抗體制備的研究進(jìn)展

抗體制備的研究進(jìn)展

作為一種研究工具，抗生素在現(xiàn)有的科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)工作中發(fā)揮著重要作用。因此，對抗生素準(zhǔn)備的要求水平有所增加。近年來,針對抗體制備過程中抗體的分類、抗原制備、免疫動物及免疫方法選擇的研究越來越多,本文旨在對以上幾個方面的科研進(jìn)展進(jìn)行綜述。1細(xì)胞增殖能力的移植抗體分為天然抗體、單克隆抗體、多克隆抗體及基因工程抗體4類。1975年英國劍橋大學(xué)米爾修塔博士把淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞,雜交瘤細(xì)胞克服淋巴細(xì)胞克隆的困難,可以使淋巴細(xì)胞在體外無限增殖,這種無限增殖能力是骨髓瘤細(xì)胞增殖能力的移植。當(dāng)具有無限增殖能力的淋巴細(xì)胞受到以癌細(xì)胞作為抗原的刺激后,淋巴細(xì)胞就會源源不斷地合成免疫功能單一的抗體。這種由一種抗原決定簇刺激機(jī)體,由一個B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體,具有高度的特異性、選擇性和專一性。1888年,Emile和Yersin發(fā)現(xiàn)白喉桿菌可以產(chǎn)生外毒素。隨后,1890年Behring和Kitasato用白喉外毒素免疫動物后,在該動物血清中發(fā)現(xiàn)了可以中和白喉外毒素的物質(zhì),稱之為抗毒素,然后用同樣方法通過免疫血清成功治愈了1例患白喉病的女孩。像這種由多種抗原決定簇刺激機(jī)體,一系列抗體生成細(xì)胞會不同程度地與抗原結(jié)合,在血液中相應(yīng)地產(chǎn)生不同類型的單克隆抗體,這種由一種抗原刺激產(chǎn)生的混雜在一起的單克隆抗體稱為多克隆抗體。1.1抗體沉淀和凝集反應(yīng)單克隆抗體和多克隆抗體各有其優(yōu)缺點?？傮w來講,單克隆抗體特異性高,制備成功后就可以繼續(xù)生產(chǎn)完全一致的抗體,但單克隆抗體不能進(jìn)行沉淀和凝集反應(yīng),所以很多檢測方法不能使用單克隆抗體完成,而且反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體,且制備技術(shù)復(fù)雜,費時費工,實驗周期長,價格也高。因此,在科研領(lǐng)域中使用較多的是多克隆抗體。1.2抗體擴(kuò)大的觀察當(dāng)抗原注射入實驗動物體內(nèi)時,刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng),使淋巴結(jié)和脾臟的淋巴細(xì)胞大量增殖。首次注射后大約7d,在血清中可以觀察到抗體,但抗體的濃度維持在一個較低的水平,大約10d抗體的滴度會達(dá)到最大值。但同種抗原注射而產(chǎn)生的二次免疫應(yīng)答的結(jié)果明顯不同,和初次免疫應(yīng)答相比抗體的合成速度明顯增加并且保留時間也長。進(jìn)而通過Elisa方法檢測抗體的效價,通過Western-blot方法檢測抗體的特異性。2多肽原原核的制備原核表達(dá)與多肽合成目的蛋白各有優(yōu)缺點。原核表達(dá)可以在較短的時間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物,所需成本較低,但是也有些外源基因無法進(jìn)行原核表達(dá)。多肽合成是將分析好的多肽抗原進(jìn)行固相或液相合成,抗原性高,但成本也高。因此在實際實驗過程中應(yīng)該把原核表達(dá)和多肽合成有效結(jié)合起來完成多克隆抗體的制備。2.1基因片段原核表達(dá)載體的純化在不同類型的表達(dá)系統(tǒng)中,最早采用的是原核表達(dá)系統(tǒng)。此項技術(shù)主要是將克隆有目的基因片段的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌株(一般是大腸桿菌),在IPTG誘導(dǎo)、純化下獲得所需目的蛋白,所需時間較為短暫,成本低。而且大腸桿菌遺傳背景清楚,具有周期短、使用安全、易操作等特點,因此成為外源基因的首選表達(dá)系統(tǒng)。2.1.1確定原核載體的分類基因工程中使用的載體分為克隆載體和表達(dá)載體?？寺≥d體可以使外源基因在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增;而表達(dá)載體適合在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因。原核表達(dá)載體通常以質(zhì)粒形式存在,一個典型的表達(dá)載體應(yīng)該具有啟動子、復(fù)制子、篩選標(biāo)記、多克隆位點、融合標(biāo)簽(如果有的話)、終止密碼子。構(gòu)建原核表達(dá)載體時要學(xué)會看質(zhì)粒圖譜,首先看啟動子(Ori)的位置;其次要看篩選標(biāo)記;再次要看多克隆位點;最后確定質(zhì)粒上是否有啟動子和終止子。原核表達(dá)載體的分類原核細(xì)胞表達(dá)外源基因時,根據(jù)表達(dá)類型不同,可以分為融合型表達(dá)和非融合型表達(dá)。通過非融合型表達(dá)出的外源蛋白不與細(xì)菌的蛋白或者多肽融合在一起,通常以包涵體的形式存在。常見的原核表達(dá)載體有非融合性表達(dá)載體pKK223-3,它具有一個強(qiáng)的tac(trp-lac)啟動子;融合表達(dá)載體pGEX;分泌性克隆表達(dá)載體pINⅢ系統(tǒng)、融合蛋白載體PET系統(tǒng)等。pET系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)載體,目的基因被克隆至pET質(zhì)粒載體,當(dāng)細(xì)胞中有T7RNA聚合酶和T7噬菌體啟動子時,宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄比不上T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng),誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個小時,外源目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋白的50%以上。但是大腸桿菌自身是不表達(dá)T7RNA聚合酶的,因此必須給宿主菌引入外源T7RNA聚合酶,在沒有加入誘導(dǎo)劑的情況下,外源基因處于沉默狀態(tài),不發(fā)生轉(zhuǎn)錄;通過加入誘導(dǎo)劑控制T7RNA聚合酶的產(chǎn)量,從而控制外源蛋白產(chǎn)物的表達(dá)量。2.1.2蛋白酶缺陷型菌株表達(dá)宿主菌株的選擇也是在原核蛋白表達(dá)過程中必須要考慮的因素。菌株內(nèi)源蛋白酶的增多會造成外源表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定,所以在原核表達(dá)過程中多采用蛋白酶缺陷型菌株,例如表達(dá)菌株BL21。BL21(DE3)溶源菌添加了T7RNA聚合酶基因,它含有l(wèi)acUV5啟動子下游的T7RNA聚合酶基因和lacⅠ抑制基因,通過溶源菌在宿主內(nèi)引入T7RNA聚合酶,當(dāng)構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株中后,在lac誘導(dǎo)調(diào)控下通過異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。2.1.3tki的純化影響外源基因在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的因素有:①表達(dá)載體的選擇:在表達(dá)載體上插入輔助基因序列構(gòu)成融合蛋白表達(dá),融合信號肽(PelB、OmpA,MalE,PhoA等)表達(dá)可以通過Sec途徑分泌到胞質(zhì)或胞外,有利于形成二硫鍵以及避免胞質(zhì)蛋白酶的水解和N端甲硫氨酸的延伸。研究表明雙晶氨酸轉(zhuǎn)運體系(Tat)可以有效分泌正確折疊的重組蛋白。常見的純化標(biāo)簽有6-His、GST、CAT等,鏈球菌親和素結(jié)合肽(SBP)、Ca2+依賴的鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP)作為純化標(biāo)簽時,在洗脫液中移去標(biāo)簽依賴性的小分子就可以實現(xiàn)溫和的特異性洗脫;②外源基因中密碼子的使用,如果外源基因中含有相當(dāng)多的稀有密碼子,在原核中表達(dá)效率會偏低;③mRNA穩(wěn)定性影響;④培養(yǎng)條件控制。2.2液相分段合成法多肽是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物,由一種或多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成,合成途徑主要有化學(xué)合成和生物合成。多肽的化學(xué)合成法有液相合成和固相合成之分。多肽化學(xué)合成法分類液相分段合成是在溶液中根據(jù)多肽片段的化學(xué)選擇性或者專一性,自發(fā)合成多肽的合成方法。常用的連接技術(shù)主要有:天然化學(xué)連接、光敏感輔助基連接、化學(xué)區(qū)域選擇連接、施陶丁格連接、可去除輔助基連接和正交化學(xué)連接。固相合成的基本原理是:將所要合成肽鏈羥基末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連,然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組分經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng),接長肽鏈,固相合成法簡化并加速了多步驟的合成,可避免因手工操作和物料重復(fù)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的損失。3免疫動物的制備獲得多克隆抗體的最終步驟是動物免疫。其中選擇合適的免疫動物尤為重要。一般來講,所選擇的蛋白抗原供體與免疫動物種系不可太接近,親緣太近不易產(chǎn)生良好抗體,甚至不產(chǎn)生抗體(如兔和大鼠、雞和鴨)。免疫動物包括家兔、嚙齒類、雞等小型實驗動物以及綿羊、馬、山羊等大型家畜。其中家兔是最適合制備抗體的動物;小鼠一般用于單克隆抗體制備,在需要大量抗血清時,主要用大型家畜。在動物性別、年齡以及數(shù)量上的選擇一般選用雌性、青壯年期1只以上的個體?；疾』蛱幱诟腥?、饑餓狀態(tài)均會影響免疫效果,因此應(yīng)選用健康壯實的動物。在實際免疫過程中還需要根據(jù)不同性質(zhì)的免疫原選擇使用動物進(jìn)行免疫。對于蛋白質(zhì)抗原來講,大部分動物均適合,最常用的是家兔和山羊。當(dāng)某些動物體內(nèi)有類似物質(zhì)存在時,蛋白質(zhì)抗原免疫原型變差,例如胰島素對家兔、IgE對綿羊免疫后不容易產(chǎn)生抗體。4免疫方法4.1弗氏完全佐劑的制備免疫過程中需要弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。弗氏不完全佐劑一般用液體石蠟與羊毛脂混合而成,在不完全佐劑中加入活卡介苗或死的結(jié)核分枝桿菌,即成為弗氏完全佐劑。由于佐劑是油狀物質(zhì),因此必須將弗氏佐劑和抗原充分混勻成乳劑,鑒定混勻的方法是將一滴乳劑滴入水中,如呈一滴不散,漂浮于液面上,則表示完全乳化。4.2免疫劑量的選擇免疫動物時應(yīng)考慮動物個體狀態(tài)、抗原性的強(qiáng)弱、抗原分子大小選擇合適的免疫劑量。一般來講,首次注射后,每次注射間隔1周左右,注射4次,在采集免疫血清前,必須先對抗體的效價進(jìn)行測定,達(dá)到要求時再進(jìn)行采血。4.3肌肉注射和牛奶注射免疫途徑包括皮下、靜脈注射或皮內(nèi)注射、肌肉注射、腹腔注射、淋巴結(jié)注射等。在雞上的研究顯示在腿部肌肉注射會取得更高的抗體效價;在奶牛上研究后海穴的注射也會取得較高的效價;兔子和小鼠一般在腹部皮膚注射會取得比較好的效果。4.4采血常用方法在測定抗體效價后,開始采集免疫血清,采集前讓動物禁食24h以防血脂過高。目前采血主要包括靜脈采血法、頸動脈放血法和心臟采血法。靜脈采血法可使動物保持活體狀態(tài),并可多次采血,缺點是每次獲得血量較少。頸動脈放血法和心臟采血法獲得血量較多,但需要熟練的手術(shù)技術(shù)。4.5免疫血液清的保存凍存血清前將血清分裝