多肽類藥物分析方法的研究進(jìn)展

多肽類藥物分析方法的研究進(jìn)展

氨基酸是由氨基酸組成的聚合物。氨基酸殘基小于20，超過20，稱為遺傳因子。如果超過50，它通常是含有蛋白質(zhì)的材料。多肽涉及人體的激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長和生殖各領(lǐng)域,其重要性在于調(diào)節(jié)體內(nèi)各系統(tǒng)和細(xì)胞的生理功能,最終產(chǎn)生特定的生理效應(yīng)。多肽類藥物一直是藥物開發(fā)的主要方向,它包括多肽激素、細(xì)胞生長因子、淋巴因子、凝血因子和酶等,用于治療腫瘤、病毒性肝炎、艾滋病及一些自身免疫性疾病?，F(xiàn)就近年來多肽類藥物分析方法的研究進(jìn)展作一綜述。1多媒體分析方法1.1離體生物變化多肽類藥物的生物活性不僅取決于藥物的一級結(jié)構(gòu),而且與二、三級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。生物檢定法用于研究該類藥物的藥動(dòng)學(xué)的獨(dú)特性及檢定標(biāo)記藥物的生物活性,主要有在體分析和離體分析兩大類。在體分析法分析多肽類藥物在整體動(dòng)物中引起的特異生物學(xué)反應(yīng)。力達(dá)霉素是含110個(gè)氨基酸的酸性蛋白,其有效部位發(fā)色團(tuán)分子極不穩(wěn)定,陳淑珍等用生物檢定法研究力達(dá)霉素活性濃度在小鼠和犬的藥動(dòng)學(xué),綜合運(yùn)用同位素法,全面反映了藥物在體內(nèi)的處置過程。離體分析法通常用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù),以細(xì)胞增殖、分化或細(xì)胞毒性為基礎(chǔ),以細(xì)胞數(shù)的增減為量效指標(biāo)。董躍偉等研究培養(yǎng)基、雞血漿和雞胚浸液的比例、背根神經(jīng)節(jié)部位、培養(yǎng)時(shí)間等對神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactorNGF)刺激神經(jīng)節(jié)生長的影響,建立了細(xì)胞體外培養(yǎng)法檢測NGF活性的優(yōu)化條件。結(jié)果顯示,伊莎褐雞胚腰椎背根神經(jīng)節(jié)在終濃度30ng/mL蛇毒NGF刺激下,用含20%雞血漿和15%雞胚浸液的培養(yǎng)基培養(yǎng)36h,取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.2免疫活性測定多肽類藥物是一種抗原或配體(或受體),有相應(yīng)的抗體或受體(或配體),用免疫學(xué)方法及受體配體結(jié)合法可定量測定其免疫活性或結(jié)合活性。常用的有放射免疫測定(radioimmuneassay,RIA)、免疫放射測定試驗(yàn)(immunoradiometricassay,IRMA)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。免疫學(xué)方法測定的是多肽的免疫活性而不是生物活性,不能同時(shí)測定代謝物,具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結(jié)果誤差,也易受內(nèi)源性物質(zhì)干擾。沈宏杰等比較ELISA法和美國國家衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)效力檢定試驗(yàn)法檢測狂犬病純化疫苗的質(zhì)量,結(jié)果表明二者無顯著差異,但ELISA法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、檢測周期短,避免了NIH法實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受動(dòng)物健康狀況影響的缺陷。1.3內(nèi)標(biāo)法細(xì)胞外標(biāo)法放射性同位素標(biāo)記法是研究多肽類藥物的主要工具,分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。蛋白質(zhì)中如含有酪氨酸或賴氨酸等適宜的氨基酸,可用外標(biāo)法(將標(biāo)記物如125I以化學(xué)方法偶聯(lián)至完整蛋白質(zhì)中),常用的有氯胺T法;外標(biāo)法不可行時(shí)可用內(nèi)標(biāo)法(將標(biāo)記3H,14C或35S等同位素的氨基酸加入生長細(xì)胞或合成體系中,獲得含同位素的多肽分子)。內(nèi)標(biāo)法因操作復(fù)雜而少用。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)能促進(jìn)血管生成,黃定德等用放射性核素99mTc間接標(biāo)記VEGF125-136,測定6只家兔靜脈注射37MBq99mTc-VEGF125-136后不同時(shí)間血漿中藥物的放射性濃度,通過HPLC純化標(biāo)記產(chǎn)物,99mTc–VEGF125-136的放射化學(xué)純度大于97%,99mTc-VEGF125-136在家兔體內(nèi)的代謝符合三室模型,且血液清除快而停留于周邊血管豐富的組織時(shí)間相對較長。1.4gcip的標(biāo)記同位素標(biāo)記示蹤法與其他手段聯(lián)合包括十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS)、三氯醋酸沉淀(trichloroaceticacid,TCA)、HPLC法。王秀芹等給小鼠靜脈注射G蛋白抑制肽(Gproteincompetitiveinhibitorypeptide,GCIP-27)后,用氯甘脲法標(biāo)記125I-GCIP,用同位素示蹤法結(jié)合TCA或低相對分子質(zhì)量(Mr)SDS電泳法,測定血漿中GCIP的濃度。結(jié)果表明,GCIP-27在小鼠體內(nèi)按一級動(dòng)力學(xué)代謝,并呈三室開放模型。1.5多肽蛋白水解酶的結(jié)構(gòu)及指紋圖譜的構(gòu)建肽譜圖分析是控制多肽藥物質(zhì)量的重要手段。肽譜圖對每一種多肽藥物都是特征的、專一的,因此可鑒別多肽,預(yù)測其一級結(jié)構(gòu)特征。肽譜分析根據(jù)多肽Mr大小和氨基酸的組成特點(diǎn),將蛋白水解酶作用于特殊的肽鏈位點(diǎn),將多肽裂解成較小片段,通過相應(yīng)分離檢測手段得到特征性指紋圖譜。用于色譜分析的有HPLC、高效毛細(xì)管電泳法(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)、凝膠電泳法等。1.5.1檢測多肽化合物的表達(dá)目前用于分析多肽的HPLC模式主要有3種:(1)凝膠過濾色譜,根據(jù)多肽分子的大小分離;(2)離子交換色譜,根據(jù)多肽分子具有的帶電基團(tuán)的性質(zhì)和數(shù)量分離;(3)反相色譜,根據(jù)多肽分子疏水性的強(qiáng)弱分離。復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液含N-甘氨酰-L-谷氨酰胺(GQ)和N-甘氨酰-L-酪氨酸(GY)兩種二肽,葉曉林等以2,4-二硝基氟苯為衍生劑,通過柱前衍生化,紫外檢測器測定,建立了測定GQ和GY含量的方法,可見對于沒有紫外吸收的多肽類藥物,可通過柱前衍生化生成具有紫外吸收的的物質(zhì),采用HPLC進(jìn)行檢測。腦蛋白水解物注射液主要含游離氨基酸和小分子多肽,龔繼華等用HPLC分離檢測,32min內(nèi)16種氨基酸完全分離。1.5.2caper顯著提高免疫能力的檢測CE的分離模式包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(micellarelectrokineticcapillarychromatography,MECC)、毛細(xì)管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis,CGE)、毛細(xì)管等電聚焦(capillaryisoelectricfocusing,CIEF)和毛細(xì)管等速電泳(capillaryisotachophoresis,CITP),因CZE適于分離帶電溶質(zhì),故在多肽類分析測定中應(yīng)用較多。程明剛等用HPCE檢測尿液中痕量血纖肽A(fibrinopeptideA,FPA)和纖肽B(FPB),二者和內(nèi)標(biāo)可在16min內(nèi)很好地分離,建立了一種新的檢測纖維蛋白肽的方法。蔣最明等用血清免疫固定電泳為645例患者的血清免疫分型,將陽性結(jié)果與CZE-免疫削減法分型結(jié)果比較,表明CZE可有效地免疫分型特征性的、大量的M蛋白。張志斐等從蒙古黃芪中提取多肽,經(jīng)CIEF測定其組成及各組分的等電點(diǎn),表明多肽由2種組分組成,其等電點(diǎn)分別為8.23和4.26。1.5.3重組人奈西立肽的鑒定分析Mr小于10000的多肽較困難,李響等用毛細(xì)管SDS無膠篩分電泳法,以水溶性、低黏度的羥丙基甲基纖維素作為篩分介質(zhì),測定了重組人奈西立肽、重組人表皮生長因子、虎紋鎮(zhèn)痛肽、重組人心鈉肽4種重組小分子多肽的Mr。1.6解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(massspectrometry,MS)具有高靈敏性和快速性,特別適合分析多肽類物質(zhì)。MS包括連續(xù)流快原子轟擊(continuousflow-fastatombombardment,cf-FAB)質(zhì)譜法,電噴霧離子化(electrosprayionization,ESI)質(zhì)譜法和表面增強(qiáng)激光解析/離子化飛行時(shí)間(surfaceenhancedlaserdesorptionionization-timeofflight,SELDI-TOF)質(zhì)譜法。cf-FAB是一種弱離子化技術(shù),可將肽類或小分子蛋白離子化成MH+形式。主要用于分離檢測肽類,具有中等分辨率,常與HPLC、CZE等結(jié)合用于分離分析,現(xiàn)已建立了許多多肽的cf-FAB分析方法。ESI更適合分析Mr大的多肽,需要?dú)饣蛴袡C(jī)溶劑使樣品敏感化。ESI可產(chǎn)生多價(jià)離子化,允許分析Mr達(dá)1×105的蛋白。周紅華等用ESI以及源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離技術(shù)測定胸腺五肽,測得Mr為679.4,與理論值一致。方劍英等用ES分析9個(gè)環(huán)孢菌素類化合物的強(qiáng)酸水解物,獲得一些組成氨基酸的特征性分子離子峰,可用于環(huán)孢菌素類化合物的快速鑒別。SELDI-TOF是近年發(fā)展起來的,根據(jù)不同質(zhì)荷比的分子在真空電場中飛行時(shí)間的差別,繪制出質(zhì)譜圖,獲得相對分子質(zhì)量和豐度等信息。馬寧等用SELDI-TOF檢測胰腺癌患者血清,篩選到4個(gè)差異蛋白質(zhì),可能是胰腺癌患者血清的特異性生物標(biāo)記物。1.7nmr法檢測多肽的理化性質(zhì)核磁共振法(nuclearmagneticresonance,NMR)廣泛用于解析化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性能,已發(fā)展為分子生物學(xué)的重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)。NMR主要用于核定多肽的微觀理化性質(zhì),可以檢測一些不能用X-射線晶體衍射分析方法檢測的多肽。NMR法還可提供三維結(jié)構(gòu)信息,NMR譜的線寬、馳豫時(shí)間和磁化轉(zhuǎn)移等可以反映多肽的生物功能特別是酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程。胸腺五肽是胸腺生成素Ⅱ的第32~36位氨基酸殘基片段,具有與胸腺肽相同的生理功能,梁涌濤等用NMR、二維核磁共振(2D-NMR)、紅外、紫外及質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)技術(shù),研究了胸腺五肽的分子結(jié)構(gòu)特征,對其氫譜和碳譜進(jìn)行了完全歸屬,為多肽類藥物的定性及純度分析提供了科學(xué)依據(jù)。1.8hv12p-rpa新的質(zhì)譜及質(zhì)譜條件近年逐步發(fā)展成熟的色譜-光譜聯(lián)用技術(shù)使色譜分離與光譜鑒定成為連續(xù)過程,集色譜的高分離效能和光譜的強(qiáng)鑒定能力于一體,主要包括液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用(CE/MS)、氣質(zhì)聯(lián)用、液相色譜-核磁共振聯(lián)用和液相色譜-核磁共振-質(zhì)譜聯(lián)用,在多肽類藥物分析中應(yīng)用較多的是LC-MS、CE/MS。重組人白細(xì)胞介素-2(IL-2)是一種在大腸桿菌中表達(dá)用于治療腫瘤的生物大分子藥物,目前尚缺乏有效控制其最終產(chǎn)品質(zhì)量的方法。周國華等用HPCE、飛行時(shí)間質(zhì)譜和電噴霧離子化質(zhì)譜,通過測定IL-2表達(dá)的正確性、產(chǎn)物的純度和均一性研究IL-2的產(chǎn)品質(zhì)量。結(jié)果表明3種方法有正交互補(bǔ)性,測定結(jié)果可相互印證,質(zhì)譜法可用于測定純度。水蛭素是強(qiáng)凝血酶抑制劑,其C端12肽具有凝血酶功能,而水蛭素12肽-瑞普替酶融合蛋白(HV12p-rPA)兼有溶栓和抗凝活性,余蓉等用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析HV12p-rPA的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解產(chǎn)物,結(jié)果表明,胰凝乳蛋白酶酶解產(chǎn)物含有水蛭素12肽,多肽匹配度超過3.0,目標(biāo)蛋白氨基酸序列覆蓋率超過85%。LC-M