，因此，用種子繁殖非常困難。目前的繁殖方法主要是分株和分蘗，但難以快速、大量地繁殖種苗，這也是當(dāng)前蘆薈種苗昂貴的重要原因之一。（一）材料和培養(yǎng)基

取l0-l5cm高的蘆薈幼苗

誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA

分化培養(yǎng)基為MS+(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA

生根培養(yǎng)基為MS+(0.1-0.5mg/L)IBA+(2-5mg/L)PP333（二）繁殖方法

1、愈傷組織培養(yǎng)

莖尖部分—75%乙醇30-60s—升汞5-l0min—無菌水沖洗數(shù)次—解剖刀取出組織切塊—接種

培養(yǎng)條件:光照10-12h，1000一2000Lx，(25士)2℃。15-25d后，可膨大成愈傷組織，1周后，就可將愈傷組織轉(zhuǎn)管進(jìn)行繼代培養(yǎng)或分化培養(yǎng)。2、繼代、分化培養(yǎng)

同誘導(dǎo)

3、生根培養(yǎng)

培養(yǎng)條件同分化，半個月后即可生根。

4、煉苗

清水噴濕，在15-25℃、濕度60%-80%的條件下煉苗24h，也可視情況縮短為l2h。

5、移栽

將幼苗移栽入由蛭石組成的馴化苗圃中馴化，定期噴施馴化培養(yǎng)液和清水，15-20d后，即可移栽。第六節(jié)樹木的離體培養(yǎng)銀杏是園林綠化的珍貴樹種，亦有較高的藥用價值，以葉及種皮入藥，它的葉的制劑能顯著擴(kuò)張腦血管，可治療腦血栓、冠心病、心肌梗塞及大動脈炎等。種仁、有小毒、性平、有斂肺、定喘等功能。因此可說全身都是寶。但常規(guī)繁殖較難，因此組織培養(yǎng)有很大應(yīng)用價值。胚培養(yǎng)（一）取材：選擇生長飽滿的銀杏種子。（二）操作：1、升汞進(jìn)行表面消毒，無菌條件下剝除外皮和胚乳。接種在MS

培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件：光照1500

LX，溫度25度。2、愈傷組織的誘導(dǎo)：1/2MS+IBA濃度梯度（1、3、5、7、10PPM）誘導(dǎo)愈傷組織。將培養(yǎng)3天后的銀杏胚接種在此培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出大量的愈傷組織。3、愈傷組織繼代培養(yǎng)：