生物活性肽分離與分析技術(shù)研究進(jìn)展

生物活性肽分離與分析技術(shù)研究進(jìn)展

生物活性物質(zhì)（也稱為天然活性物質(zhì)）廣泛存在于自然界。從結(jié)構(gòu)上看，生物活性物質(zhì)具有各種生物學(xué)功能（如免疫調(diào)節(jié)、抗凝劑、氧化、細(xì)菌、病毒、抗癌等）。鑒于此,多肽的開(kāi)發(fā)及研究已逐漸成為一大熱點(diǎn),伴隨著分離純化技術(shù)的發(fā)展及一些新方法、新思路的應(yīng)用,使得多肽類物質(zhì)得到了有效的分離。依據(jù)多肽的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性,已有多種分離手段,如:超濾法、SDS、親和層析等,其中,HPLC由于具有重復(fù)性好、分辨率高等優(yōu)勢(shì),在蛋白質(zhì)及多肽小分子中得到了廣泛的應(yīng)用。生物活性肽是指來(lái)源于細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物等,對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或有重要生理功能的一類生物活性物質(zhì)。廣泛存在于生物體的各種組織中,結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。自1975年,Hughes首先報(bào)道從動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)了具有嗎啡活性的小肽,1902年倫敦大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Buyliss等首次發(fā)現(xiàn)活性多肽物質(zhì)以來(lái),已經(jīng)從動(dòng)物、植物及微生物中分離出多種生物活性肽。近一個(gè)世紀(jì)的研究表明,肽是由20個(gè)天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成的二肽到復(fù)雜的線性和環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱,是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物。活性肽廣泛存在于自然界中,生物體很多活性物質(zhì)都以肽的形式存在,可以從不同的角度分類,例如:按來(lái)源分為內(nèi)源性生物活性肽和外源性生物活性肽;按功能分為生理活性肽和食品感官肽;按取材分為海洋生物活性肽和陸地生物活性肽等。1檢測(cè)方法分類隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展,從天然產(chǎn)物中獲取活性多肽的分離、分析手段也不斷得到提高,并出現(xiàn)一些新方法,多肽提取分離常用的方法包括化學(xué)萃取法(如醇提、丙酮法)、酶解法、沉淀法、超濾法、逆流分溶法、層析法、電泳法等。高效液相色譜(HPLC)是生物技術(shù)中分離純化的重要方法,在多肽、蛋白質(zhì)的分離純化工藝中顯示出優(yōu)異的性能,RP-HPLC特別適用于質(zhì)量不大的蛋白質(zhì)和多肽物質(zhì)的分離純化,主要用于分子量低于5000,尤其是1000以下的非極性小分子多肽的分析和純化,具有十分高的分辨力,常見(jiàn)的有高效離子交換色譜、高效凝膠過(guò)濾色譜、反相高效液相色譜和高效親和液相色譜等。1.1rp-hplc的特性反相高效液相色譜是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相,極性有機(jī)溶劑或其水溶液作為流動(dòng)相,根據(jù)溶質(zhì)疏水性的差別進(jìn)行分離純化的洗脫色譜法。該方法于20世紀(jì)80年代后應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸的分離、純化及鑒定,與其他色譜方法相比,RP-HPLC具有分辨率和回收率高、重復(fù)性好和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。另外,在RP-HPLC中,蛋白質(zhì)分子通過(guò)色譜柱時(shí)會(huì)發(fā)生或多或少的去折疊,內(nèi)部某些疏水殘基暴露并與固定相相互作用,從而表現(xiàn)出與其他色譜及電泳方法不同的選擇性。在混合肽的分離中,可通過(guò)對(duì)流動(dòng)相和固定相的調(diào)控來(lái)提高分離效率,包括改變樣品的離子對(duì)性質(zhì)、固定相上分布的功能基團(tuán)、色譜柱規(guī)格以及溫度、pH值等,嚴(yán)作廷等通過(guò)HPLC對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜洗脫樣品進(jìn)行分離,純化出一個(gè)新的抗菌肽分子。1.2蛋白質(zhì)分離技術(shù)高效親和液相色譜是將經(jīng)典親和色譜的高特異性同高效液相色譜的快速、高效相結(jié)合產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)的分離技術(shù)。多數(shù)蛋白質(zhì)都可以用該方法得到純化,特別適合糖蛋白、疫苗等的分離純化,在蛋白質(zhì)化學(xué)中有著廣泛的用途,楊祖英等采用高效親和色譜柱(PharmaciaHI-TrapProteinG柱),在pH值為2.5的鹽酸條件下洗脫IgG進(jìn)行測(cè)定。1.3hpiec分散系統(tǒng)集成法高效離子交換色譜(HPIEC)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子在一定pH值和離子強(qiáng)度條件下所帶電荷的差異進(jìn)行分離的方法。由于HPIEC是一吸附性的梯度洗脫過(guò)程,所以具有很好的負(fù)載力。李蓉等采用高效陽(yáng)離子交換色譜分離純化蛋清中的溶菌酶,該方法較傳統(tǒng)軟基質(zhì)低壓離子交換色譜分離速度快、純化效率高。1.4色譜分離技術(shù)高效凝膠過(guò)濾色譜是根據(jù)分子相對(duì)大小進(jìn)行分離的一種色譜技術(shù)。該技術(shù)較溫和,適用范圍較廣,如:平衡柱、分離樣品的緩沖液等。Bunger等分離出了疏水性的表面活性劑蛋白。1.5高效液相色譜技術(shù)超臨界流體色譜(SFC)始于20世紀(jì)60年代,是采用接近或超過(guò)臨界溫度和臨界壓力的高壓流體作為流動(dòng)相的一種新穎的色譜技術(shù),具有分離速度快、柱效高、分離溫度低和易保持生物產(chǎn)品的生物活性等特點(diǎn)。主要分為兩大類,一類是以向GC技術(shù)接近并在早期是主流方向的毛細(xì)管超臨界流體色譜技術(shù)(cSFC),另一類是向HPLC技術(shù)靠近的填充柱超臨界流體色譜技術(shù)(pSFC),該技術(shù)在成分富集、分離純化的應(yīng)用上取得了突破。用于SFC分析的天然產(chǎn)品種類比較多,如熱不穩(wěn)定的天然脂類、甾類化合物、多元不飽和脂肪酸及其酯、天然色素、氨基酸、糖類等。1.6膜技術(shù)在生物樣品分離和分析領(lǐng)域中的應(yīng)用毛細(xì)管電色譜法(CEC)是近10年來(lái)綜合了現(xiàn)代最新分離技術(shù)HPLC和毛細(xì)管電泳(CE)的優(yōu)勢(shì)而發(fā)展起來(lái)的高效電分離微柱液相色譜技術(shù)。1952年,Mould和Synge首次在色譜分析上以電滲流驅(qū)動(dòng)在薄層色譜分離了膠棉中的多糖化合物,之后該技術(shù)于1974年由Pretorius等首先成功提出,但當(dāng)時(shí)并沒(méi)有引起足夠的重視。近年來(lái),CEC技術(shù)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域,將更有效、快速地分離生物分子,特別是在核酸、蛋白質(zhì)和小肽等方面的應(yīng)用有著廣泛的前景。隨著生命科學(xué)的發(fā)展,新型、快速、高效的蛋白質(zhì)分離、分析技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展具有十分重要的意義,CEC的出現(xiàn)為生物樣品的分離提供了一條新的途徑。趙良娟等采用反相梯度Pcec-UV在7.5min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了核糖核酸酶A、細(xì)胞色素C、溶菌酶和肌紅蛋白等4種蛋白質(zhì)的分離。Gucek等采用無(wú)鞘流式CEC-納流ESI-ESI對(duì)混合肽進(jìn)行分析,建立了一種高靈敏檢測(cè)肽類物質(zhì)的新方法,Fu等研究用親水離子CEC(HI-CEC)很好地分離了9種小肽,由于毛細(xì)管電色譜高效且選擇性高等優(yōu)勢(shì),近十幾年來(lái),其應(yīng)用得到了長(zhǎng)足的發(fā)展,但整個(gè)技術(shù)至今尚未標(biāo)準(zhǔn)化,還存在不少問(wèn)題。1.7徑向離子交換分離徑向流色譜的色譜分離利用物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)差異來(lái)進(jìn)行分離,當(dāng)兩相作相對(duì)移動(dòng)時(shí),被分離物質(zhì)在兩相間經(jīng)反復(fù)多次分配,原來(lái)微小的分配差異便會(huì)產(chǎn)生很大的效果,從而使各組分分離,具有操作壓力低、線性放大容易、分離效率高等優(yōu)點(diǎn),目前,該技術(shù)主要集中在離子交換徑向流分離純化蛋白質(zhì)和核酸方面。郭立安等利用徑向離子交換色譜技術(shù)從促性腺激素(HMG)的粗提物中很好地分離純化了促卵泡激素(FSH)。孫濤等利用國(guó)產(chǎn)膜徑向離子交換色譜柱分離純化了Nitschmann組分中凝血酶Ⅲ中的凝血酶原復(fù)合物,該色譜的應(yīng)用,使色譜過(guò)程的流速大為提高。1.8多維分離體系多維高效液相色譜法(MD-HPLC)系統(tǒng)以其快速、高效、自動(dòng)化程度高以及容易與質(zhì)譜等其他技術(shù)聯(lián)用等優(yōu)勢(shì)而成為蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)分析技術(shù)中研究的熱點(diǎn),也受到食品衛(wèi)生以及環(huán)保等領(lǐng)域的重視。該技術(shù)是指將樣品注入呈正交分布的多個(gè)分離體系中,樣品中各組分以進(jìn)樣點(diǎn)為原點(diǎn)在多維的分離方向上展開(kāi),是目前解決復(fù)雜體系分離、分析問(wèn)題最有前景的手段,盡管多維高效液相色譜最適合分離復(fù)雜化合物,但它也適用于對(duì)含有相對(duì)簡(jiǎn)單目標(biāo)化合物的混合物進(jìn)行快速掃描分析。劉少華等通過(guò)多維高效液相色譜結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn),從舟山黃?？侄局泻Y選了多種具有強(qiáng)殺蟲(chóng)活性以及低哺乳動(dòng)物活性的殺蟲(chóng)肽?？傊?該技術(shù)可以提供很高的峰容量,以滿足復(fù)雜體系樣品分析的需要。2抗菌肽的純化多肽的種類很多而且大多具有相似性,使用單一的分離純化手段已經(jīng)不能達(dá)到理想的分離純化效果,HPLC具有不能大規(guī)模制備、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn),因此與其他分離方法的聯(lián)用具有巨大的優(yōu)點(diǎn)。趙暉等通過(guò)陽(yáng)離子交換柱SP-Sepharose、AKTASuperdex75及RP-HPLC對(duì)人精漿中小分子抗菌肽逐級(jí)純化。齊珂珂等使用氯化銨裂解、超聲波破碎、醋酸提取、CM-SepharoseFF弱酸性陽(yáng)離子交換柱RP-HPLC等方法,從鴕鳥(niǎo)白細(xì)胞中分離純化出了抗菌肽,同時(shí)應(yīng)用二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)對(duì)抗菌肽的分子量和氨基酸序列進(jìn)行了測(cè)定。鐘山等應(yīng)用SephadexDEAEA-50陰離子交換樹(shù)脂色譜、SephadexG25和SephadexLH-20凝膠過(guò)濾色譜及RP-HPLC分離純化水蛭抗凝血活性多肽,并采用HPLC及SDS鑒定了化合物的純度,并在該基礎(chǔ)上,對(duì)其分子量及氨基酸組成進(jìn)行了測(cè)定。HPLC與其他方法的聯(lián)用,彌補(bǔ)了各自的不足,在蛋白多肽的分離