單壁納米碳管對小鼠灌胃給藥的生物安全性研究

單壁納米碳管對小鼠灌胃給藥的生物安全性研究

1991年，納米碳管（cnt）發(fā)現(xiàn)，主要分為兩類：單壁納米碳管（swt）和多壁納米碳管（mwt）。SWNT是由單層石墨烯卷成直徑為0.4～2nm的圓筒,是理想的分子纖維。其中空結(jié)構(gòu)尤其適用于納米藥物載體。CNT在生物醫(yī)藥有廣泛的應(yīng)用前景,已經(jīng)成功應(yīng)用于生物感應(yīng)器,藥物載體和疫苗載體,但是在CNT廣泛應(yīng)用于這些生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域之前,必須評價接觸CNT的專業(yè)人員的健康問題、安全問題,尤其是作為藥物載體應(yīng)用,生物安全性是必須弄清的首要問題。由于CNT的溶解度非常低,幾乎不溶于水且極易團聚等特點,給研究帶來極大的困難。目前已有的研究結(jié)果大多是關(guān)于已修飾的、可溶于水的CNT對全身各組織器官的影響。采用修飾過的CNT雖然解決了它難溶于水的問題,但是從化學(xué)概念上講這種經(jīng)過修飾的CNT不再是制備人員首先接觸到的CNT,而變成是CNT的衍生物。當(dāng)前,關(guān)于CNT毒性的研究主要集中于CNT對活體的肺臟,皮膚以及體外培養(yǎng)細胞的研究。而對于CNT經(jīng)消化道的研究幾乎沒有。對于其作為藥物載體應(yīng)用,消化道吸收尤為重要。目前關(guān)于CNT的體內(nèi)分布、生物行為和生物安全性,只有一些間接證據(jù),沒有直接證據(jù),更缺乏形態(tài)學(xué)證據(jù)。這里,筆者用未進行任何修飾的SWNT,經(jīng)胃腸道投用,并對其損傷作用進行研究。1學(xué)技術(shù)中心某昆明種小鼠,18～22g,雌雄不拘(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)。SWNT(由國家納米科學(xué)技術(shù)中心)。KQ118型超聲波清洗器(昆山市超生儀器有限公司),BX-50顯微鏡(日本OLYMPUS公司),CM120型透射電鏡(荷蘭Philips公司),日立7020型全自動生化儀(日本日立公司),JT-IR型庫而特牌血細胞自動分析儀(美國貝克曼公司)。2方法2.1sw懸浮液的制備取SWNT加生理鹽水,超聲振動120min,分別制備3.3,6.6,9.9g·L-1的SWNT懸液。2.2swnt的劑量昆明種小鼠40只,18～22g,按照隨機分組的方法,每8只小鼠為一組,共分5組。陰性對照組,每只小鼠給予生理鹽水0.3mL;陽性對照組,每只小鼠給予體積分數(shù)50%乙醇0.3mL;SWNT低劑量組,小鼠按50mg·kg-1劑量灌胃給予3.3g·L-1SWNT的生理鹽水懸液0.3mL;SWNT中劑量組,小鼠按100mg·kg-1劑量灌胃給予6.6g·L-1的SWNT懸液0.3mL;SWNT高劑量組,小鼠按150mg·kg-1劑量灌胃給予9.9g·L-1的SWNT懸液0.3mL。2.3特國內(nèi)二鉀抗凝各組連續(xù)灌胃給藥10d,每天一次。末次給藥后6h,小鼠稱重并行眼球取血,用肝素及10%EDTA二鉀抗凝,備用。經(jīng)肝素抗凝的血樣離心取上清,用日本日立7020全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT),天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌酶(CK)。2.4血液檢測經(jīng)10%EDTA二鉀抗凝的血液樣品,用美國JT-IR型庫而特牌血細胞自動分析儀檢測血常規(guī)。2.5組織固定方法末次給藥后6h,取小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、肌肉、淋巴結(jié)等組織,于10%甲醛及3%戊二醛溶液固定。分別在光鏡及電鏡下觀察SWNT對各臟器的損傷情況。2.6骨髓切開術(shù)取胸骨于Helly液中固定,24h后移入10%的甲醛溶液中繼續(xù)固定。光鏡下檢查SWNT對骨髓細胞的抑制情況。2.7統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以x±s表示,用SPSS軟件進行獨立樣本的t檢驗。3結(jié)果3.1小鼠的異常反應(yīng)50%乙醇組小鼠,給藥數(shù)分鐘后,步態(tài)不穩(wěn),安靜,呈似醉的樣子,其余4組小鼠給藥后,基本無異常反應(yīng)。小鼠進食飲水正常,毛色潤澤,活動正常。各組小鼠體重增長正常,結(jié)果見表1。3.2胃內(nèi)臟出血體積分數(shù)50%乙醇組小鼠,胃、腸鼓脹,可看到胃內(nèi)壁有大片出血,腸壁充血,其余內(nèi)臟未見異常。SWNT各組小鼠,胃及腸內(nèi)容物為黑色,其余內(nèi)臟未見異常。3.3swnt的臨床表現(xiàn)結(jié)果見圖1～4。對照組小鼠各臟器的HE染色組織切片均正常。50%乙醇組:觀察小鼠HE染色組織切片發(fā)現(xiàn),胃充血,出血,且胃上皮細胞有脫落現(xiàn)象(圖1A);脾出血;心肌水腫充血,回腸充血,呈嗜酸性變;肝臟輕度充血(圖2A);腎臟基本正常。SWNT對機體的有害效應(yīng)有明顯的劑量依賴性。SWNT低劑量組:僅發(fā)現(xiàn)肺泡間隔增寬(圖3B),其他組織基本正常(圖1B,圖2B)。SWNT高劑量組:NSWNT損害了除盲腸以外的所有胃腸道組織。其中,對胃的傷害最嚴重,表現(xiàn)為滲出,水腫,充血,出血;胃腺細胞嗜酸性變,并且在胃腺細胞中發(fā)現(xiàn)藍染的物質(zhì)(圖1C),機制不明。NSWNT對胃腸道的損傷按十二指腸,空腸,回腸,結(jié)腸的順序依次降低。另外,在透射電鏡下觀察空腸,回腸,結(jié)腸及淋巴組織發(fā)現(xiàn),組織內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)很多棒狀結(jié)構(gòu)(圖4A,B)。NSWNT對內(nèi)臟的損傷,其嚴重程度依次為肺,肝,腎,脾和淋巴結(jié)。肺組織結(jié)構(gòu)被嚴重破壞,肺組織間隙出血,肺泡消失(圖3A)。肝臟的損傷非常類似于酒精對肝臟的損傷。肝臟有顯著的充血,并且肝實質(zhì)細胞嗜酸性變(圖2C)。NSWNT對腎臟的損傷類似于對肝臟的損傷。腎臟實質(zhì)有顯著的充血和出血。心臟的病理變化不同于其他器官,也就是心肌纖維增生,輕度的顆粒變性;脾和淋巴結(jié)的損傷相對較輕,僅有輕微充血和小血管相對的增生。在所有被觀察的內(nèi)臟中,腦組織是唯一沒有被NSWNT破壞的器官。3.4血液生化指標(biāo)SWNT組AST,ALT,LDH,CK指標(biāo)升高。乙醇組ALT和TP升高。血液生化指標(biāo)檢查結(jié)果見表2。3.5血液檢測SWNT組低、中、高各劑量組紅細胞,血小板,白細胞及血紅蛋白等均正常。血常規(guī)檢查結(jié)果見表3。3.6骨髓切開術(shù)SWNT組低、中、高各劑量組骨髓未見異常。紅系、粒系、巨噬細胞系均無異常。4swnt的結(jié)構(gòu)表征納米粒子進入體內(nèi)的方式各種各樣,其中胃腸道是最可能的途徑之一。例如那些經(jīng)常接觸納米粒子的人員,如不采用適宜的防護措施,納米粒子進入消化道也是不可避免的。即使在嚴密防護的情況下,也很難保證完全避免納米粒子進入胃腸道。因此,本實驗對SWNT是否可通過胃腸道進入體內(nèi)進行研究。物質(zhì)粒子越小,越容易被胃腸道吸收。SWNT直徑不到1nm,因此可能很容易通過消化道黏膜屏障而被直接吸收,如同吸收那些可被直接吸收的物質(zhì)一樣,直接進入血液系統(tǒng),從而到達體內(nèi)各臟器。本實驗的結(jié)果尤其是從組織切片中觀察到肺,肝,腎,脾均受到不同程度的損害這一點。推測,SWNT可以通過胃腸道進入生物體。從本實驗結(jié)果可以看到,給予SWNT灌胃小鼠的血漿ALT和AST值都有明顯的升高,并且與SWNT有劑量依賴關(guān)系。這提示肝細胞受到了SWNT的損害。SWNT經(jīng)胃腸道進入體內(nèi)。首先,由肝門靜脈進入肝臟,在肝臟中進行處理,因此SWNT入血后,首先可能被肝臟捕獲,因而肝臟也是最先受損傷的器官。肝內(nèi)富含轉(zhuǎn)氨酶,約為血清中含量的100倍,如果釋放的酶保持活性,只要1%的肝細胞壞死便足以使血清中的酶活性增加1倍;又由于肝細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶濃度比血清中高1000～5000倍,在肝細胞膜滲透性增大時,即使無壞死,細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶也由于巨大的濃度梯度而進入血中。因此,轉(zhuǎn)氨酶的升高提示肝細胞膜的通透性增高,這有可能是由于SWNT的表面化學(xué)性質(zhì)所導(dǎo)致,也可能是由于SWNT的物理性質(zhì)所造成。SWNT中劑量組和SWNT高劑量組血中的LDH值顯著性增高,表明這兩個組的小鼠體內(nèi)的細胞受到損害。LDH是一種糖酵解酶,存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi),其中以腎臟含量較高,血清中LDH的正常范圍為100～300U·L-1,當(dāng)細胞受到損害時,血清中的LDH就會明顯增高。這與文獻報道的SWNT可以破壞細胞膜的完整性,導(dǎo)致細胞破裂,死亡相一致。實驗小鼠的血常規(guī)和骨髓切片檢查均正常。推測,SWNT可能不會侵蝕小鼠的造血系統(tǒng),這與文獻報道的SWNT對各臟器產(chǎn)生的有害效應(yīng)有器官差異性,如肺臟和肝臟較嚴重,而對骨髓細胞、血細胞及腦組織的有害效應(yīng)不明顯或沒有有害效應(yīng)相一致。在光鏡下觀察腦的組織切片,腦組織基本正常,沒有發(fā)現(xiàn)腦組織受到損害,推測,SWNT可能不能通過血腦屏障,這與關(guān)于SWNT能通過血腦屏障,進入腦組織的文獻結(jié)果不同,其原因可能在于SWNT是否經(jīng)過羥基修飾有關(guān)。心肌的組織切片,有輕度的顆粒樣變性,形成機制不詳,有待進一步研究。羥基化的SWNT經(jīng)胃腸道給藥后,羥基化的SWNT可以在體內(nèi)的很多組織中廣泛分布,包括心臟,肝臟,肺,腎臟,胃,骨,皮膚,腦等。在筆者的實驗中,采用灌胃的給藥方法,SWNT在胃內(nèi)的酸性環(huán)境和腸道的堿性環(huán)境中是否會被修飾,尚有待于進一步研究。目前來看,難溶的SWNT有可能進行了化學(xué)修飾,然后進入血液,遍布全身;也有可能不被修飾而以其原型直接進入血液。本實驗結(jié)果顯示,SWNT可以造成多臟器輕重不一的損害,而不能進入腦組織,提示SWNT有可能是以未修飾的形式進入生物體的。但這些結(jié)果尚不是結(jié)論性的,在目前