血紅蛋白的提取與分離

2003年4月14日美國科學家宣布人類基因組序列圖完成，這標志著進入了后基因組和蛋白質組時代。人類基因組：指人類DNA分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質組：生物個體表達的蛋白質分子的總和。主要是對蛋白質功能的研究。課題3血紅蛋白的提取和分離一、基礎知識閱讀P64頁第一段,思考以下問題:1、分離生物大分子的基本思路是什么2、蛋白質分離和提取的原理是什么？選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。根據蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度和吸附的性質和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質。（一）凝膠色譜法閱讀教材“凝膠色譜法”，思考以下問題：1、什么是凝膠色譜法？2、凝膠色譜法分離蛋白質的依據是什么？3、在凝膠色譜法分離蛋白質過程中所用的凝膠有什么特點？4、凝膠色譜法的原理是什么？5、簡述凝膠色譜法分離蛋白質的過程。1、什么是凝膠色譜法？根據被分離物質（如蛋白質）的相對分子質量的大小，利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，來對物質進行分離的方法。2、凝膠色譜法分離蛋白質的依據是什么？蛋白質分子量的大小不同，在凝膠中的移動速度不同。3、在凝膠色譜法分離蛋白質過程中所用的凝膠有什么特點？①是一些微小的多孔球體；②是由葡聚糖或瓊脂糖等多糖類化合物構成的。4、凝膠色譜法的原理是什么？分子篩效應①當不同的蛋白質通過凝膠時，分子量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢。②分子量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。5、簡述凝膠色譜法分離蛋白質的過程。（二）緩沖溶液閱讀教材‘緩沖溶液“，思考以下問題：1、緩沖溶液的作用是什么？2、如何配制緩沖溶液？3、如何維持緩沖溶液的PH值保持相對穩(wěn)定？1、緩沖溶液的作用是什么？緩沖溶液能夠在一定范圍內，抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH值的相對穩(wěn)定。2、如何配制緩沖溶液？通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內使用的緩沖液。3、如何維持緩沖溶液的PH值保持相對穩(wěn)定？緩沖溶液的PH由不同的緩沖對來調節(jié)。緩沖對都是由一種弱酸和這種弱酸的強堿鹽組成

H2CO3NaHCO3

CH3COOHCH3COONa

NaH2PO4Na2HPO4

KH2PO4K2HPO4現以碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)為例，說明緩沖系統(tǒng)在酸堿平衡調節(jié)中的作用。HClNaHCO3→NaClH2CO3鹽酸是一種強酸，當其進入血液后首先與緩沖系統(tǒng)中的堿發(fā)生反應，生成氯化鈉和碳酸，從而將強酸轉變成弱酸，進而通過肺將碳酸排出，血液pH不會發(fā)生明顯變化。NaOHH2CO3→H2ONaHCO3氫氧化鈉是一種強堿，當其入血液后與緩沖系統(tǒng)中的弱酸發(fā)生反應，生成水和碳酸氫鈉，從而將強堿轉化成弱堿，再經腎排出。這說明當體液中酸性或堿性物質的含量發(fā)生改變時，緩沖系統(tǒng)通過接受H或釋放H，減輕體液pH變動的程度。三電泳閱讀教材”電泳”,思考以下問題:1、什么是電泳2、電泳的原理是什么？3、常用的電泳方法有哪幾種？4、用聚丙烯酰胺凝膠電泳法如何測定蛋白質的分子量？1、什么是電泳帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2、電泳的原理是什么？①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。3、常用的電泳方法有哪幾種？瓊脂糖凝膠電泳聚丙稀酰胺凝膠電泳4、用聚丙烯酰胺凝膠電泳法如何測定蛋白質的分子量？①獲得聚丙稀酰胺凝膠：由單體丙烯酰胺和交聯劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠（交聯的丙稀酰胺聚合體）。②原理：蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。③消除靜電荷對遷移率的影響：在凝膠中加入十二烷基磺酸鈉（SDS）可消除靜電荷對遷移率的影響。SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。④測定蛋白質的分子量：使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數作標準曲線，可以測定未知蛋白質的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。二、實驗操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定（一）蛋白質提取和分離步驟（二）操作過程1、樣品處理：1血液組成血液血漿水分固體物質血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個a－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團（2）血紅蛋白的作用血紅蛋白的每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。③選材本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。（2）紅細胞的洗滌：閱讀教材“紅細胞的洗滌”，思考以下問題：①人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？②洗滌紅細胞的目的是什么？③如何洗滌紅細胞？②洗滌紅細胞的目的是什么？除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。不可洗滌次數過少。①人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。③如何洗滌紅細胞？A、采集血樣B、低速短時間離心（速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果）C、吸取血漿：上層透明的黃色血漿D、鹽水洗滌：用五倍體積的質量分數為09％的氯化鈉溶液洗滌E、低速離心（低速短時間）F、重復D、E步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈（3）血紅蛋白的釋放加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。4分離血紅蛋白溶液①過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min。第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）②試管中溶液層次③分離用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。5透析①過程取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為70），透析12小時。②透析目的除去樣品中分子量較小的雜質。2、凝膠色譜操作：（1）凝膠色譜柱的制作①取長40厘米，內徑16厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作打孔安裝玻璃管④組裝將上述三者按相應位置組裝成一個整體⑤安裝其他附屬結構（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇A、材料“G”表示凝膠的交聯程度，膨脹程度及分離范圍。B、代表意義：交聯葡聚糖凝膠（G-75）75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水75克。配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。②凝膠的前處理③凝膠色譜柱的裝填方法A、固定B、裝填將色譜柱垂直固定在支架上。將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：2、裝填凝膠柱時不得氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。注意：2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為70）充分洗滌平衡12小時。④洗滌平衡（3）樣品加入與洗脫①調節(jié)緩沖液面②滴加透析樣品吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊關閉出口。③樣品滲入凝膠床④洗脫加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。小心加入mol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml一試管，連續(xù)收集（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）。討論：答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內，維持結構和功能。⑥注意：正確的加樣操作1、不要觸及破壞凝膠面2、貼壁加樣3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動1、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？2、與其他真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質的分離有什么意義？答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝