基因工程與藥物

基技學(xué)院嚴(yán)永敏

基因重組與基因工程概念基因重組（geneticrecombination）：指不同來(lái)源的DNA分子通過(guò)重新組合（插入、缺失、置換等）形成新的重組DNA分子的過(guò)程。自然界的基因重組一、轉(zhuǎn)化作用概念：受體細(xì)胞直接吸收來(lái)自供體細(xì)胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因組中，從而獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。

DNADNA片段新DNA重組攝取溶解轉(zhuǎn)導(dǎo)作用概念：以病毒為媒介發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。轉(zhuǎn)位：概念：基因從基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置。進(jìn)展1973年，CohenGroup第一次實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移terr+nersr→terrner，導(dǎo)致基因工程技術(shù)誕生至今，人類已經(jīng)擁有了克隆羊、豬等等的技術(shù)，可以復(fù)制一個(gè)生命體。（克隆羊多利1997－2003，體細(xì)胞克隆，胚胎細(xì)胞克?。┢渌珉s交水稻，基因工程藥物等PscloltetrRb-3nersrtetrnertetr

nerOtetrne圖8-1CohenGroup第一次實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀轉(zhuǎn)移示意圖第一節(jié)概述第二節(jié)基因工程相關(guān)的酶學(xué)第三節(jié)基因工程的載體（vector）第四節(jié)目的基因制備和常用分離方法第五節(jié)載體DNA和目的基因的連接第六節(jié)重組DNA分子引入受體細(xì)胞第七節(jié)重組體的鑒定與分析第八節(jié)克隆基因的表達(dá)基因工程（geneticengineering）：

在體外應(yīng)用人工方法進(jìn)行基因重組，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞去復(fù)制、擴(kuò)增或表達(dá)的過(guò)程。因?yàn)橥ㄟ^(guò)人工設(shè)計(jì),得到一定的設(shè)計(jì)方案，故稱為基因工程。

分子克隆（molecularcloning）:

指按照人的意愿，在體外將制備的DNA片段與載體重組，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以獲得該DNA分子的大量拷貝或表達(dá)產(chǎn)物。

分切連轉(zhuǎn)

篩基因工程步驟基因工程基因工程技術(shù)的應(yīng)用(P307)一、生產(chǎn)（基因工程）產(chǎn)品：1.構(gòu)建基因組文庫(kù)，cDNA文庫(kù)，核酸探針等2.生產(chǎn)基因的(用于醫(yī)藥目的)的一級(jí)產(chǎn)品，即蛋白質(zhì)、多肽；二級(jí)產(chǎn)品，如維生素、多糖、氨基酸(因?yàn)樗鼈冇擅复呋a(chǎn)生）3.生產(chǎn)基因疫苗、如:乙肝疫苗.二、改良生物的性狀如將固氮基因引入水稻,就可以不用施氮肥了

基因治療三、分子診斷

在分子克隆技術(shù)中，對(duì)DNA進(jìn)行切割、合成、補(bǔ)平、連接和修飾等工具酶是必不可少的。常用的工具酶主要有：

限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶Ⅰ、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA連接酶、堿性磷酸酶、多核苷酸激酶和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，甲基化酶等。重要的工具酶（toolenzyme)

一、限制性核酸內(nèi)切酶

（restrictionendonuclease，RE）

簡(jiǎn)稱限制酶，是一類能識(shí)別和切割特定DNA序列的核酸內(nèi)切酶，為原核生物所特有。分為三型。其中Ⅱ型被稱為基因工程的分子剪刀，是分子克隆技術(shù)中最重要的工具酶。作用ⅠⅡⅢ

三種限制性核酸內(nèi)切酶的作用(P309)

酶活性

核酸內(nèi)切酶

核酸內(nèi)切酶

核酸內(nèi)切酶

甲基化酶甲基化酶

ATP酶

DNA解旋酶DNA鏈上的無(wú)

有

有特異識(shí)別位點(diǎn)DNA鏈上的無(wú)

在識(shí)別序列內(nèi)

在識(shí)別序列外特異切割位點(diǎn)在分子克隆中無(wú)

有

無(wú)的重要意義（一）限制酶的命名與分類EcoR

I產(chǎn)生該酶的宿主菌屬名微生物的種名

宿主菌的株或型同一菌株中不同限制酶的編號(hào)（按發(fā)現(xiàn)先后順序）

大腸桿菌Escherichia屬、coli種、RY13株中分離到幾種限制酶，分別表示為:

EcoR

I

、EcoR

Ⅱ、EcoR

Ⅴ等。（二）Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的作用

根據(jù)需要在特定的位點(diǎn)上精確切割雙鏈DNA分子，產(chǎn)生特異末端的DNA片段。識(shí)別序列：雙鏈DNA特異的堿基對(duì)（一般4

6個(gè)），在識(shí)別序列內(nèi)特異切割DNA。斷裂磷酸二酯鍵

Ⅱ型限制酶的特異識(shí)別序列回文結(jié)構(gòu)（palindromestructure）：

指雙鏈DNA分子上按對(duì)稱軸排列的反向互補(bǔ)序列。5

——GAATTC——3

ATATGC5’3’EcoRⅠ識(shí)別序列：對(duì)稱軸3

——CTTAAG——5

粘性末端（cohesiveend）：指限制酶錯(cuò)位切開(kāi)兩條對(duì)稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的帶單鏈突出的末端。—GAATTC——CTTAAG—平末端（bluntend）：

指限制酶在對(duì)稱軸上同時(shí)切割互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ4同裂酶（isoschizomers）:來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一核苷酸序列的限制酶，也稱異源同工酶。

這些同工異源酶可以互相代用。如：BamHⅠ和BstⅠ（GGATCC）；

XhoⅠ和

PaeR7（CTCGAG）。

如：BamHⅠ（G

GATCC）和Sau3AⅠ（N

GATCN）。

同尾酶（isocaudamers）:

來(lái)源，識(shí)別序列，且切割方式均不同，但可產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。

產(chǎn)生的DNA片段可借粘性末端相互連接，在DNA重組時(shí)具有更大的靈活性。“分子剪刀”的應(yīng)用

根據(jù)特異識(shí)別序列切割DNA片段

用于基因組計(jì)劃研究（如物理圖譜)，基因組文庫(kù)，DNA序列分析,DNA分子雜交，制備探針）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphysm，RFLP）研究，用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和遺傳性疾病的診斷等－DNA指紋分析人類兩個(gè)個(gè)體的基因組DNA中平均有1000萬(wàn)處不同，多位于非編碼序列中。堿基的變異可能導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或新的切點(diǎn)出現(xiàn)，當(dāng)使用同一限制酶切割不同個(gè)體基因組DNA時(shí)，DNA片段長(zhǎng)度出現(xiàn)差異，這種由于內(nèi)切酶切點(diǎn)變化所導(dǎo)致的DNA片段長(zhǎng)度的差異，稱為RFLP。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)GAATTC

CTTAAGGATTTC

CTAAAG1212III2kb3kb5kb7kb個(gè)體識(shí)別

RFLP反映了常見(jiàn)的個(gè)體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德?tīng)柗绞竭z傳。

RFLP在遺傳病檢測(cè)中的應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血癥（globin，6），其GAGGTG的突變（MstII，CCTNAGG）一、限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease，簡(jiǎn)稱限制酶），分為三型。其中Ⅱ型被稱為基因工程的分子手術(shù)刀，是分子克隆技術(shù)中最重要的工具酶。甲基化限制酶作用ⅠⅡⅢ三種限制性核酸內(nèi)切酶的作用

酶活性

核酸內(nèi)切酶

核酸內(nèi)切酶

核酸內(nèi)切酶

甲基化酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶DNA鏈上的無(wú)

有

有特異識(shí)別位點(diǎn)DNA鏈上的無(wú)

在識(shí)別序列內(nèi)

在識(shí)別序列外特異切割位點(diǎn)在分子克隆中無(wú)

有

無(wú)的重要意義（二）Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的作用限制酶功能：根據(jù)需要在特定的位點(diǎn)上

精確切割雙鏈DNA分子。Ⅱ型限制酶能識(shí)別雙鏈DNA特異的4

6個(gè)堿基對(duì)，并在此序列內(nèi)特異切割DNA?；匚慕Y(jié)構(gòu)（palindromestructure）：

指雙鏈DNA分子上按對(duì)稱軸排列的反向互補(bǔ)序列（常為限制酶所識(shí)別）。5

——GAATTC——3

ATATGC5’3’EcoRⅠ識(shí)別序列：對(duì)稱軸3

——CTTAAG——5

粘性末端（stickyend）：指限制酶錯(cuò)位切開(kāi)兩條對(duì)稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端?！狦AATTC——CTTAAG—平末端（bluntend）：

指限制酶平齊切開(kāi)兩條對(duì)稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ圖4-1回文結(jié)構(gòu)和限制性核酸內(nèi)切酶作用模式圖二、DNA連接酶

基因工程的縫紉針主要功能:催化兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5

磷酸基團(tuán)與3

羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)DNA體外重組。包括大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶。圖4-4DNA連接酶作用模式圖

大腸桿菌DNA連接酶只能連接粘性末端，而T4DNA連接酶既能連接粘性末端，又能連接平末端。三、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為109kD，它具有3種酶活性：①5

→3

DNA聚合酶活性。②3

→5

核酸外切酶活性。③5

→3

核酸外切酶活性。Klenow片段的主要用途：

①補(bǔ)齊雙鏈DNA的3

末端，同時(shí)可使3

末端DNA標(biāo)記同位素。②cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。圖4-2DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段5

→3

外切酶5

→3

聚合酶3

→5

外切酶DNA聚合酶Ⅰ(103kD)Klenow片段NC

5

→3

聚合酶3

→5

外切酶(68kD)35kD(小)68kD(大)CN枯草桿菌蛋白酶（二）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶（簡(jiǎn)稱Taq酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有5

→3

聚合酶活性和依賴于聚合作用的5

→3

外切酶活性。TaqDNA聚合酶可用于DNA測(cè)序及通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。

①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（RDDP）。②核糖核酸酶H活性（RNaseH）。③DNA聚合酶活性（DDDP）。逆轉(zhuǎn)錄酶的作用：（三）逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過(guò)程稱為逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。

5

3

3

5

RNA(用表示)RNA-DNA雜化分子3

5

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4種dNTPRDDP（逆轉(zhuǎn)錄酶）引物、4種dNTP病毒雙鏈DNA用表示）（cDNA第二鏈(complementaryDNA，cDNA)與病毒RNA互補(bǔ)的DNA(用表示)5

3

3

5

5

3

5

3

圖4-3逆轉(zhuǎn)錄酶的作用

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶）分子量為60Kd，在二價(jià)陽(yáng)離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3

末端-OH上。四、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶的功能主要有：①在載體或目的基因3

末端加上互補(bǔ)的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。②用于DNA3

末端的同位素探針標(biāo)記。(A、G、C、T)nOH5′3′5′3′OH5′3′5′3′(A、G、C、T)nMg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5′3′OH5′3′OH

5′3′5′3′(A、G、C、T)nCo2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是單鏈DNA或有3

突出末端的雙鏈DNA，需要Mg2+。（2）底物是平端或3

凹端的雙鏈DNA，需要Co2+。(A、G、C、T)n五、堿性磷酸酶

堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5

-磷酸基團(tuán)。主要用途有：除去DNA片段上的5

磷酸以防自身連接。

5

-pCpGpC┅┅-OH3

堿性磷酸酶5

-CpGpC┅┅-OH3

5

-p3

-HO5

-HO3

-HO第二節(jié)載體

指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA。制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進(jìn)入受體細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。載體包括克隆載體和表達(dá)載體。載體（vector）:①能自我復(fù)制并具較高的拷貝數(shù)。分子量一般<10Kb。②帶有遺傳篩選標(biāo)記。③有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，便于外源基因的插入和篩選。

載體上具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)（即在載體的其它部位無(wú)這些酶的相同切點(diǎn)）稱為多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites，MCS）。載體應(yīng)具備的特征：多克隆位點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)抗藥基因抗藥基因質(zhì)粒(plasmid)載體

噬菌體(phage)載體

真核病毒(virus）載體

按來(lái)源分：PBR322；pUC系列；pGEM系列；M13mp系列；噬菌體載體；柯斯質(zhì)粒（粘粒）；SV40載體；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；腺病毒載體；

克隆載體(cloningvector)：

用于克隆和擴(kuò)增某一DNA序列，為研究提供材料或建立基因庫(kù)。表達(dá)載體(expressionvector)：附加表達(dá)構(gòu)件——參與轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的調(diào)控序列，用于表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。穿梭載體(shuttervector)：既能在原核細(xì)胞中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)的載體。按功能分：一、克隆載體（一）質(zhì)粒載體

質(zhì)粒（plasmid）是指細(xì)菌染色體以外的小分子環(huán)狀雙鏈DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。

分為“緊密型”和“松弛型”質(zhì)粒與宿主細(xì)胞的關(guān)系（1）質(zhì)粒對(duì)宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主細(xì)胞中（2）質(zhì)粒離開(kāi)宿主就無(wú)法生存，必須依賴宿主細(xì)胞的（３）質(zhì)粒賦于宿主各種有利的表型（質(zhì)粒編碼蛋白質(zhì)或酶），使宿主獲得生存優(yōu)勢(shì)，與我們基因工程實(shí)驗(yàn)緊密相關(guān)的，如抗生素抗性基因：Ampr酶，水解β-內(nèi)酰胺環(huán),解除氨芐毒性,使細(xì)菌抗氨芐。Tetr膜蛋白,可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞,使細(xì)菌抗四環(huán)素。①

用于保存和擴(kuò)增<2Kb目的DNA。②

構(gòu)建cDNA文庫(kù)。③目的DNA的測(cè)序。④作為核酸雜交時(shí)的探針來(lái)源。質(zhì)粒克隆載體的主要用途：Super-coiledformRelaxedcircleLinearized

form質(zhì)粒的理化性質(zhì)具有核酸分子的一般理化特性：

可嵌入某些染料（溴化乙錠）具有較強(qiáng)的抗切割和抗變性的能力質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)GFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞復(fù)制起始點(diǎn)抗藥基因抗藥基因圖4-5pBR322質(zhì)粒的物理圖譜1.pBR322質(zhì)粒載體圖4-6pUC質(zhì)粒物理圖譜

2.pUC18、pUC19質(zhì)粒載體pUC18和pUC19質(zhì)粒長(zhǎng)約2.69Kb，除多克隆位點(diǎn)互為相反方向排列外，其它序列均相同。pUC質(zhì)粒含Ampr，可供菌落篩選。半乳糖苷酶的藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)：lacZ

基因

-半乳糖苷酶氨基端+缺陷型

-半乳糖苷酶IPTG

-半乳糖苷酶

-互補(bǔ)藍(lán)色菌落X-gal（二）噬菌體載體噬菌體（bacteriophage，phage）：

指感染細(xì)菌的病毒。（三）動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體已構(gòu)建并經(jīng)常使用的動(dòng)物病毒克隆載體有：猿猴空泡病毒40（simianvacuolatingvirus40，SV40）載體、腺病毒（adenovirus）載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）載體等，它們都有各自的特點(diǎn)和應(yīng)用范圍。原核細(xì)胞的表達(dá)載體主要是大腸桿菌表達(dá)載體。大腸桿菌表達(dá)載體是在克隆載體的基礎(chǔ)上導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控元件：?jiǎn)?dòng)子—核糖體結(jié)合位點(diǎn)—克隆位點(diǎn)—轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。（一）原核細(xì)胞表達(dá)載體二、表達(dá)載體5

—TTGACA——TATAAT———//——3

-35區(qū)-10區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)PribnowboxDNA

如乳糖啟動(dòng)子（Lac）、色氨酸啟動(dòng)子（Trp）、Tac啟動(dòng)子（Trp-Lac）以及PL和PR啟動(dòng)子等。原核細(xì)胞啟動(dòng)子示意圖1.啟動(dòng)子（promoter）：mRNA核蛋白體小亞基上的16SrRNA2.SD序列SD-序列示意圖

一個(gè)基因的3

末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識(shí)別并停止轉(zhuǎn)錄的功能，此序列稱為終止子。該序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)狀局部二級(jí)結(jié)構(gòu)。3.終止子：-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCTTTTTTNNN-DNA-NNTTCGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN-G/C富含區(qū)2G/C富含區(qū)1A/T富含區(qū)5

3

5

3

RNA-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH5

3

RNA結(jié)構(gòu)5

GC

NNNNCCGCGCGGCGCAUAU—NNNNUUUU-OH

3

DNA轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)終止子模式圖轉(zhuǎn)錄圖4-8pKK223-3質(zhì)粒載體的物理圖譜

（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體真核表達(dá)載體的真核表達(dá)元件有：?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子—克隆位點(diǎn)—終止位點(diǎn)和加polyA信號(hào)。1．原核DNA序列包括能在大腸桿菌中自身復(fù)制的復(fù)制子和抗藥基因的篩選標(biāo)記。2．啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25~30bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游約100~200bp處為上游啟動(dòng)子元件。3．增強(qiáng)子（enhancer）是一類顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件。4．終止子和加polyA信號(hào)。

第三節(jié)分子克隆的基本步驟一、目的基因的獲取二、載體的選擇三、目的基因和載體酶切與連接四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞五、重組體的篩選和鑒定連接含重組子的陽(yáng)性克隆載體+目的基因轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定陽(yáng)性克隆DNA重組體+受體細(xì)胞分切連轉(zhuǎn)篩基因工程步驟分--分離目的基因DNA和載體DNA從組織或器官中提取并分離出某基因DNA或cDNA目的基因DNA質(zhì)粒染色體基因克隆用細(xì)菌提取載體質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外雙鏈環(huán)狀DNA，是基因工程最常用的載體之一。目的基因可以來(lái)源于動(dòng)植物的組織、培養(yǎng)的細(xì)胞或者PCR產(chǎn)物切--對(duì)目的基因DNA和載體DNA進(jìn)行酶切修飾目的DNA限制性核酸內(nèi)切酶質(zhì)粒DNA基因克隆的載體粘性末端平末端DNA經(jīng)過(guò)酶切后產(chǎn)生兩種形式的末端酶切后的質(zhì)粒示意圖酶切后的質(zhì)粒DNA簡(jiǎn)單表示為重組質(zhì)粒同種限制酶切除目的基因和載體，產(chǎn)生相互對(duì)應(yīng)的粘性末端，退火后以連接酶共價(jià)互補(bǔ)連接。連--目的基因連接到載體上，DNA連接酶連接切口。轉(zhuǎn)--即轉(zhuǎn)化。以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化(transformation）。重組質(zhì)粒細(xì)菌(CaCl2處理）細(xì)菌(CaCl2處理）質(zhì)粒導(dǎo)入未成功質(zhì)粒導(dǎo)入成功質(zhì)粒導(dǎo)入不成功細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞稱謂感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。篩--即篩選。篩選含有質(zhì)粒的細(xì)菌和含有正確重組DNA的細(xì)菌克隆含重組質(zhì)粒的細(xì)菌不含質(zhì)粒的細(xì)菌含有抗生素的培養(yǎng)基由于質(zhì)粒本身能夠編碼產(chǎn)生分解抗生素的酶，因此，凡是轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌就能夠在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。含質(zhì)粒的細(xì)菌（自身環(huán)化）含有質(zhì)粒者才能生存一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸?kù)中獲取（二）逆轉(zhuǎn)錄法（三）人工合成DNA片段（四）直接從染色體DNA中分離目的基因（一）從基因文庫(kù)中獲取

目的基因：

指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表達(dá)的基因。

基因組文庫(kù)（genomiclibrary，G-文庫(kù)）是指含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群。

cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）：以細(xì)胞全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，制備出全套cDNA建庫(kù)。構(gòu)建G文庫(kù)篩選目的基因一、分離基因組DNA二、載體的選擇（一般為

噬菌體）三、將基因組DNA片段連接入載體四、將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞

組織細(xì)胞

破碎細(xì)胞，除去DNA與蛋白質(zhì)提取總RNA

Oligo(dT)纖維素親和層析制備mRNA

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈合成cDNA第二鏈合成cDNA雙鏈

插入載體重組DNA

導(dǎo)入大腸桿菌擴(kuò)增構(gòu)建cDNA文庫(kù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)篩選目的基因（二）逆轉(zhuǎn)錄PCR法。

選用富含目的基因mRNA的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，有利于分離到目的基因。如胰島素基因的mRNA主要存在于胰腺組織，血紅蛋白基因的mRNA占網(wǎng)質(zhì)紅細(xì)胞總mRNA的50%~90%。PCR

特點(diǎn)：短時(shí)間獲得大量DNA片段。（三）人工合成DNA片段

根據(jù)已知某種基因的核苷酸序列，再用DNA合成儀人工合成目的基因,可分段合成。此法適用于合成分子量較小的目的基因（100bp以內(nèi)），如：人生長(zhǎng)激素釋放因子、血管加壓素、干擾素、胸腺素及胰島素原的基因等。（四）直接從染色體DNA中分離目的基因根據(jù)染色體DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割染色體DNA、分離目的基因。本方法較適用于制備原核生物目的基因，