糖尿病視網(wǎng)膜mller細(xì)胞的病理改變

糖尿病視網(wǎng)膜mller細(xì)胞的病理改變

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（iii）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥。人們普遍認(rèn)為，針灸主要是視網(wǎng)膜。微血管病變,但目前許多臨床及實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn):在DR微血管病變發(fā)生以前,神經(jīng)視網(wǎng)膜已有病理改變。本實(shí)驗(yàn)通過觀察3個(gè)月糖尿病鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,GFAP、VEGF表達(dá)的改變,以及AGEs對(duì)體外純化培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活性的影響,旨在研究糖尿病視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的病理改變及其機(jī)制,初步探討Müller細(xì)胞損傷在DR中的作用,從而更好地了解DR的發(fā)病機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性成年SD大鼠20只(復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物部),體重(200±20)g,隨機(jī)分為正常對(duì)照組6只,糖尿病組14只。1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和培養(yǎng)基抗兔IgG-FITC二抗、抗鼠IgG-Cy3二抗(華美生物工程公司),鏈脲菌素(STZ)、小鼠抗大鼠GFAPIgG抗體、兔抗大鼠VEGFIgG抗體(Sigma公司),DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司),JEB-1200EX透射電鏡。1.3糖尿病大鼠成模試驗(yàn)糖尿病組14只雄性大鼠腹腔注射STZ(65mg/kg,0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液,pH4.0),對(duì)照組注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液,72h后,血糖大于17mmol/L為糖尿病鼠,有10只大鼠成模,其中1只糖尿病鼠在飼養(yǎng)期間死亡。3個(gè)月后麻醉下處死,摘除眼球,3只糖尿病鼠及1只正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織作電鏡觀察,其余6只糖尿病鼠及5只對(duì)照組,左眼球作冰凍切片(10μm)。1.4蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度檢測AGE-BSA的制備將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的無球蛋白的牛血清白蛋白與0.5mol/LD-葡萄糖和1.0mol/L苯甲基磺酰氟共同溶解于0.2mol/L磷酸緩沖液中,過濾除菌后置37℃孵箱內(nèi)孵化90d。然后在4℃PBS溶液中透析72h,測定葡萄糖濃度為零,考馬斯亮藍(lán)方法定量蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,熒光分光光度計(jì)鑒定AGE-BSA。AGE-BSA對(duì)照物的制備:除不加葡萄糖外,其他材料及方法同上。1.5gfapg抗體檢測糖尿病鼠眼球冰凍切片用VEGFIgG抗體、GFAPIgG抗體雙標(biāo)染色,二抗用抗兔IgG-FITC及抗鼠IgG-Cy3,染色程序同常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。激光共聚焦顯微鏡下觀察照相。1.6視網(wǎng)膜組織電鏡觀察取視網(wǎng)膜組織,2.5%戊二醛、1%鋨酸固定,JEB-1200EX透射電鏡觀察照相。1.7視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞的制備出生5～7dSD乳鼠無菌條件下斷頭處死,鈍性分離視網(wǎng)膜,0.125%胰蛋白酶37℃條件下消化20min,含血清的培養(yǎng)液終止消化,1000r/min離心5min,除去上清液,加入培養(yǎng)液(80%DMEM,20%胎牛血清)吹打使之成為細(xì)胞懸液,調(diào)整培養(yǎng)液量使細(xì)胞密度為3×105/mL,接種于包被鼠尾膠的40mL培養(yǎng)瓶,于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后反復(fù)吹打除去漂浮的視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞融合后傳代,選取2～4代細(xì)胞進(jìn)行鑒定和實(shí)驗(yàn)。1.8視網(wǎng)膜中的最小細(xì)胞免疫組織化學(xué)預(yù)先在24孔培養(yǎng)板中置入蓋玻片,細(xì)胞貼壁融合后PBS沖洗,4%多聚甲醛固定,用ABC法進(jìn)行GFAP免疫組織化學(xué)鑒定。1.9最大od值的測定細(xì)胞以4×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各4孔,2h后分別在實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組加入AGEs及其對(duì)照物2500μg/mL,培養(yǎng)20h后加入MTT(1.5mg/mL,PBS配制)20μL/孔,4h后在ELISA儀上測OD值。組間差異的顯著性用t檢驗(yàn)完成。2結(jié)果2.1女性評(píng)估AGE-BSA溶液作掃描檢測,激發(fā)光波長峰值為370nm,發(fā)射光波長峰值為440nm,以此波長,AGE-BSA產(chǎn)生最強(qiáng)熒光。2.2vegf陽性染色正常大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜下、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層見GFAP陽性染色,但整個(gè)視網(wǎng)膜未見VEGF陽性染色(圖1)。糖尿病鼠除視網(wǎng)膜內(nèi)界膜下、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有GFAP陽性染色外,其余各層也可見絲條狀貫穿于內(nèi)外界膜之間的GFAP陽性染色,并且在上述部位有GFAP和VEGF的共表達(dá)(圖2～4)。2.3視網(wǎng)膜組織電鏡觀察與對(duì)照組相比,3個(gè)月糖尿病鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞有明顯的病理改變(圖5,6)。2.4視網(wǎng)膜成像中的細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞90%表達(dá)GFAP(圖7)。第2代純化培養(yǎng)的視網(wǎng)膜müller細(xì)胞呈融合狀態(tài)(圖8)。2.5體外細(xì)胞活性檢測對(duì)照組的OD值為0.225±0.009,實(shí)驗(yàn)組的OD值為0.262±0.007,細(xì)胞活性增加,與對(duì)照組相比,差異有顯著性意義(P<0.01),并且Müller細(xì)胞在活性增加的同時(shí),其突起大部分消失。3dr微血管病變與視網(wǎng)膜屏障結(jié)構(gòu)相關(guān)關(guān)系探討DR是糖尿病引起的嚴(yán)重并發(fā)癥,以往人們研究最多也最為深入的是其微血管病變,但目前越來越多的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明:神經(jīng)視網(wǎng)膜在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞參與許多疾病的病理生理過程,如中風(fēng)、Alzheimer病等。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜主要膠質(zhì)細(xì)胞,其突起除包繞神經(jīng)元及軸突外,還附著在血管外作為支架構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障的一部分,具有維持血-視網(wǎng)膜屏障以及神經(jīng)元正常生理功能的作用。在DR發(fā)生發(fā)展中,作為視網(wǎng)膜主要膠質(zhì)細(xì)胞的Müller細(xì)胞表現(xiàn)如何?它和微血管病變之間又有哪些關(guān)系?目前這方面的研究受到越來越多的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)對(duì)3個(gè)月糖尿病鼠視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)Müller細(xì)胞的突起大部分消失,但微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞卻未見明顯的病理改變。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)3個(gè)月糖尿病鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞有GFAP表達(dá),而正常鼠體內(nèi)視網(wǎng)膜中僅有分布于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及神經(jīng)纖維層的星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP,而Müller細(xì)胞并不表達(dá)。盡管體內(nèi)Müller細(xì)胞表達(dá)GFAP的作用機(jī)制尚不清楚,但其意義在于:它被公認(rèn)為視網(wǎng)膜受損后,Müller細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)性膠質(zhì)化增生的重要標(biāo)志,如機(jī)械性損傷、視網(wǎng)膜脫離、青光眼等,Müller細(xì)胞在產(chǎn)生反應(yīng)性膠質(zhì)化增生的同時(shí),均有GFAP表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明:在DR微血管病變前,Müller細(xì)胞可能已有反應(yīng)性膠質(zhì)化增生以及突起消失等病理改變。血-視網(wǎng)膜屏障破壞也是糖尿病早期的一個(gè)重要特征,Qaum等研究發(fā)現(xiàn):糖尿病早期血-視網(wǎng)膜屏障破壞呈VEGF依賴性,其機(jī)制可能是通過打開內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接和增加細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸完成,因微血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞未見明顯的病理改變。3個(gè)月糖尿病鼠視網(wǎng)膜有GFAP及VEGF的共表達(dá),說明在糖尿病早期,不僅已有Müller細(xì)胞反應(yīng)性增生等病理改變,而且反應(yīng)性增生的Müller細(xì)胞還可分泌VEGF,進(jìn)而促進(jìn)DR微血管病變的發(fā)生發(fā)展,但是Müller細(xì)胞在糖尿病血-視網(wǎng)膜屏障破壞中的確切機(jī)制,如是否影響內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)等,有待進(jìn)一步研究。為探索其發(fā)病機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)在體外純化培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞,觀察AGEs對(duì)其活性的影響。AGEs是由還原糖(如葡萄糖、果糖)和蛋白質(zhì)的氨基末端經(jīng)非酶促反應(yīng)形成的終末產(chǎn)物之一,近年來研究認(rèn)為:體內(nèi)AGEs的形成和沉積是DR微血管病變的重要發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)在研究AGEs對(duì)體外純化培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活性的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)AGEs可引起Müller細(xì)胞的活性明顯增加,并且Müller細(xì)胞在活性增加的同時(shí),其突起大部分消失,這就可解釋上述糖尿病體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所觀察的現(xiàn)象,由于細(xì)胞活性能反映其增殖狀態(tài),所以糖尿病鼠體內(nèi)Müller細(xì)胞突起消失這一現(xiàn)象可能是其反應(yīng)性增生的結(jié)果。由此推測:(1)反應(yīng)性膠質(zhì)化增生可能是糖尿病早期Müller細(xì)胞的主要病理改變,導(dǎo)致其作為視網(wǎng)膜支架結(jié)構(gòu)的破壞。(2)AGEs可能是DR中視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞反應(yīng)性膠質(zhì)化增生的重要致病因素,但AGEs能否促進(jìn)Müller細(xì)胞表達(dá)GFAP及VEGF有待進(jìn)一步研究。正常情況下,Müller細(xì)胞在體內(nèi)不表達(dá)GFAP,但在體外培養(yǎng)Müller細(xì)胞時(shí),2周后絕大部分細(xì)胞表達(dá)GFAP,本實(shí)驗(yàn)用GFAPIgG抗體鑒定體外培養(yǎng)的鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞,陽性率為90%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明反應(yīng)性膠質(zhì)化增