第11章-生物催化

第11章-生物催化第一頁，共175頁。第11章

生物催化第一頁第二頁，共175頁。本章內(nèi)容生物催化的定義生物催化的基本性質(zhì)生物催化的篩選以及改造人工酶1234生物催化的應(yīng)用5第二頁第三頁，共175頁。概述生物催化世界各大生物技術(shù)公司競相追逐的和研發(fā)的熱點(diǎn)，高效、專一、條件溫和、環(huán)境友好，實(shí)現(xiàn)綠色化學(xué)。第三頁第四頁，共175頁。國家中長期科技發(fā)展規(guī)劃和863計(jì)劃均增列了生物催化和生物轉(zhuǎn)化專題;中石化、中石油、中糧集團(tuán)等國有大企業(yè)集團(tuán)受到吸引，紛紛投資開發(fā)生物能源、生物材料與生物質(zhì)化學(xué)品的工業(yè)技術(shù)。第四頁第五頁，共175頁。酶的發(fā)現(xiàn)

1773年，意大利科學(xué)家斯帕蘭扎尼設(shè)計(jì)了一個(gè)巧妙的實(shí)驗(yàn)：將肉塊放入小巧的金屬籠中，然后讓鷹吞下去。過一段時(shí)間他將小籠取出，發(fā)現(xiàn)肉塊消失了。于是，他推斷胃液中一定含有消化肉塊的物質(zhì)。第五頁第六頁，共175頁。第六頁第七頁，共175頁。酶在生產(chǎn)和生活中應(yīng)用釀酒工業(yè)中使用的酵母菌，就是通過有關(guān)的微生物產(chǎn)生的，酶的作用將淀粉等通過水解、氧化等過程，最后轉(zhuǎn)化為酒精；淀粉葡萄糖酒精

第七頁第八頁，共175頁。第八頁第九頁，共175頁。Enzymesareusedinboththealcoholandstarch-processingindustriestohydrolyze(breakdown)largestarchmoleculesintosimplesugars.Thydrolysisofstarchtosimplesugarsisaccomplishedbyusingatwo-step,enzyme-catalyzedprocesscalled

liquefactionandsaccharification.

第九頁第十頁，共175頁。洗衣粉中加入酶，可以使洗衣粉效率提高，使原來不易除去的汗?jié)n等很容易除去洗衣業(yè)常用的酶有四種:脂肪酶/蛋白酶/淀粉酶和纖維素酶.第十頁第十一頁，共175頁。11.2

生物催化的定義

利用酶或者細(xì)胞等具有生物活性的物質(zhì)催化化學(xué)反應(yīng)的技術(shù)學(xué)科，這種反應(yīng)過程又稱為生物轉(zhuǎn)化。

常用的有機(jī)體主要是微生物，其本質(zhì)是利用微生物細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行催化。

第十一頁第十二頁，共175頁。生物催化生物學(xué)工程學(xué)化學(xué)有機(jī)化學(xué)生物化學(xué)生物無機(jī)化學(xué)分子生物學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)化工催化反應(yīng)工程第十二頁第十三頁，共175頁。11.3酶催化的基本性質(zhì)11.3.1

酶催化動(dòng)力學(xué)原理酶在催化過程中通過變化構(gòu)象，降低反應(yīng)的能壘，催化反應(yīng)進(jìn)行。第十三頁第十四頁，共175頁。酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型E+SESE+PE游離酶濃度S底物濃度

P產(chǎn)物k2k1k-1第十四頁第十五頁，共175頁。米氏方程通過Km和Vmax調(diào)整生物催化工藝第十五頁第十六頁，共175頁。11.3.2催化機(jī)理鎖鑰學(xué)說（Fisher，1894）：酶的活性中心結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)須非常吻合，如同鎖和鑰匙一樣,緊密結(jié)合成中間絡(luò)合物。第十六頁第十七頁，共175頁。底物S酶E酶-底物復(fù)合物ES鎖鑰學(xué)說第十七頁第十八頁，共175頁。第十八頁第十九頁，共175頁。EnzymeCatalysts第十九頁第二十頁，共175頁。誘導(dǎo)契合學(xué)說（Koshland，1958）：

酶活性中心的結(jié)構(gòu)有一定的柔性,當(dāng)?shù)孜锱c酶分子結(jié)合時(shí),誘導(dǎo)酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生有利于與底物結(jié)合的變化,使反應(yīng)所需的催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)正確地排列和定向,轉(zhuǎn)入有效的作用位置,這樣才能使酶與底物完全吻合,結(jié)合成中間產(chǎn)物。第二十頁第二十一頁，共175頁。SEE-S復(fù)合物abcabcES誘導(dǎo)契合學(xué)說第二十一頁第二十二頁，共175頁。11.3.3酶催化的性能指標(biāo)選擇性酶活性穩(wěn)定性區(qū)域選擇性化學(xué)選擇性立體選擇性第二十二頁第二十三頁，共175頁。影響酶促反應(yīng)速度的因素－－酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素的科學(xué)。

酶濃度[E]底物濃度[S]反應(yīng)溫度pH值激活劑抑制劑第二十三頁第二十四頁，共175頁。(1)酶濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響

在底物足夠過量而其它條件固定的情況下，并且反應(yīng)系統(tǒng)中不含有抑制酶活性的物質(zhì)及其他不利于酶發(fā)揮作用的因素時(shí)，酶促反應(yīng)的速度和酶濃度成正比。第二十四頁第二十五頁，共175頁。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速率與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)[S]VVmax(2)底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響第二十五頁第二十六頁，共175頁。隨著底物濃度的增高反應(yīng)速率不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級(jí)反應(yīng)[S]VVmax第二十六頁第二十七頁，共175頁。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速率不再增加，達(dá)最大速率；反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)[S]VVmax第二十七頁第二十八頁，共175頁。（3）pH對(duì)酶作用的影響2.最適pH

1.pH穩(wěn)定性－－酶表現(xiàn)最大活力的pH值。在一定的pH范圍內(nèi)酶是穩(wěn)定的。第二十八頁第二十九頁，共175頁。一些酶的最適pH值

酶最適pH胃蛋白酶1.8過氧化氫酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8酶的最適pH只在一定條件下才有意義

酶的最適pH不是固定的常數(shù),其數(shù)值受酶的純度、底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度等影響第二十九頁第三十頁，共175頁。pH影響酶活力的原因：

1.環(huán)境過酸、過堿可使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶變性失活；

2.pH改變能影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離，從而影響與底物的結(jié)合或催化；

3.pH影響底物有關(guān)基團(tuán)的解離。第三十頁第三十一頁，共175頁。（4）溫度對(duì)酶作用的影響兩種不同影響：

1.溫度升高，反應(yīng)速度加快；

2.溫度升高，熱變性速度加快。Tv最適溫度第三十一頁第三十二頁，共175頁。

酶的最適溫度:在一定條件下，酶表現(xiàn)最大活力時(shí)的溫度。

酶的最適溫度不是一個(gè)固定的常數(shù)，其數(shù)值受底物種類、作用時(shí)間等因素影響而改變。第三十二頁第三十三頁，共175頁。（5）激活劑對(duì)酶作用的影響激活劑：能提高酶活力的物質(zhì)。如Cl-是唾液淀粉酶的激活劑。激活劑無機(jī)離子大多為金屬離子:如K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+等少數(shù)為陰離子:如Cl-,Br-,I-,CN-,PO43-等小分子有機(jī)物：如Vc,Cys,GSH,膽汁酸鹽等生物大分子：如蛋白激酶，激活酶原的蛋白酶等第三十三頁第三十四頁，共175頁。（6）抑制劑對(duì)酶作用的影響

抑制劑：使酶的必需基團(tuán)或活性部位中的基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶喪失活性的物質(zhì)。

由抑制劑所引起的酶活力降低或喪失稱為抑制作用（inhibition）。凡可使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用稱為失活作用（inactivation）。第三十四頁第三十五頁，共175頁。11.3.4酶活力的測定與酶的制備一、酶活力的測定酶的活力：酶加速其所催化的化學(xué)反應(yīng)速度的能力。

酶促反應(yīng)速度越大，酶的活力就越強(qiáng)；反之，反應(yīng)速度越小，酶的活力就越弱第三十五頁第三十六頁，共175頁。酶反應(yīng)速度的測量(1)測量單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量。(2)測量單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。產(chǎn)物生成量時(shí)間第三十六頁第三十七頁，共175頁。測定酶活力時(shí)必須要注意：

（1）測定的反應(yīng)速度必須是反應(yīng)初速度。否則，不可能得到準(zhǔn)確結(jié)果；（2）酶反應(yīng)速度受環(huán)境條件的影響。在測定酶活力時(shí)，要維持在一套固定條件下進(jìn)行

第三十七頁第三十八頁，共175頁。２.酶活力單位—表示酶量多少的單位

在一定條件下（溫度保持在30℃，其他條件如pH和底物濃度等，均應(yīng)采用最適條件）

一分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量稱為一個(gè)酶單位（U）。

第三十八頁第三十九頁，共175頁。３、酶的比活力比活力（比活性）每mg蛋白質(zhì)中所含的活力單位數(shù)。酶的比活力即表示酶的含量（純度），是表示酶制劑純度的一個(gè)指標(biāo)。如在酶的提純過程中，隨著酶逐步被純化，其比活力也在逐步增加。第三十九頁第四十頁，共175頁。二、酶的制備不同使用目的，要求酶制劑的純度高低不同，如科學(xué)研究常需要高度純化甚至制成結(jié)晶。

酶絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)，故一般常用的酶的分離純化方法，也就是常用來分離純化蛋白質(zhì)的方法。

特別需要注意：酶具有催化活性，在整個(gè)提純過程中，要防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌等，以避免酶活力的損失。第四十頁第四十一頁，共175頁。酶的分離純化步驟1.選材：選用酶含量高的材料工業(yè)上大多采用微生物發(fā)酵的方法來獲得大量酶制劑。優(yōu)點(diǎn)：不受氣候、地理?xiàng)l件的限制，動(dòng)、植物體內(nèi)的酶大多可從微生物體內(nèi)找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量也豐富。還可以通過選育菌種來提高酶的產(chǎn)量和用廉價(jià)原料大量生產(chǎn)。第四十一頁第四十二頁，共175頁。生物體所產(chǎn)生的酶有胞內(nèi)酶和胞外酶之分，所以在處理方法上有所不同。如果是胞內(nèi)酶則需要先用搗碎、砂磨、凍融或自溶等方法將細(xì)胞破壞，然后再用適當(dāng)?shù)柠}溶液或緩沖液把酶提取出來——抽提如果是胞外酶，則無需破壞細(xì)胞的手續(xù)，而直接用體液如唾液、胃液、乳汁或微生物的發(fā)酵液進(jìn)行純化2.破碎細(xì)胞：機(jī)械破壁，化學(xué)破壁，酶破壁，凍融破壁等第四十二頁第四十三頁，共175頁。3.抽提:用適當(dāng)?shù)柠}溶液或緩沖液把酶提取出來4.分離及純化一些常用的分離純化酶的方法：（1）鹽析法最常用的鹽是硫酸銨、氯化鈉和硫酸鈉等（2）有機(jī)溶劑沉淀法

乙醇、丙酮等能與水互溶的有機(jī)溶劑，在不同的濃度下能沉淀不同的蛋白質(zhì)，因此可用來純化酶。此法分辨能力高，提純效果好。但高濃度的有機(jī)溶劑常引起酶活力的喪失,同時(shí)整個(gè)操作過程都應(yīng)該嚴(yán)格控制在低溫進(jìn)行第四十三頁第四十四頁，共175頁。判斷分離提純方法的好壞，一般用兩個(gè)指標(biāo)來衡量:

一是總活力的回收——得率（回收率）二是比活力提高的倍數(shù)總活力的回收是表示提純過程中酶的損失情況；比活力提高的倍數(shù)則表示提純方法的有效程度。5.保存：低溫干燥保存第四十四頁第四十五頁，共175頁。

11.3.5酶的應(yīng)用工業(yè)上酶應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)：酶的催化效率高，專一性強(qiáng)，不發(fā)生副反應(yīng)。酶作用條件溫和。酶及其反應(yīng)產(chǎn)物大多無毒性。第四十五頁第四十六頁，共175頁。固定化酶

把水溶性酶經(jīng)物理（吸附法與包埋法）或化學(xué)方法（共價(jià)偶聯(lián)法與交聯(lián)法）處理后，使酶與惰性載體結(jié)合或?qū)⒚赴衿饋沓蔀橐环N不溶于水的狀態(tài)。第四十六頁第四十七頁，共175頁。（一）為什么要固定化酶（二）酶固定化的優(yōu)缺點(diǎn)（三）酶的固定化方法

第四十七頁第四十八頁，共175頁。（一）為什么要固定化酶傳統(tǒng)酶缺點(diǎn)傳統(tǒng)酶催化反應(yīng)幾乎都在水溶液中進(jìn)行，只能一次性使用，難以回收酶與產(chǎn)物混合，增加產(chǎn)物分離和純化難度溶液中酶的穩(wěn)定性差，容易變形和失活。

而將酶固定化能夠克服這些缺點(diǎn)相對(duì)于酶直接加入至溶液中，通常將固定化酶的制備過程稱為酶的固定化。該項(xiàng)技術(shù)于20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的，1971年第一屆國際酶工程會(huì)議正式建議采用固定化酶的名稱。第四十八頁第四十九頁，共175頁。（二）酶固定化的優(yōu)缺點(diǎn)1、酶固定化的優(yōu)點(diǎn)：

可以重復(fù)使用，在大多數(shù)情況下，穩(wěn)定性明顯提高催化后，酶與底物容易分開，產(chǎn)物易于分離純化，質(zhì)量提高反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制酶的利用效率高了，單位酶量催化的底物濃度增加，而酶量減少更適合于多酶催化反應(yīng)第四十九頁第五十頁，共175頁。2、固定化酶的缺點(diǎn)存在著酶失活現(xiàn)象，尤其是共價(jià)法固定消耗固定化材料，增加成本酶被固定到載體后將增加底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力

考慮固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)，在工業(yè)采用固定化還是液態(tài)。第五十頁第五十一頁，共175頁。吸附法：使酶被吸附于惰性固體的表面，或吸附于離子交換劑上。包埋法：使酶包埋在凝膠的格子中或聚合物半透膜小膠囊中。偶聯(lián)法：使酶通過共價(jià)鍵連接于適當(dāng)?shù)牟蝗苡谒妮d體上。交聯(lián)法：使酶分子依靠雙功能基團(tuán)試劑交聯(lián)聚合成“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)。（三）酶的固定化方法第五十一頁第五十二頁，共175頁。

(四)固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

大多數(shù)酶在固定化以后，有較高的穩(wěn)定性和較長的有效壽命。其原因是：固定化增加了酶結(jié)構(gòu)的牢固性程度；阻擋了不利因素對(duì)酶的侵襲；限制了酶分子的相互作用。第五十二頁第五十三頁，共175頁。1、增加熱穩(wěn)定性2、增強(qiáng)對(duì)變劑性、抑制劑的抵抗能力3、固定化減輕蛋白酶的破壞作用4、半衰期延長

固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響第五十三頁第五十四頁，共175頁。酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用---

(1)酶與疾病的發(fā)生

酶缺乏或異常引起的疾病酶疾病苯丙氨酸羥化酶苯丙酮酸尿癥6-磷酸葡萄糖脫氫酶蠶豆病酪氨酸酶白化病細(xì)胞色素氧化酶氰化物中毒膽堿酯酶有機(jī)磷中毒第五十四頁第五十五頁，共175頁。（2）酶與疾病的診斷——血清酶活性測定

酶主要臨床應(yīng)用谷丙轉(zhuǎn)氨酶肝實(shí)質(zhì)疾患谷草轉(zhuǎn)氨酶心肌梗塞、肝實(shí)質(zhì)疾患乳酸脫氫酶心肌疾患、肝實(shí)質(zhì)疾患?jí)A性磷酸酶骨病、肝膽疾患胰蛋白酶(原)胰腺疾病肌酸激酶心肌梗塞、肌肉疾患醛縮酶肌肉疾病第五十五頁第五十六頁，共175頁。（3）酶與疾病的治療

替代治療：消化不良--胃酶、胰酶抗菌治療：清創(chuàng)--糜蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)癥治療：預(yù)防血栓形成--尿激酶、鏈激酶抗癌治療：氨甲喋呤—還原酶

第五十六頁第五十七頁，共175頁。11.4生物催化劑的篩選以及改造生物催化劑的來源一、從微生物體系內(nèi)篩選并提取生產(chǎn)，是目前使用最廣泛的獲得手段；二、通過DNA重組技術(shù)或蛋白質(zhì)工程方法獲得。第五十七頁第五十八頁，共175頁。11.4.1生物催化劑的篩選空氣、土壤、水強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、高壓微生物生存的環(huán)境多樣第五十八頁第五十九頁，共175頁。產(chǎn)酶微生物的發(fā)現(xiàn)篩選分離第五十九頁第六十頁，共175頁。微生物和酶的篩選辦法（1）從自然界發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶微生物第六十頁第六十一頁，共175頁。篩選步驟采集

富集

復(fù)篩分離

粗篩第六十一頁第六十二頁，共175頁。

選擇合適的培養(yǎng)基獲得人工環(huán)境下的優(yōu)勢菌株篩選第六十二頁第六十三頁，共175頁。分離菌株的篩選過程發(fā)酵平板篩選組合條件復(fù)篩第六十三頁第六十四頁，共175頁。（2）優(yōu)良菌株選育

自然選育誘變選育第六十四頁第六十五頁，共175頁。自然選育根據(jù)微生物自身的突變達(dá)到選育的過程，缺點(diǎn)是效率較為低下。第六十五頁第六十六頁，共175頁。誘變選育通過人為改變生長環(huán)境的方法促使微生物發(fā)生基因突變或染色體畸變，達(dá)到菌種選育。第六十六頁第六十七頁，共175頁。誘變生長條件篩選高產(chǎn)菌株抗性代謝溫度第六十七頁第六十八頁，共175頁。篩選方式營養(yǎng)缺陷型突變株篩選抗反饋?zhàn)瓒艉头答佉种仆蛔兙旰Y選組成型突變菌株篩選抗性突變菌株篩選第六十八頁第六十九頁，共175頁。營養(yǎng)缺陷型突變株篩選

指微生物不能在無機(jī)鹽類和碳源組成的合成培養(yǎng)基中增殖，必須補(bǔ)充一種或一種以上的營養(yǎng)物質(zhì)才能生長。

研究中重要的選擇標(biāo)記和育種的重要手段，在發(fā)酵工業(yè)上有廣泛用途。

第六十九頁第七十頁，共175頁。第七十頁第七十一頁，共175頁。影印法第七十一頁第七十二頁，共175頁。第七十二頁第七十三頁，共175頁。反饋抑制：一種負(fù)反饋機(jī)制，其中酶促反應(yīng)的末端產(chǎn)物可抑制在此產(chǎn)物合成過程中起作用的酶。第七十三頁第七十四頁，共175頁。

反饋?zhàn)瓒簦褐饕诤铣纱x途徑中，終產(chǎn)物或其衍生物對(duì)該途徑上一個(gè)或多個(gè)酶形成的抑制作用。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)慢。

第七十四頁第七十五頁，共175頁。組成型突變constitutivemutation與酶的合成有關(guān)的調(diào)節(jié)基因的一種突變。即原來酶的合成量受調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)酶或阻遏酶，由于調(diào)節(jié)基因發(fā)生變異，酶的合成變?yōu)榻M成型（不管生長條件如何，酶的合成量總是恒定的）的一種現(xiàn)象。第七十五頁第七十六頁，共175頁。

從基因組中推測基因編碼蛋白的功能，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；對(duì)于未培養(yǎng)的微生物，從環(huán)境中分離提取微生物的DNA樣本，酶切獲得大小為20-40kb的DNA片段，回收片段，構(gòu)建基因文庫。（3）微生物基因組DNA中篩選酶第七十六頁第七十七頁，共175頁。假單胞菌A1501推測基因編碼蛋白第七十七頁第七十八頁，共175頁。元基因組

生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，它包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因。目前主要指環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌的基因組總和。1212第七十八頁第七十九頁，共175頁。11.4.2蛋白質(zhì)工程方法傳統(tǒng)方法-------改造催化過程適應(yīng)催化劑現(xiàn)代方法-------對(duì)生物催化劑進(jìn)行改造第七十九頁第八十頁，共175頁。蛋白質(zhì)工程的概念

指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)通過對(duì)基因的人工定向改造等手段，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，改造和拼接以生產(chǎn)出能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。第八十頁第八十一頁，共175頁。

1983年，美國生物學(xué)家額爾默首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念。第八十一頁第八十二頁，共175頁。根據(jù)需要，合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系；從氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新蛋白質(zhì)。

（2）蛋白質(zhì)工程研究的主要內(nèi)容第八十二頁第八十三頁，共175頁。1、基因工程產(chǎn)物基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。這些天然蛋白質(zhì)是生物在長期進(jìn)化過程中形成的,它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要,卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。第八十三頁第八十四頁，共175頁。實(shí)例1：干擾素的保存天然的干擾素在體外保存相當(dāng)困難。如果將其分子上的一個(gè)半胱氨酸變成絲氨酸，那么在—70℃的條件下，可以保存半年。2、蛋白質(zhì)工程實(shí)例：第八十四頁第八十五頁，共175頁。實(shí)例2：生產(chǎn)單體速效胰島素

如果把胰島素B鏈由B28脯氨酸-B29賴氨酸改為B28賴氨酸-B29脯氨酸就可以避免胰島素分子形成聚合體以保證其效能的及時(shí)發(fā)揮。原因：胰島素注射到人體后會(huì)堆積在皮下，要經(jīng)過較長時(shí)間才能進(jìn)入血液，而且進(jìn)入到血液中的胰島素又會(huì)不斷地被分解。第八十五頁第八十六頁，共175頁。第八十六頁第八十七頁，共175頁。實(shí)例3:工業(yè)用酶許多工業(yè)用酶是在改變天然酶的特性后，才使之適應(yīng)生產(chǎn)和使用需要的。在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這是因?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)中每一步的反應(yīng)體系中常常會(huì)有酸、堿或有機(jī)溶劑存在，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大多數(shù)酶會(huì)很快變性失活。第八十七頁第八十八頁，共175頁。蛋白質(zhì)工程的基本途徑預(yù)期的蛋白質(zhì)功能設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測應(yīng)有的氨基酸序列找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）第八十八頁第八十九頁，共175頁。對(duì)蛋白質(zhì)的改造：改造蛋白質(zhì)大改：設(shè)計(jì)并制造出自然界不存在的蛋白質(zhì)中改：替換一個(gè)肽段或一個(gè)特定的結(jié)構(gòu)域小改：改造活性部位的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基第八十九頁第九十頁，共175頁。酶工程與蛋白質(zhì)工程有什么區(qū)別？

酶工程就是指將酶所具有的生物催化作用，借助工程學(xué)的手段，應(yīng)用于生產(chǎn)、生活、醫(yī)療診斷和環(huán)境保護(hù)等方面的一門科學(xué)技術(shù)。

第九十頁第九十一頁，共175頁。

酶制劑生產(chǎn)酶工程酶制劑應(yīng)用第九十一頁第九十二頁，共175頁。

通常所說的酶工程是用工程菌生產(chǎn)酶制劑，而沒有經(jīng)過由酶的功能來設(shè)計(jì)酶的分子結(jié)構(gòu)，然后由酶的分子結(jié)構(gòu)來確定相應(yīng)基因的堿基序列等步驟。酶工程的重點(diǎn)在于對(duì)已存酶的合理充分利用，而蛋白質(zhì)工程的重點(diǎn)則在于對(duì)已存在的蛋白質(zhì)分子的改造。第九十二頁第九十三頁，共175頁。（3）蛋白質(zhì)工程的方法

理性化設(shè)計(jì)定向進(jìn)化第九十三頁第九十四頁，共175頁。

包括活性設(shè)計(jì)、專一性設(shè)計(jì)、框架（構(gòu)象）設(shè)計(jì)等。

目前對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系認(rèn)識(shí)不系統(tǒng)，僅是對(duì)天然蛋白質(zhì)的修飾。如：異常血紅蛋白的氨基酸取代、去羧基端胰島素等。

1）蛋白質(zhì)理性化設(shè)計(jì)第九十四頁第九十五頁，共175頁。

最終目標(biāo)一個(gè)或多個(gè)核苷酸發(fā)生目標(biāo)性的轉(zhuǎn)變，培養(yǎng)獲得不同于野生型的蛋白質(zhì)

第九十五頁第九十六頁，共175頁。不同動(dòng)物胰島素在A鏈中的差異羧基端A鏈B鏈A鏈第九十六頁第九十七頁，共175頁。定點(diǎn)突變步驟蛋白質(zhì)純化確定氨基酸序列

重組表達(dá)蛋白結(jié)晶分析結(jié)構(gòu)，確定催化位點(diǎn)DNA突變，克隆表達(dá)檢驗(yàn)蛋白的理化性質(zhì)得到基因第九十七頁第九十八頁，共175頁。調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)基因結(jié)構(gòu)基因終止基因連接酶完整基因DNA第九十八頁第九十九頁，共175頁。

目前用此法已合成人血細(xì)胞干擾素、胰島素、生長激素釋放抑制激素等基因。

第九十九頁第一百頁，共175頁。2）蛋白質(zhì)定向進(jìn)化生物催化中定向進(jìn)化的步驟：DNA文庫中篩選含目標(biāo)蛋白親本的DNA序列，通過突變或重組方法產(chǎn)生蛋白序列DNA序列連接到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化細(xì)菌并表達(dá)；篩選性質(zhì)改進(jìn)的酶；將所得序列擴(kuò)增，重復(fù)誘變、篩選、擴(kuò)增的循環(huán)得到具有特定性蛋白質(zhì)第一百頁第一百零一頁，共175頁。11.5人工酶

人工酶是用人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白質(zhì)。

1977年Dhar人工合成的Glu—Phe—Ala—Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八肽，具有溶菌酶的活性。其活性為天然溶菌酶的50%.第一百零一頁第一百零二頁，共175頁。人工酶分類

催化抗體蛋白質(zhì)催化類似物酶模型第一百零二頁第一百零三頁，共175頁。11.5.1催化抗體（抗體酶）

一種新型人工酶制劑，具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，將抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。第一百零三頁第一百零四頁，共175頁。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋白，是一類重要的免疫效應(yīng)分子。

第一百零四頁第一百零五頁，共175頁。IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格抗原IgG第一百零五頁第一百零六頁，共175頁。（1）抗體酶的催化特征1、與天然酶相比抗體酶的特點(diǎn)能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)有更強(qiáng)的專一性和穩(wěn)定性2、抗體酶和非催化性抗體作用的比較更高的反應(yīng)特異性反應(yīng)的可逆性反應(yīng)過程第一百零六頁第一百零七頁，共175頁。（2）抗體酶的催化作用機(jī)理

抗體酶催化的三種重要反應(yīng)機(jī)制水解作用機(jī)制基團(tuán)轉(zhuǎn)移連續(xù)反應(yīng)機(jī)制

第一百零七頁第一百零八頁，共175頁。

1、抗體酶在幫助戒毒方面的應(yīng)用

Landry等用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。（3）抗體酶的應(yīng)用用人工抗體酶的被動(dòng)免疫阻斷可卡因上癮第一百零八頁第一百零九頁，共175頁。

抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù)將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián)，這樣酶就會(huì)通過和腫瘤結(jié)合的抗體而存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后，當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近，抗體酶就會(huì)將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物，從而提高腫瘤細(xì)胞局部藥物濃度，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷力。2.腫瘤治療第一百零九頁第一百一十頁，共175頁?？贵w介導(dǎo)前藥治療機(jī)理CellDeath第一百一十頁第一百一十一頁，共175頁。11.5.2類蛋白催化劑類蛋白催化劑核酶模擬酶第一百一十一頁第一百一十二頁，共175頁。酶容易受到多種物理、化學(xué)因素的影響而失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑。第一百一十二頁第一百一十三頁，共175頁。模擬酶（modelenzyme

）用合成高分子來模擬酶的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理以及酶在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過程。

模擬酶是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，是仿生高分子的一個(gè)重要的內(nèi)容第一百一十三頁第一百一十四頁，共175頁。11.5.3模型酶酶模型是包含一種或者多種酶體系特征的有機(jī)合成分子，比酶小，結(jié)構(gòu)更簡單，即酶模型試圖在更簡單的水平模擬酶的主要功能。第一百一十四頁第一百一十五頁，共175頁。德國科學(xué)家建立了“非典”病毒的蛋白酶模型，對(duì)此模型進(jìn)行的初步分析顯示，一種感冒藥物經(jīng)改進(jìn)后也許可用于治療“非典”。通過對(duì)導(dǎo)致普通感冒的人體冠狀病毒和豬冠狀病毒上的酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，建立起“非典”病原體的蛋白酶模型。蛋白酶在病毒的復(fù)制過程中起著重要作用。舉例第一百一十五頁第一百一十六頁，共175頁。11.6

生物催化的應(yīng)用

氧化酶還原酶脂肪酶糖苷酶水解酶已應(yīng)用的酶第一百一十六頁第一百一十七頁，共175頁。11.6.1酶作為大宗活性物質(zhì)的應(yīng)用衣用洗滌劑紡織品動(dòng)物飼料制漿造紙等工藝中的應(yīng)用第一百一十七頁第一百一十八頁，共175頁。（1）酶在衣用洗滌劑中的應(yīng)用

歐洲和日本、韓國，加酶粉已超過90%美國加酶洗滌劑超過80%中國30~40%第一百一十八頁第一百一十九頁，共175頁。蛋白質(zhì)類污漬有汗?jié)n、血漬及肉汁、牛奶等。蛋白酶添加到洗滌劑中，可去除血跡和蛋白污漬。淀粉類的污漬（面條）和油漬等形成的污斑較難去除，因?yàn)椴蝗艿牡鞍踪|(zhì)、油漬和淀粉使污垢強(qiáng)烈粘附于織物上，在洗滌劑中加入蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶則有助于去除蛋白質(zhì)、油脂和淀粉類污漬及其粘黏的其它污垢。

第一百一十九頁第一百二十頁，共175頁。（2）酶在紡織品中的應(yīng)用

纖維素酶有助于除去綿織品洗滌或穿著過程中形成的微纖維，顏色增艷增白，柔軟及幫助去除纖維內(nèi)部的固體顆粒污垢，起到一定程度的生物柔軟和生物拋光的作用。過氧化物酶漂白衣物，安全且環(huán)保。

第一百二十頁第一百二十一頁，共175頁。（3）酶在制漿造紙等工藝中的應(yīng)用制漿造紙包括2個(gè)制漿和3個(gè)漂白過程。漆酶一種含銅的多酚氧化酶，來源于白腐真菌，可降解木質(zhì)素。在紙漿生物漂白、生物制漿和預(yù)處理、廢紙脫墨、紙漿增濕和處理制漿廢水方面等。

第一百二十一頁第一百二十二頁，共175頁。白腐菌第一百二十二頁第一百二十三頁，共175頁。優(yōu)點(diǎn)白腐菌對(duì)原料的預(yù)處理，可降低后階段制漿能耗的50%，并且纖維強(qiáng)度性能也得到改進(jìn)。選定適宜溫度，可以分解出80%的木質(zhì)素，比一般化學(xué)制漿法成本降低了50%。木材的消耗量可節(jié)約1/9。能使漂白廢水中的很多有毒物質(zhì)最終降解成二氧化碳和水。第一百二十三頁第一百二十四頁，共175頁。(4)動(dòng)物飼料中植酸酶的應(yīng)用

植酸酶目前已成為飼料工業(yè)酶制劑中的第一大酶種，2005年植酸酶的全球市場值已超過了1億美元。

其規(guī)?；苽浼皯?yīng)用需要解決的主要問題是：

酶的熱穩(wěn)定性有待提高酶的發(fā)酵水平需要進(jìn)一步提高產(chǎn)品劑型工藝需要優(yōu)化第一百二十四頁第一百二十五頁，共175頁。應(yīng)用前景及經(jīng)濟(jì)效益依照我國2005年配合飼料總產(chǎn)8000萬噸計(jì)算，植酸酶需求量0.8萬噸；直接經(jīng)濟(jì)效益超過2億元人民幣。預(yù)計(jì)到2010~2020年,我國配合飼料的需求量將分別達(dá)到1.5~1.7億噸，植酸酶帶來的綜合經(jīng)濟(jì)效益將達(dá)到27~30億元/年第一百二十五頁第一百二十六頁，共175頁。200520102020

植酸酶經(jīng)濟(jì)效益

01530億元第一百二十六頁第一百二十七頁，共175頁。

植酸酶

能水解植酸(肌醇六磷酸)生成肌醇和磷酸鹽，可提高飼料的利用率；食品工業(yè)中可改善人對(duì)鐵和鋅的吸收

缺點(diǎn)：

熱穩(wěn)定性差，易失活

枯草芽孢桿菌植酸酶PhyC第一百二十七頁第一百二十八頁，共175頁。植酸酶的用途

增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)食物中磷的利用率；降低動(dòng)物糞便中磷的含量，降低環(huán)境污染；促進(jìn)動(dòng)物對(duì)鈣的吸收，增加體內(nèi)血色素的濃度，增強(qiáng)動(dòng)物體對(duì)氨基酸的吸收。第一百二十八頁第一百二十九頁，共175頁。酵母生產(chǎn)植酸酶

PhyC44kDa116664535kDa

123456第一百二十九頁第一百三十頁，共175頁。pH性質(zhì)更為優(yōu)越的突變體第一百三十頁第一百三十一頁，共175頁?？垢邼舛任傅鞍酌傅耐蛔凅w

0100200300400500600pH2.0pH2.3pH2.8pH3.8pH4.6pH5.5釋放無機(jī)磷

P(mg/kg)A.nigerY-1Y-4MU-5E.coli各種來源的植酸酶在不同pH人工胃液中降解豆粕植酸磷的情況第一百三十一頁第一百三十二頁，共175頁。

植酸酶制劑工藝研究

四種新工藝：以噴霧干燥為主的粉劑生產(chǎn)工藝；以制粒，拋丸，干燥為主的顆粒生產(chǎn)工藝；以包衣為主的包衣生產(chǎn)工藝；以微濾，防腐，防沉為主的液體酶生產(chǎn)工藝。第一百三十二頁第一百三十三頁，共175頁。包衣工藝改善植酸酶耐熱性薄層防潮技術(shù)，微丸隔熱技術(shù)和蛋白穩(wěn)定技術(shù)形成耐熱穩(wěn)定包衣型產(chǎn)品。第一百三十三頁第一百三十四頁，共175頁。包衣工藝改善植酸酶耐熱性不同品牌產(chǎn)品制粒后在飼料中的酶活殘留對(duì)比第一百三十四頁第一百三十五頁，共175頁。11.6.2酶作為催化劑的應(yīng)用（1）酶作為基礎(chǔ)化工催化劑氰水合酶水解丙烯腈制備丙烯酰胺（聚合物單體）。

丙烯腈是一種無色的有辛辣氣味液體，屬大眾基本有機(jī)化工產(chǎn)品，是三大合成材料——合成纖維、合成橡膠、塑料的基本且重要的原料，在有機(jī)合成工業(yè)和人民經(jīng)濟(jì)生活中用途廣泛。第一百三十五頁第一百三十六頁，共175頁。

氰水解酶2-甲基戊二氰1,5-二甲基-2-哌啶酮順式二醇前列腺素CNCNCOONH4CN氰水解酶雙加氧酶酶第一百三十六頁第一百三十七頁，共175頁。（2）酶作為精細(xì)化工催化劑用于含手性分子的合成中，包括對(duì)映異構(gòu)純氨基、羥基酸、醇、胺類的合成。COOH?；窸NHRCOOHRNH2ONHCOOHR+D/L酰化氨基酸L-氨基酸D-?；被?/p>

第一百三十七頁第一百三十八頁，共175頁。酶催化動(dòng)力學(xué)拆分e.g.環(huán)氧化物水解環(huán)氧水解酶+OOHOHO第一百三十八頁第一百三十九頁，共175頁。

α-淀粉酶:水解淀粉，在啤酒和面包制作上，產(chǎn)物是麥芽糖、葡萄糖。葡萄糖淀粉酶：將玉米轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，生產(chǎn)高果糖漿。蛋白酶：切斷肽鏈，嫩肉粉用于肉的軟化。（3）酶作為食品工業(yè)催化劑第一百三十九頁第一百四十頁，共175頁。高果糖漿葡萄糖在葡萄糖異構(gòu)酶的催化作用下，就形成了果糖。高果糖漿的甜度可作為甜味劑的重要指標(biāo)之一。高果糖漿被廣泛用作飲料、果凍、糖果、冰激凌和調(diào)味食品的甜味劑，亦可代替蜂蜜用于制藥工業(yè)，或用于化工上生產(chǎn)甘露醇等。第一百四十頁第一百四十一頁，共175頁。

果聚糖化妝品食品紡織業(yè)代替脂肪生物學(xué)功能…….保濕醫(yī)學(xué)藥學(xué)抗癌抗炎癥益生素降膽固醇甜味劑表面修復(fù)劑增稠劑抗炎抵抗逆境齲齒葉斑病果聚糖的應(yīng)用及生物學(xué)功能第一百四十一頁第一百四十二頁，共175頁。人體攝入果聚糖后不增加血糖水平，而且能降低血清膽固醇和甘油三酯含量，是糖尿病、高血壓患者和減肥用的良好食品和甜味劑。果聚糖具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。人類消化道沒有能降解果聚糖的酶，因此在食品工業(yè)中果聚糖可以作為低熱量食品添加劑，高聚果糖也可以代替脂肪，用于制備營養(yǎng)食品。第一百四十二頁第一百四十三頁，共175頁。果聚糖保濕作用

其保濕效果等同于化妝品中常用的透明質(zhì)酸；果聚糖還可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，抗外界對(duì)皮膚刺激引起的炎癥反應(yīng)，這些都表明果聚糖在藥用及化妝品方面具有的潛在應(yīng)用價(jià)值。第一百四十三頁第一百四十四頁，共175頁。果聚糖蔗糖酶又稱果糖基轉(zhuǎn)移酶，具有蔗糖水解活性和果糖基轉(zhuǎn)移酶活性，水解蔗糖生成β-果聚糖。第一百四十四頁第一百四十五頁，共175頁。細(xì)菌果聚糖蔗糖酶：

G+細(xì)菌果聚糖蔗糖酶合成大分子量的果聚糖

G-細(xì)菌果聚糖蔗糖酶合成小分子量的果聚糖

生長和培養(yǎng)條件：高溫合成小分子量果聚糖，低溫合成大分子量果聚糖。

制備方法：固定化重組酶或重組菌合成較小分子量的果聚糖，天然酶合成大分子量的果聚糖。影響細(xì)菌果聚糖聚合度的主要因素第一百四十五頁第一百四十六頁，共175頁。（4）酶用于催化農(nóng)作物保護(hù)化學(xué)品的合成

除草劑生產(chǎn)中，利用單加氧酶和還原酶將苯氧基丙酸轉(zhuǎn)化為4-羥基苯氧基丙酸。+O2加氧酶、還原酶第一百四十六頁第一百四十七頁，共175頁。（5）生物催化在制藥中的應(yīng)用生物催化在制藥中的應(yīng)用能大規(guī)模生產(chǎn)，降低成本，減少污染?？捎糜诳垢腥舅幬?、抗膽固醇藥物、抗艾滋病藥物及高血壓治療藥物的合成制備。內(nèi)酰胺水解酶和青霉素?；傅膽?yīng)用p197第一百四十七頁第一百四十八頁，共175頁。11.6.3非傳統(tǒng)介質(zhì)中生物催化介質(zhì)H2O有機(jī)溶劑

很多親水性溶劑不是很好的酶促介質(zhì)，如甲醇；疏水性的有機(jī)介質(zhì)也可作為合適的酶促介質(zhì)，如環(huán)己烷；第一百四十八頁第一百四十九頁，共175頁。有機(jī)介質(zhì)的優(yōu)勢（1）有機(jī)介質(zhì)可增強(qiáng)反應(yīng)物溶解度，加快反應(yīng)速率；（2）改變化學(xué)反應(yīng)平衡，調(diào)節(jié)反應(yīng)結(jié)果；（3）有機(jī)介質(zhì)中催化產(chǎn)物易于分離提純，如蒸餾；（4）有機(jī)介質(zhì)可以提高酶的穩(wěn)定性；（5）有機(jī)介質(zhì)可以改變酶的選擇性，包括化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性、對(duì)映選擇性及底物專一性。第一百四十九頁第一百五十頁，共175頁。工業(yè)中有機(jī)介質(zhì)中酶使用的注意事項(xiàng)酶制備過程需要在合適的pH條件下凍干保證其活性；對(duì)酶保持其活性的水量進(jìn)行研究；通過實(shí)驗(yàn)提高酶在有機(jī)溶劑中的選擇性。第一百五十頁第一百五十一頁，共175頁。11.6.4生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與能源開發(fā)中的應(yīng)用生物質(zhì)能源

主要指農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)過程中除糧食、果實(shí)以外的秸稈、樹木等木質(zhì)纖維素（簡稱木質(zhì)素）、下腳料、農(nóng)林廢棄物及畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中的禽畜糞便和廢棄物等物質(zhì)。

特點(diǎn)：可再生性，低污染性，分布廣泛，儲(chǔ)量豐富。第一百五十一頁第一百五十二頁，共175頁。第一百五十二頁第一百五十三頁，共175頁。聚羥基脂肪酸脂（PHA,PHB）

近20多年迅速發(fā)展起來的生物高分子材料，很多微生物合成的一種細(xì)胞內(nèi)聚酯，是一種天然的高分子生物材料。

第一百五十三頁第一百五十四頁，共175頁。第一百五十四頁第一百五十五頁，共175頁。

生物催化的方法獲得，微生物可以利用廢棄物為原料催化合成PHA聚合物。第一百五十五頁第一百五十六頁，共175頁。特點(diǎn)生物相容性能；生物可降解性，可作為生物醫(yī)用材料和生物可降解包裝材料,其分解產(chǎn)物可全部為生物利用，對(duì)環(huán)境無任何污染；塑料的熱加工性能,其熔融溫度為175～180℃，是一種可完全分解的熱塑性塑料。

；具有良好的氣體阻隔性，使其可能應(yīng)用在較長時(shí)間的鮮品保鮮上。

第一百五十六頁第一百五十七頁，共175頁。聚-β-羥丁酸的應(yīng)用前景作為一種天然高分子聚合物，具有生物相容性、生物可降解性、無刺激性、無免疫原性和組織相容性等特殊性能，在組織工程、藥物緩釋控釋系統(tǒng)、骨科以及醫(yī)用手術(shù)縫合線領(lǐng)域獲得成功的應(yīng)用。

第一百五十七頁第一百五十八頁，共1