第四章 基因工程的操作過程

第四章基因工程的操作過程基因工程5

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基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本條件基因工程的操作過程目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動(dòng)物基因工程高等植物基因工程4基因工程的操作過程C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）ADNA的體外重組（切、接）4基因工程的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢ADNA的體外重組（切與接）4基因工程的操作過程同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接不同粘性末端的連接粘性末端的更換人工粘性末端的連接重組率同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT不同粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC人工粘性末端的連接5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火B(yǎng)amHIBamHIEcoRIBamHI人工粘性末端的連接3‘突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI人工粘性末端的連接平頭末端C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加熱GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT粘性末端的更換BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow補(bǔ)平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRIGGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker重組率重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡(jiǎn)化DNA重組的后續(xù)操作。重組率提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO堿性磷酸單酯酶堿性磷酸單酯酶重組率提高重組率的方法加裝同聚尾末端：

CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowB重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）4基因工程的操作過程轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體

用10ml冰冷的10mM

CaCl2溶液懸浮菌體，離心用1ml冰冷的75mM

CaCl2溶液懸浮菌體冰浴放置12-24小時(shí)，備用收集菌體轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100ml感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng載體的重組冰浴放置半小時(shí)在42℃保溫2分鐘（熱脈沖）快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘DNA連接液，混勻加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時(shí)（擴(kuò)增）涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子

酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無(wú)水無(wú)去污劑細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化取0.2-1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個(gè)原生質(zhì)體），加入10-20mlDNA重組連接液，同時(shí)加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)l噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)：

將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)電穿孔轉(zhuǎn)化將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長(zhǎng)）轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個(gè)分子（6.02X1017/2686X660），也就是說，每3400個(gè)pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞另一方面，在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18DNA

轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/mg載體，

經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：

104/107

X10-2=0.1mg載體DNA

考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：

0.1/20%=0.5

mg載體DNA

載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5mg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素載體及DNA重組分子方面：

載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí)插入片段的大?。簩?duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素受體細(xì)胞方面：

受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素轉(zhuǎn)化方法方面：

受體細(xì)胞的預(yù)處理：影響最大供受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細(xì)胞50ngDNA

轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化106-107/mgDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109

個(gè)原生質(zhì)體 50ngDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-106/mgDNA

l-DNA轉(zhuǎn)染107-108/mgDNA

電穿孔轉(zhuǎn)化106-109/mgDNA

轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：

Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37℃培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程

l噬菌體轉(zhuǎn)染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）4基因工程的操作過程載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)克隆DNA序列檢測(cè)外源基因產(chǎn)物檢測(cè)C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）4基因工程的操作過程由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子轉(zhuǎn)化子重組子目的重組子載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr抗藥性篩選法的基本原理：

pBR3224363bpori抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法抗藥性篩選法的基本操作：

先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上

在Ap平板上生長(zhǎng)、但在Ap和Tc平板上不長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子即為

ApAp+Tc影印挑選重組子

載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：

營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營(yíng)養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子

載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法常見的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記：

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在兩條dTTP的合成途徑：用于大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型dCDPdTDPdTTPTRdTMPdTDPdTTPAPTKAP氨基喋呤TK胸腺嘧啶核苷激酶載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：

顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法顯色篩選法的基本操作：

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重組子（Apr+lacZ-）

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍(lán)色菌落克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高?？寺NA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分重組子與非重組子用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA電泳觀察酶解產(chǎn)物片段重組子：2.7kb+4.0kb非重組子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然后通過其長(zhǎng)度來(lái)鑒定其是否為重組子克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriSSBP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分重組子與非重組子如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位點(diǎn)處，原則上也可用SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟(jì)，因?yàn)镾phI非常昂貴（每100單位50美元）。用HindIII和EcoRI聯(lián)合酶解